儿童自身免疫甲状腺病细胞因子失衡与T细胞亚群失衡的关系
作者：董文斌 邓蕾丽
单位：泸州医学院附属医院儿科 泸州 646000
关键词：自身免疫甲状腺病；细胞因子；T细胞亚群
中国现代医学杂志000408 目的：探讨儿童自身免疫甲状腺病(AITD)细胞因子失衡与T细胞亚群失衡的关系。方法：采用E花环法和ELISA法同步分别检测初诊的AITD患儿和正常儿童外周血T细胞亚群和单个核细胞在丝裂原诱导下产生的IFN-γ、IL-4和IFN-γ/IL-4比值。结果：与正常组相比，CLT和GD病儿IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值明显升高，IL-4水平明显降低，CD+3、CD+8明显降低，CD+4/CD+8比值明显升高。且CD+8与IL-4水平、CD+4/CD+8比值与IFN-γ/IL-4比值呈显著正相关(r分别为0.76/0.75，0.68/0.58，P<0.05)。结论：AITD患儿Th1类细胞因子升高可能主要是CD+4 Th1亚类的功能亢进所致，而Th2类细胞因子的降低可能主要是CD+8 Th2亚类数量和功能降低所致。
, 百拇医药
分类号 R581
THE RELATIONSHIP BETWEEN THE T CELL SUBSETS
IMBALANCE AND THE CELL FACTOR IMBALANCE OF
INFANTILE ANTOIMMUNITY THYROPATHY
Dong Wenbin Deng Leili
(Department of Pediatrics, Attached Hospital, Luzhou Medical College, Luzhou 646000)
Objective: To explore the relationship between the imbalance of cytokinesis and T cell subsets in children with autoimmune thyroid disease. Methods: IFN-γ, IL-4 and the ratio of IFN-γ/IL-4 released from stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and their relationship with T cell subsets were investigated in 22 children with Hashimoto’s thyroiditis (HT), 24 children with Graves’disease (GD) at presentation. Results: Compared with normal subjects, IFN-γ, the ratio of IFN-γ/IL-4 were significantly increased whereas IL-4 significantly decreased in children with HT and GD at presentation. The percentage of CD+3, CD+8 T cells in peripheral blood were lower but the ratio of CD+4/CD+8 was higher in children with HT and GD at presentation than those in normal controls. The ratio of CD+4/CD+8, the percentage of CD+8 T were positively correlated with ratio of IFN-γ/IL-4 and IL-4 respectively. Conclusions: It is possible that the increased Th1 type cytokinesis be attributed to the enhanced function of Th1 type CD+4 cells while the decreased Th2 type cytokinesis be attributed to the declined number and function of Th2 type CD+8 cell.
, 百拇医药
Key words: Thyroid disease; Autoimmune (AITD); Cytokinesis; T cell subsets
自身免疫甲状腺病(Autoimmune Thyroid Disease,AITD),包括慢性淋巴细胞甲状腺炎(Chronic Lymphocytic Thyroiditis,CLT)和弥漫性毒性甲状腺肿(Graves' Disease,GD)。研究表明：在其发病过程中，存在着细胞因子和细胞亚群的异常[1，2]。现代免疫学将CD+4和CD+8T细胞产生的细胞因子分为Th1和Th2两类，前者包括IL-2、IFN-γ和TNF-β等，与细胞免疫有关；后者包括IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，与体液免疫有关[3]。在AITD的发病过程中，二者存在何种关系尚不清楚。为此，本研究采用花环法和ELISA法同步分别检测初诊的AITD患儿和正常儿童外周血T细胞亚群和单个核细胞在丝裂原诱导下产生的IFN-γ，IL-4和IFN-γ/IL-4比值，以探讨二者的关系。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
