大鼠乳腺肿瘤细胞色素b基因序列分析
作者：王平忠 蒙世杰 刘佩 姚养正
单位：第四军医大学唐都医院传染科 西安 710038
关键词：大鼠；乳腺肿瘤；线粒体DNA；细胞色素b基因；序列
中国现代医学杂志000401 该文用DNA自动测序方法，测定了大鼠乳腺癌组织、癌旁组织和正常组织的细胞色素b基因序列。结果表明，癌组织发生了nt190 C→G，nt263 C→G和nt694 T→C三处点突变。癌旁组织发生了nt695 A→C突变。正常组织没有突变。癌旁组织在DNA水平属非正常组织。
分类号 R737.9
SEQUENCE ANALYSIS OF CYTOCHROME B
GENE FROM RAT BREAST CANCER
, 百拇医药
Wang Pingzhong Mon Shijie Liu Pei Yao yangzheng
(Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Miliary Medical University,Xi an, 710038)
Using DNA auto-sequencing methods, we analised the sequences of mitochondrial cytochrome b gene from rat breast cancer tissues, paracacinoma tissues and normal tissues. The results showed that the cytochrome b gene from cancer tissues had three points mutations, namely, the C to G mutation at nt 190, the C to G mutation at nt 263 and the T to C mutation at nt 694. The cytochrome b gene from paracacinoma tissues had A to C mutation at nt 695. The cytochnme b gene from normal tissue had not mutation. The paracacinoma tissues were abnormal tissues in DNA molecular level.
, http://www.100md.com
Key words:Rat, Breast cancer, Mitochondrial DNA, Cytochrome b gene, Sequence.
本实验测定了大鼠乳腺癌组织、癌旁组织和正常组织cyt b基因序列，以了解它们的变异，从而探讨mtDNA突变与肿瘤发生的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
由二甲基苯蒽(DMBA)诱发的大鼠乳腺肿瘤及正常个体均由陕西师范大学生命科学院姚养正老师提供。为近交28代的纯系。
1.2 主要试剂
dNTPs,BSA,Taq DNA购自华美公司(SABC产品)。Amberlite离子交换树脂(Sigma,MB-1A),Acrymide和Bis(AMRESCO产品)，DNA Sequencing Kit(＃402079,ABI产品)，Centri Sep柱(#cs-901,PRINCETON SEPARATIONS Inc.产品)。PCR产物：L14724 5’CGAAGCTTGATATGAAA-AACCATCGTTG 3’；H15915 5’AACTGCAGTCATCTCCGGTTTACAAGAC 3’。L15136 b:5'GGCTACGTACTCCCATGAGGAC 3'。由中科院昆明动物研究所细胞与分子进化开放实验室合成。
, 百拇医药
1.3 总DNA提取
处死动物，剥离瘤块，癌组织取自瘤块中央，癌旁组织距瘤块约1.5 cm处，均经病理检查。由于mtDNA无组织特异性，实验大鼠又是近交28代的纯系，因此用正常个体的肝脏代表正常组织。3种组织均取50 mg按常规方法进行总DNA(内含mtDNA)提取。
1.4 Cyt b基因的PCR扩增
PCR反应总体积50 μl，其中10×Buffer 5 μl，dNTP 2 μl，BSA 2 μl，DNA模板1 μl，引物L14724和H15915各1 μl，Taq DNA 4 U，ddH2O 37 μl。20 μl石蜡油覆盖。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，然后，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min,72 ℃延伸3.5 min。共35个循环后，72 ℃再延伸10 min。完成后，取2 μl在1.5%琼脂糖胶中检测PCR结果。
, 百拇医药
1.5 PCR产物的回收纯化
采用常规低熔点胶法。纯化好的PCR产物在65 ℃处理10 min，以灭活DNase,然后贮存于-20 ℃备用。
1.6 DNA序列测定
热循环测序反应用ABI的FS-DNA-sequencing Kit,操作按厂家推荐的方法进行。用CentriSep柱纯化测序产物。使用ABI的377 PRISM全自动DNA序列仪电泳(4.25%聚丙烯酰胺凝胶)并记录序列数据。得到序行后，以小鼠、大鼠mtDNA同源区域[3，4]进行排序。为防止错读和异源污染，重复测序一次。附图指示细胞色素b基因位置、引物名称及走向。
2 结果
三种组织细胞色素b基因序列长约1 148 bp。正常组织与大鼠已知的标准序列完全一致，而癌组织有nt190 C—G，nt263 C—G和nt694 T—C突变，癌旁组织有nt695 A—C突变。附表总结了Cytb基因全序列变异情况。
, 百拇医药
附表 癌组织和癌旁组织Cytb基因变异
正常
突变
位置
癌组织
C(GCA)
G(GGA)
nt190
C(GGC)
G(GGG)
nt263
T(CTA)
, 百拇医药
C(CCA)
nt694
癌旁组织
A(CTA)
C(CTC)
nt695
注：所测cytb基因中核苷酸的位置
附图 细胞色素b基因位置
箭头指标引物走向，数字对应于大鼠mtDNA序列[4]
3 讨论
, 百拇医药
序列分析法是研究NDA变异的最佳手段。本研究使用该方法测定了大鼠三种组织cyt b基因序列。发现癌组织有3处点突变，癌旁组织有一处点突变，而正常组织没有突变，说明癌组织和癌旁组织cyt b基因均不同于正常组织。从理论上讲，这些突变会改变Cyt b氨基酸组成，如除nt263 C→G颠换导致同义突变外，其他则为错义突变，nt190 C→G颠换，可能使精氨酸(CGU)变为脯氨酸(CCU)，nt694 T→C转换，可能使天冬氨酸(GAU)变为甘氨酸(GGU)。如果这些突变存在，则可能导致细胞生理功能异常。
在一些人类肿瘤和实验性肿瘤的研究中发现，癌细胞mtDNA可发生特异性突变[5，6]，提出了以mtDNA突变为基础的肿瘤发生模型[7，8]。Bianchi等[9]在研究人类乳腺癌组织和正常组织mtDNA时发现，癌变一般会出现在mtDNA异质性细胞中。本研究结果表明，大鼠乳腺癌cyt b基因发生了nt190、nt263 C→G颠换和nt694 T→C转换，虽然不能证明这些突变与乳腺癌的发生有何种关系，但由于线粒体的复制分离与细胞有丝分裂同步，含有突变mtDNA分子的细胞，通过无数次有丝分裂，mtDNA的非随机分离，将所有突变的mtDNA分子归集到某一个子代细胞中去，这一细胞最终将因严重的呼吸缺陷而衰亡。而那些含非突变mtDNA分子的细胞，在这一无限增殖过程中，部分细胞就可能获得了选择性生长优势，从而为恶性转化创造了条件。因此，mtDNA突变可能是细胞癌变的诱因之一。但它与肿瘤发生的相互关系仍有待进一步研究。
, 百拇医药
另外，在癌旁组织cyt b基因的nt695位点发生了A→C突变。因此，对所谓癌旁“正常组织”要慎重，显微镜检查无癌变的组织，并非不存在分子水平的基因异常。
本实验发现癌组织和癌旁组织cyt b基因均存在突变，mtDNA其他区域也可能有点突变及其它类型突变。由于mtDNA的重要作用在于与核基因一起共同制导呼吸链,其任何类型的突变可能对细胞功能都有重要而深远的影响。因此对肿瘤的研究,除重视核基因外,对核外遗传物质的变异也不可忽视,进一步探讨这些变异在肿瘤发生中的作用,则有助于阐明肿瘤的发生机制。
参 考 文 献
1，Hatefi Y.The mitochondrial electron transport and Oxidative phosphorylation system.Annu Rev Biohem,1985;54:1015～1069
, 百拇医药
2，Olivero O A.Preferential formation and decreased removal of cisplatin DNA adducts in Chinese haster overy cell mitochondrial DNA as compared to nuclear DNA.Multat Res,1997;37(1～2):79～83
3，Bibb M J,Van Etten R A,Wright C T,etal.Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA.Cell,1981;26:167～180
4，Gataleta G,Pepe G.De Candia G,etal.The complete nucleotide sequence of the rattus norvegicus mitochondrial genome:cryptic signals revealed by comparative analysis between vertebrates.J Mol Evol,1989;28:497～516
, http://www.100md.com
5，Taira M,Yoshide E,Kobayshi M,etal.Tumorassociated mutants of rats mitochondrial transfer RNA genes.Nucl.Acids.Res.,1983;11:1635～1643
6，Welter C,Kovacs G,Sseitz G,etal.Alteration of mitochondrial DNA in human oncoytomas.Genes Chromosomes Cancer,1989;1:79～82
7，Wilkie D,Evans I,Egilsson V,etal.Mitochondria,Cell Surafce and Carcinogenesis.Int Rev Cytol,1983;15:157～189
8，Shay J W,and Werbin H.Are mitochondrial DNA mutations involved in the carcinogenic processMutat.Res.,1987;186:149～160
9，Bianchi M S,Bianchi N O,Bailliet G.Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients.Cytogenet Cell Genet,1995;71:99～103, 百拇医药
单位：第四军医大学唐都医院传染科 西安 710038