CLT组22例，其中男性3例，女性19例，年龄3～13岁(平均9.35岁)。GD组24例，其中男性4例，女性20例，年龄3～15岁(平均9.67岁)。同期儿保科健康查体儿童15例作为正常对照组。上述受试对象在抽血前1个月内无明显感染史，无血制品及免疫增强剂或免疫抑制剂等用药史。
1.2 实验方法和检测指标
1.2.1 PBMC的分离及培养 无菌抽取静脉血2 ml，用肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)，用密度梯度离心法分离单个核细胞(PBMC)，0.2%台盼蓝实验鉴定细胞活力在95%以上后，用含10%FCS的RPMI-1640液重悬细胞并将其浓度配成1×109/L，加入PHA(终浓度为100 μg/ml)和LPS(终浓度为2 μg/ml)作为刺激剂，在5%CO2，37 ℃条件下培养72 h(在24孔培养板孔中进行)，离心，无菌收集上清液，在-30 ℃保存，集中检测。
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1.2.2 外周血T细胞亚群的测定 E花环法[4]：肘静脉无菌抽取静脉血5ml，用肝素抗凝，用密度梯度离心法分离出淋巴细胞后，用含10%FCS的RPMI-1640液将细胞浓度调至5×109/L，取3支试管分别加入上述细胞悬液(25 μl/支)，再分别加入CD+3，CD+4和CD+8单抗致敏的细胞悬液(25 μl/支)，室温下放10 min后，以500 r/min离心3～5 min，置冰箱过夜，涂片，瑞氏染色，油镜下计数200个细胞，淋巴细胞周围吸附3个以上细胞者为阳性细胞，计数各亚群的百分率。
1.2.3 细胞因子的检测
(1)上清液IFN-γ水平检测采用ABC-ELISA法，严格按照说明书操作，在450型酶联仪(美国Bio-Rad产品)测得OD值后，根据标准浓度制定标准曲线，然后在标准曲线上查找相应的值，单位为ng/L。药盒系第二军医大学微生物学教研室产品。
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(2)上清液IL-4水平检测采用双抗体夹心ELISA法，药盒由深圳晶美生物工程公司(进口分装)提供，操作同上。
1.3 统计学方法
结果用均数±标准差表示，凡进入统计的指标均输入Primer软件，在计算机上统计，进行正态性检验和方差齐性检验，组间用t检验进行比较。各指标间的关系用直线相关分析进行处理，求出r值和P值。
2 结果
2.1 初诊疾病组IFN-γ/IL-4水平的检测结果
表1 初诊病儿与正常儿童细胞因子的比较 (
±s) 分组
例数
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IFN-γ(ng/L)
IL-4(ng/L)
IFN-γ/IL-4
CLT组
22
2139.95±648.001)
216.39±53.671)
10.51±4.092)
GD组
24
2626.60±1270.171)
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238.26±64.531)
11.89±5.601)
正常组
15
1292.41±637.25
352.65±123.16
5.52±3.71
注：1)与正常组相比P<0.01
2)与正常组相比P<0.02
由表1可以看出CLT和GD病儿PBMC产生IFN-γ水平和IFN-γ/IL比值较正常组明显升高，而IL-4水平明显降低。
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2.2 细胞因子水平失衡与外周血T细胞亚群失衡的关系
表2 初诊的病儿与正常儿童T细胞亚群的比较 (±s) 分组
例数
CD+3(%)
CD+4(%)
CD+8(%)
CD+4/CD+8
CLT组
, 百拇医药
22
43.64±5.87
33.64±3.55
18.45±3.89
1.87±0.27
GD组
24
44.10±2.84
33.80±3.09
17.80±2.27
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1.92±0.23
正常组
15
58.67±10.23
39.56±7.04
26.74±5.96
1.40±0.29
注：与正常组相比P<0.05
由表2可见，与正常组相比，CLT和GD病儿CD+3和CD+8明显降低，CD+4/CD+8比值明显升高，且CD+8与IL-4水平、CD+4/CD+8比值与IFN-γ/IL-4比值呈显著正相关(r分别为0.76/0.75，0.68/0.58，P<0.05)。
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3 讨论
现代免疫学认为CD4+和CD8+ T细胞根据产生细胞因子不同分为Th1和Th2亚类,前者生成IL-2、IFN-γ、TNF-β和IL-12等,与细胞免疫有关;后者生成IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等,与体液免疫有关。正常情况下,体内Th1和Th2类细胞因子水平是CD+4和CD+8 T细胞不同亚类功能的综合体现,两类因子相互调控,形成网络,其中IL-12、IFN-γ诱导CD+4和CD+8T细胞向Th1亚类转化,而IL-4和IL-10则诱导其向Th2亚类转化,使细胞因子水平处于动态平衡,共同维持机体正常的免疫反应。一旦由于某些因素使这种平衡打破，出现Th1类/Th2类因子失衡,将导致机体免疫病理损害[3，5，6]。
, 百拇医药
Romagnai S等[6]认为在AITD，浸润至甲状腺的CD+4细胞，在PHA刺激下可以产生IFN-γ，但不能产生IL-4；Watson PF等[7]进一步检测到GD甲状腺局部淋巴细胞存在IL-2、IFN-γ和TFNα的mRNA表达，而缺乏IL-4mRNA的表达：Zipris D等[1，8]在DR-BB鼠自发形成甲状腺炎过程中，IFN-γ、IL-12P40mRNA表达增强，且与疾病进展密切相关，而IL-4mRNA表达很弱，甚至检测不到。研究还表明[2，9]：AITD病儿存在外周血T细胞亚群的失衡，表现为：CD+4/CD+8T比值增大，CD+8 T百分含量降低，且CD+8 T细胞可以抑制甲状腺微粒体抗原诱导CD+4细胞产生IFN-γ[10，11]。本研究在CLT和GD病儿均检测到Th1类细胞因子(IFN-γ)水平升高，Th2类细胞因子(IL-4)水平降低,同时检测到存在T细胞亚群的紊乱,且外周血CD+4/CD+8比值升高与IFN-γ/IL-4比值升高之间,CD+8下降与IL-4下降之间呈现一致的关系,这与国内外文献报道相一致,结合国外学者的研究结果,可推测本病发作期细胞因子类型以Th1类占优势[1,3,5～8]。由于细胞因子是T细胞亚群不同亚类的功能体现，亚群和亚类之间存在着某种协调关系，由此认为本病体内Th1类细胞因子升高可能主要是CD+4 Th1亚类的功能亢进所致，而Th2类细胞因子的降低可能主要是CD+8 Th2亚类数量和功能降低所致，但尚需进一步分亚类研究来证实。
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参 考 文 献
1，Zipris D,Greiner DL,Malkani S,et al.Cytokine gene expression in islets and thyroids of BB rats.IFN-γ and IL-12 p40 mRNA increase with age both diabetic and insulin-treated nondiabetic BB rats.J Immunol,1996;156:1315～1321
2，叶红英综述.自身免疫性甲状腺疾病的T细胞亚群异常.国外学者来访报告，1996；16：46～52
3，Romagnani S.The Th1/Th2 paradigm.Immunol Today,1997;18:263～266
4，陶义训主编.免疫学和免疫学检验.北京：人民卫生出版社，1989：162～167
, 百拇医药
5，Adorini L,Sinigaglia F.Pathogenesis and immunotherapy of autoimmune diseases.Immunol Today,1997;18:209～211
6，Romagnai S.Human Th1 and Th2 subsets:dout no more.Immunol Today,1991;12:256～257
7，Watson PF,Pickerill AP,Davies R,et al.Analysis of cytokine gene expression in Graves' disease and multinodular goiter.J clin Endocrinol Metab，1994;79:355
8，Zipris D.Evidence that Th1 lymphocytes predominate in islet inflammation and thyoiditis in the BioBreeding(BB) rat.J Autoimmune,1996;9:315～319
, 百拇医药
9，Iwatani Y.Decreases in alpha beta T cell receptor negative T cells and CD+8 cells,and an increase in CD+4,CD+8 cells in active Hashimoto's disease and subacute thyroiditis.Clin Exp Immunol,1992;87:444～449
10，Satatsume Y,Matsubaryashi S,Kasuga Y,et al.CD4 cells from patients with antoimmune thyroid disease antigen;CD8 cells suppress this secretion.Ann Endocrinol(Abstract),1989;50:140
11，Matsubayashi S,Sakatsume Y,Kasuga Y,et al.Effect of supernatants of peripheral blood mononuclear cells stimulated by thyroid microsomal antigen on thyrocyte HLA-DR expression in vitro.Ann Endocrinol(Abstract),1989;50:140
收稿1999-12-25, 百拇医药
单位：泸州医学院附属医院儿科 泸州 646000
关键词：自身免疫甲状腺病；细胞因子；T细胞亚群