关键词：大鼠；乳腺肿瘤；线粒体DNA；细胞色素b基因；序列
中国现代医学杂志000401 该文用DNA自动测序方法，测定了大鼠乳腺癌组织、癌旁组织和正常组织的细胞色素b基因序列。结果表明，癌组织发生了nt190 C→G，nt263 C→G和nt694 T→C三处点突变。癌旁组织发生了nt695 A→C突变。正常组织没有突变。癌旁组织在DNA水平属非正常组织。
分类号 R737.9
SEQUENCE ANALYSIS OF CYTOCHROME B
GENE FROM RAT BREAST CANCER
, 百拇医药
Wang Pingzhong Mon Shijie Liu Pei Yao yangzheng
(Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Miliary Medical University,Xi an, 710038)
Using DNA auto-sequencing methods, we analised the sequences of mitochondrial cytochrome b gene from rat breast cancer tissues, paracacinoma tissues and normal tissues. The results showed that the cytochrome b gene from cancer tissues had three points mutations, namely, the C to G mutation at nt 190, the C to G mutation at nt 263 and the T to C mutation at nt 694. The cytochrome b gene from paracacinoma tissues had A to C mutation at nt 695. The cytochnme b gene from normal tissue had not mutation. The paracacinoma tissues were abnormal tissues in DNA molecular level.
, http://www.100md.com
Key words:Rat, Breast cancer, Mitochondrial DNA, Cytochrome b gene, Sequence.
本实验测定了大鼠乳腺癌组织、癌旁组织和正常组织cyt b基因序列，以了解它们的变异，从而探讨mtDNA突变与肿瘤发生的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
由二甲基苯蒽(DMBA)诱发的大鼠乳腺肿瘤及正常个体均由陕西师范大学生命科学院姚养正老师提供。为近交28代的纯系。
1.2 主要试剂
dNTPs,BSA,Taq DNA购自华美公司(SABC产品)。Amberlite离子交换树脂(Sigma,MB-1A),Acrymide和Bis(AMRESCO产品)，DNA Sequencing Kit(＃402079,ABI产品)，Centri Sep柱(#cs-901,PRINCETON SEPARATIONS Inc.产品)。PCR产物：L14724 5’CGAAGCTTGATATGAAA-AACCATCGTTG 3’；H15915 5’AACTGCAGTCATCTCCGGTTTACAAGAC 3’。L15136 b:5'GGCTACGTACTCCCATGAGGAC 3'。由中科院昆明动物研究所细胞与分子进化开放实验室合成。
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1.3 总DNA提取
处死动物，剥离瘤块，癌组织取自瘤块中央，癌旁组织距瘤块约1.5 cm处，均经病理检查。由于mtDNA无组织特异性，实验大鼠又是近交28代的纯系，因此用正常个体的肝脏代表正常组织。3种组织均取50 mg按常规方法进行总DNA(内含mtDNA)提取。
1.4 Cyt b基因的PCR扩增
PCR反应总体积50 μl，其中10×Buffer 5 μl，dNTP 2 μl，BSA 2 μl，DNA模板1 μl，引物L14724和H15915各1 μl，Taq DNA 4 U，ddH2O 37 μl。20 μl石蜡油覆盖。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，然后，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min,72 ℃延伸3.5 min。共35个循环后，72 ℃再延伸10 min。完成后，取2 μl在1.5%琼脂糖胶中检测PCR结果。
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1.5 PCR产物的回收纯化
采用常规低熔点胶法。纯化好的PCR产物在65 ℃处理10 min，以灭活DNase,然后贮存于-20 ℃备用。
1.6 DNA序列测定
热循环测序反应用ABI的FS-DNA-sequencing Kit,操作按厂家推荐的方法进行。用CentriSep柱纯化测序产物。使用ABI的377 PRISM全自动DNA序列仪电泳(4.25%聚丙烯酰胺凝胶)并记录序列数据。得到序行后，以小鼠、大鼠mtDNA同源区域[3，4]进行排序。为防止错读和异源污染，重复测序一次。附图指示细胞色素b基因位置、引物名称及走向。
2 结果
三种组织细胞色素b基因序列长约1 148 bp。正常组织与大鼠已知的标准序列完全一致，而癌组织有nt190 C—G，nt263 C—G和nt694 T—C突变，癌旁组织有nt695 A—C突变。附表总结了Cytb基因全序列变异情况。
, 百拇医药
附表 癌组织和癌旁组织Cytb基因变异
正常
突变
位置
癌组织
C(GCA)
G(GGA)
nt190
C(GGC)
G(GGG)
nt263
T(CTA)
, 百拇医药
C(CCA)
nt694
癌旁组织
A(CTA)
C(CTC)
nt695
注：所测cytb基因中核苷酸的位置
附图 细胞色素b基因位置
箭头指标引物走向，数字对应于大鼠mtDNA序列[4]
3 讨论
, 百拇医药
序列分析法是研究NDA变异的最佳手段。本研究使用该方法测定了大鼠三种组织cyt b基因序列。发现癌组织有3处点突变，癌旁组织有一处点突变，而正常组织没有突变，说明癌组织和癌旁组织cyt b基因均不同于正常组织。从理论上讲，这些突变会改变Cyt b氨基酸组成，如除nt263 C→G颠换导致同义突变外，其他则为错义突变，nt190 C→G颠换，可能使精氨酸(CGU)变为脯氨酸(CCU)，nt694 T→C转换，可能使天冬氨酸(GAU)变为甘氨酸(GGU)。如果这些突变存在，则可能导致细胞生理功能异常。
在一些人类肿瘤和实验性肿瘤的研究中发现，癌细胞mtDNA可发生特异性突变[5，6]，提出了以mtDNA突变为基础的肿瘤发生模型[7，8]。Bianchi等[9]在研究人类乳腺癌组织和正常组织mtDNA时发现，癌变一般会出现在mtDNA异质性细胞中。本研究结果表明，大鼠乳腺癌cyt b基因发生了nt190、nt263 C→G颠换和nt694 T→C转换，虽然不能证明这些突变与乳腺癌的发生有何种关系，但由于线粒体的复制分离与细胞有丝分裂同步，含有突变mtDNA分子的细胞，通过无数次有丝分裂，mtDNA的非随机分离，将所有突变的mtDNA分子归集到某一个子代细胞中去，这一细胞最终将因严重的呼吸缺陷而衰亡。而那些含非突变mtDNA分子的细胞，在这一无限增殖过程中，部分细胞就可能获得了选择性生长优势，从而为恶性转化创造了条件。因此，mtDNA突变可能是细胞癌变的诱因之一。但它与肿瘤发生的相互关系仍有待进一步研究。
, 百拇医药
另外，在癌旁组织cyt b基因的nt695位点发生了A→C突变。因此，对所谓癌旁“正常组织”要慎重，显微镜检查无癌变的组织，并非不存在分子水平的基因异常。
本实验发现癌组织和癌旁组织cyt b基因均存在突变，mtDNA其他区域也可能有点突变及其它类型突变。由于mtDNA的重要作用在于与核基因一起共同制导呼吸链,其任何类型的突变可能对细胞功能都有重要而深远的影响。因此对肿瘤的研究,除重视核基因外,对核外遗传物质的变异也不可忽视,进一步探讨这些变异在肿瘤发生中的作用,则有助于阐明肿瘤的发生机制。
参 考 文 献
1，Hatefi Y.The mitochondrial electron transport and Oxidative phosphorylation system.Annu Rev Biohem,1985;54:1015～1069
, 百拇医药
2，Olivero O A.Preferential formation and decreased removal of cisplatin DNA adducts in Chinese haster overy cell mitochondrial DNA as compared to nuclear DNA.Multat Res,1997;37(1～2):79～83
3，Bibb M J,Van Etten R A,Wright C T,etal.Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA.Cell,1981;26:167～180
4，Gataleta G,Pepe G.De Candia G,etal.The complete nucleotide sequence of the rattus norvegicus mitochondrial genome:cryptic signals revealed by comparative analysis between vertebrates.J Mol Evol,1989;28:497～516
, http://www.100md.com
5，Taira M,Yoshide E,Kobayshi M,etal.Tumorassociated mutants of rats mitochondrial transfer RNA genes.Nucl.Acids.Res.,1983;11:1635～1643
6，Welter C,Kovacs G,Sseitz G,etal.Alteration of mitochondrial DNA in human oncoytomas.Genes Chromosomes Cancer,1989;1:79～82
7，Wilkie D,Evans I,Egilsson V,etal.Mitochondria,Cell Surafce and Carcinogenesis.Int Rev Cytol,1983;15:157～189
8，Shay J W,and Werbin H.Are mitochondrial DNA mutations involved in the carcinogenic processMutat.Res.,1987;186:149～160
9，Bianchi M S,Bianchi N O,Bailliet G.Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients.Cytogenet Cell Genet,1995;71:99～103, 百拇医药