中国现代医学杂志000408 目的：探讨儿童自身免疫甲状腺病(AITD)细胞因子失衡与T细胞亚群失衡的关系。方法：采用E花环法和ELISA法同步分别检测初诊的AITD患儿和正常儿童外周血T细胞亚群和单个核细胞在丝裂原诱导下产生的IFN-γ、IL-4和IFN-γ/IL-4比值。结果：与正常组相比，CLT和GD病儿IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值明显升高，IL-4水平明显降低，CD+3、CD+8明显降低，CD+4/CD+8比值明显升高。且CD+8与IL-4水平、CD+4/CD+8比值与IFN-γ/IL-4比值呈显著正相关(r分别为0.76/0.75，0.68/0.58，P<0.05)。结论：AITD患儿Th1类细胞因子升高可能主要是CD+4 Th1亚类的功能亢进所致，而Th2类细胞因子的降低可能主要是CD+8 Th2亚类数量和功能降低所致。
, 百拇医药
分类号 R581
THE RELATIONSHIP BETWEEN THE T CELL SUBSETS
IMBALANCE AND THE CELL FACTOR IMBALANCE OF
INFANTILE ANTOIMMUNITY THYROPATHY
Dong Wenbin Deng Leili
(Department of Pediatrics, Attached Hospital, Luzhou Medical College, Luzhou 646000)
Objective: To explore the relationship between the imbalance of cytokinesis and T cell subsets in children with autoimmune thyroid disease. Methods: IFN-γ, IL-4 and the ratio of IFN-γ/IL-4 released from stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and their relationship with T cell subsets were investigated in 22 children with Hashimoto’s thyroiditis (HT), 24 children with Graves’disease (GD) at presentation. Results: Compared with normal subjects, IFN-γ, the ratio of IFN-γ/IL-4 were significantly increased whereas IL-4 significantly decreased in children with HT and GD at presentation. The percentage of CD+3, CD+8 T cells in peripheral blood were lower but the ratio of CD+4/CD+8 was higher in children with HT and GD at presentation than those in normal controls. The ratio of CD+4/CD+8, the percentage of CD+8 T were positively correlated with ratio of IFN-γ/IL-4 and IL-4 respectively. Conclusions: It is possible that the increased Th1 type cytokinesis be attributed to the enhanced function of Th1 type CD+4 cells while the decreased Th2 type cytokinesis be attributed to the declined number and function of Th2 type CD+8 cell.
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Key words: Thyroid disease; Autoimmune (AITD); Cytokinesis; T cell subsets
自身免疫甲状腺病(Autoimmune Thyroid Disease,AITD),包括慢性淋巴细胞甲状腺炎(Chronic Lymphocytic Thyroiditis,CLT)和弥漫性毒性甲状腺肿(Graves' Disease,GD)。研究表明：在其发病过程中，存在着细胞因子和细胞亚群的异常[1，2]。现代免疫学将CD+4和CD+8T细胞产生的细胞因子分为Th1和Th2两类，前者包括IL-2、IFN-γ和TNF-β等，与细胞免疫有关；后者包括IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，与体液免疫有关[3]。在AITD的发病过程中，二者存在何种关系尚不清楚。为此，本研究采用花环法和ELISA法同步分别检测初诊的AITD患儿和正常儿童外周血T细胞亚群和单个核细胞在丝裂原诱导下产生的IFN-γ，IL-4和IFN-γ/IL-4比值，以探讨二者的关系。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
CLT组22例，其中男性3例，女性19例，年龄3～13岁(平均9.35岁)。GD组24例，其中男性4例，女性20例，年龄3～15岁(平均9.67岁)。同期儿保科健康查体儿童15例作为正常对照组。上述受试对象在抽血前1个月内无明显感染史，无血制品及免疫增强剂或免疫抑制剂等用药史。
1.2 实验方法和检测指标
1.2.1 PBMC的分离及培养 无菌抽取静脉血2 ml，用肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)，用密度梯度离心法分离单个核细胞(PBMC)，0.2%台盼蓝实验鉴定细胞活力在95%以上后，用含10%FCS的RPMI-1640液重悬细胞并将其浓度配成1×109/L，加入PHA(终浓度为100 μg/ml)和LPS(终浓度为2 μg/ml)作为刺激剂，在5%CO2，37 ℃条件下培养72 h(在24孔培养板孔中进行)，离心，无菌收集上清液，在-30 ℃保存，集中检测。
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1.2.2 外周血T细胞亚群的测定 E花环法[4]：肘静脉无菌抽取静脉血5ml，用肝素抗凝，用密度梯度离心法分离出淋巴细胞后，用含10%FCS的RPMI-1640液将细胞浓度调至5×109/L，取3支试管分别加入上述细胞悬液(25 μl/支)，再分别加入CD+3，CD+4和CD+8单抗致敏的细胞悬液(25 μl/支)，室温下放10 min后，以500 r/min离心3～5 min，置冰箱过夜，涂片，瑞氏染色，油镜下计数200个细胞，淋巴细胞周围吸附3个以上细胞者为阳性细胞，计数各亚群的百分率。
1.2.3 细胞因子的检测
(1)上清液IFN-γ水平检测采用ABC-ELISA法，严格按照说明书操作，在450型酶联仪(美国Bio-Rad产品)测得OD值后，根据标准浓度制定标准曲线，然后在标准曲线上查找相应的值，单位为ng/L。药盒系第二军医大学微生物学教研室产品。
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(2)上清液IL-4水平检测采用双抗体夹心ELISA法，药盒由深圳晶美生物工程公司(进口分装)提供，操作同上。
1.3 统计学方法
结果用均数±标准差表示，凡进入统计的指标均输入Primer软件，在计算机上统计，进行正态性检验和方差齐性检验，组间用t检验进行比较。各指标间的关系用直线相关分析进行处理，求出r值和P值。
2 结果
2.1 初诊疾病组IFN-γ/IL-4水平的检测结果
表1 初诊病儿与正常儿童细胞因子的比较 (
±s) 分组例数
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IFN-γ(ng/L)
IL-4(ng/L)
IFN-γ/IL-4
CLT组
22
2139.95±648.001)
216.39±53.671)
10.51±4.092)
GD组
24
2626.60±1270.171)
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238.26±64.531)
11.89±5.601)
正常组
15
1292.41±637.25
352.65±123.16
5.52±3.71
注：1)与正常组相比P<0.01
2)与正常组相比P<0.02
由表1可以看出CLT和GD病儿PBMC产生IFN-γ水平和IFN-γ/IL比值较正常组明显升高，而IL-4水平明显降低。
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2.2 细胞因子水平失衡与外周血T细胞亚群失衡的关系
表2 初诊的病儿与正常儿童T细胞亚群的比较 (
±s) 分组例数
CD+3(%)
CD+4(%)
CD+8(%)
CD+4/CD+8
CLT组
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22
43.64±5.87
33.64±3.55
18.45±3.89
1.87±0.27
GD组
24
44.10±2.84
33.80±3.09
17.80±2.27
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1.92±0.23
正常组
15
58.67±10.23
39.56±7.04
26.74±5.96
1.40±0.29
注：与正常组相比P<0.05
由表2可见，与正常组相比，CLT和GD病儿CD+3和CD+8明显降低，CD+4/CD+8比值明显升高，且CD+8与IL-4水平、CD+4/CD+8比值与IFN-γ/IL-4比值呈显著正相关(r分别为0.76/0.75，0.68/0.58，P<0.05)。
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3 讨论
现代免疫学认为CD4+和CD8+ T细胞根据产生细胞因子不同分为Th1和Th2亚类,前者生成IL-2、IFN-γ、TNF-β和IL-12等,与细胞免疫有关;后者生成IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等,与体液免疫有关。正常情况下,体内Th1和Th2类细胞因子水平是CD+4和CD+8 T细胞不同亚类功能的综合体现,两类因子相互调控,形成网络,其中IL-12、IFN-γ诱导CD+4和CD+8T细胞向Th1亚类转化,而IL-4和IL-10则诱导其向Th2亚类转化,使细胞因子水平处于动态平衡,共同维持机体正常的免疫反应。一旦由于某些因素使这种平衡打破，出现Th1类/Th2类因子失衡,将导致机体免疫病理损害[3，5，6]。
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Romagnai S等[6]认为在AITD，浸润至甲状腺的CD+4细胞，在PHA刺激下可以产生IFN-γ，但不能产生IL-4；Watson PF等[7]进一步检测到GD甲状腺局部淋巴细胞存在IL-2、IFN-γ和TFNα的mRNA表达，而缺乏IL-4mRNA的表达：Zipris D等[1，8]在DR-BB鼠自发形成甲状腺炎过程中，IFN-γ、IL-12P40mRNA表达增强，且与疾病进展密切相关，而IL-4mRNA表达很弱，甚至检测不到。研究还表明[2，9]：AITD病儿存在外周血T细胞亚群的失衡，表现为：CD+4/CD+8T比值增大，CD+8 T百分含量降低，且CD+8 T细胞可以抑制甲状腺微粒体抗原诱导CD+4细胞产生IFN-γ[10，11]。本研究在CLT和GD病儿均检测到Th1类细胞因子(IFN-γ)水平升高，Th2类细胞因子(IL-4)水平降低,同时检测到存在T细胞亚群的紊乱,且外周血CD+4/CD+8比值升高与IFN-γ/IL-4比值升高之间,CD+8下降与IL-4下降之间呈现一致的关系,这与国内外文献报道相一致,结合国外学者的研究结果,可推测本病发作期细胞因子类型以Th1类占优势[1,3,5～8]。由于细胞因子是T细胞亚群不同亚类的功能体现，亚群和亚类之间存在着某种协调关系，由此认为本病体内Th1类细胞因子升高可能主要是CD+4 Th1亚类的功能亢进所致，而Th2类细胞因子的降低可能主要是CD+8 Th2亚类数量和功能降低所致，但尚需进一步分亚类研究来证实。
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参 考 文 献
1，Zipris D,Greiner DL,Malkani S,et al.Cytokine gene expression in islets and thyroids of BB rats.IFN-γ and IL-12 p40 mRNA increase with age both diabetic and insulin-treated nondiabetic BB rats.J Immunol,1996;156:1315～1321
2，叶红英综述.自身免疫性甲状腺疾病的T细胞亚群异常.国外学者来访报告，1996；16：46～52
3，Romagnani S.The Th1/Th2 paradigm.Immunol Today,1997;18:263～266
4，陶义训主编.免疫学和免疫学检验.北京：人民卫生出版社，1989：162～167
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5，Adorini L,Sinigaglia F.Pathogenesis and immunotherapy of autoimmune diseases.Immunol Today,1997;18:209～211
6，Romagnai S.Human Th1 and Th2 subsets:dout no more.Immunol Today,1991;12:256～257
7，Watson PF,Pickerill AP,Davies R,et al.Analysis of cytokine gene expression in Graves' disease and multinodular goiter.J clin Endocrinol Metab，1994;79:355
8，Zipris D.Evidence that Th1 lymphocytes predominate in islet inflammation and thyoiditis in the BioBreeding(BB) rat.J Autoimmune,1996;9:315～319
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9，Iwatani Y.Decreases in alpha beta T cell receptor negative T cells and CD+8 cells,and an increase in CD+4,CD+8 cells in active Hashimoto's disease and subacute thyroiditis.Clin Exp Immunol,1992;87:444～449
10，Satatsume Y,Matsubaryashi S,Kasuga Y,et al.CD4 cells from patients with antoimmune thyroid disease antigen;CD8 cells suppress this secretion.Ann Endocrinol(Abstract),1989;50:140
11，Matsubayashi S,Sakatsume Y,Kasuga Y,et al.Effect of supernatants of peripheral blood mononuclear cells stimulated by thyroid microsomal antigen on thyrocyte HLA-DR expression in vitro.Ann Endocrinol(Abstract),1989;50:140
收稿1999-12-25, 百拇医药