柱切换HPLC法测定腹水中左旋氧氟沙星的含量
作者：刘荔荔 翟振兴 李翔 王卓 万谟彬 高申
单位：
关键词：色谱法，高效液相；柱切换；左旋氧氟沙星；腹水
第二军医大学学报000422 【摘要】目的：应用柱切换HPLC技术直接测定腹水中左旋氧氟沙星含量。方法：采用磷酸二氢钾缓冲溶液(pH 2.2)-0.05 mol/L四丁溴化化铵(100∶4)为预处理流动相，经μBondapak C18柱预处理后，切换到Irregular-H C18分析柱，以甲醇-磷酸二氢钾缓冲溶液(pH 2.2)-0.05 mol/L四丁基溴化铵(30∶70∶4)为分析流动相进行分离测定，紫外线检测波长为294 nm。结果：左旋氧氟沙星浓度在0.16～16 μg/ml范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.9997；方法平均回收率为103.5%，日内及日间差均小于2.5%；最低检测浓度50 ng/ml。结论：样品无需预处理，直接进样分析测定，方法简便可行。
, 百拇医药
【中图分类号】R 978.1 【文献标识码】A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0375-03
Determination of levofloxacin in ascites by column-switching high performance liquid chromatography
LIU Li-Li，ZHAI Zhen-Xing
(Centre of Analysis & Test,College of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
LI Xiang
, 百拇医药
(No.1 Hospital of PLA)
WANG Zhuo
(Department of Pharmacy,Changhai Hospital)
WAN Mo-Bin
(Department of Infectious diseases,Changhai Hospital)
GAO Shen
(Department of Pharmaceutics,College of Pharmacy)
【ABSTRACT】Objective：To develop an analytical method to determine the concentration of levofloxacin in ascites by HPLC without pretreatment.Methods：Good separation was achieved under the following conditions：potassium dihydrogen phosphate buffer solution (pH 2.2)-0.05 mol/L tetrabutylammonium bromide (100:4) was used as the pretreating mobile phases.Before transited into the analytical column (Irregular-H C18)，the samples were pretreated online by the column μ Bondapak C18.Finally methanol-potassium dihydrogen phosphate buffer solution (pH 2.2)-0.05 mol/L tetrabutylammonium bromide (30:70:4) was used as the analytical mobile phases.The wavelength of UV detection was 294 nm.Results：The assay was linear for levofloxacin in the range of 0.16～16 μg/ml concentration.The correlation coefficient r=0.999 7.The mean method recovery was 103.5 %，while the relative standard deviation for the within-day and between-days precision were all less than 2.5%.The minimum detective concentration was 50 ng/ml.Conclusion：This method is simple，rapid and accurate.It can be operated without pretreatment.
, 百拇医药
【KEY WORDS】chromatography,high performance liguid；column switching；levofloxacin；ascites
左旋氧氟沙星(levofloxacin，下称LVLX)是日本第一制药株式会社于1986年研制的三环类氟喹诺酮类抗菌药，具有抗菌谱广、抗菌活性强、细菌很少产生耐药性等优点，对G+和包括铜绿假单孢菌在内的G-杆菌均有很强的抑制作用[1]。该药在临床抗感染用药中的比例逐渐增加，其口服制剂已经广泛应用于呼吸系统、泌尿系统和消化系统等各种全身细菌感染症的治疗。LVLX具有口服吸收迅速，峰浓度高，副作用少等特点，在体内可广泛分布于组织和体液中，几乎不被代谢，在肝、肺、肾组织中的浓度也高于血浓度。LVLX的药物动力学监测方法较多[2～4]，但它们均需对样本进行预处理，包括有机溶剂萃取、蒸干以及再溶解等过程，操作繁杂、费时费力、应用不便。本实验应用柱切换技术[5]，以腹水中LVLX浓度监测肝腹水患者服药后的情况，样本不需预处理，可直接进样分析，具有快速、简便、灵敏的优点，取得了良好的结果，达到了预期的目的，尤其适合于临床药物动力学研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 仪器和试药 高效液相色谱仪(Water-Model 510/996/2010系统)；XW-80A型旋涡混合器(上海第一医科大学仪器厂生产)；82-0型离心沉淀器(上海手术器械厂生产)。LVLX标准品(日本Daiichi公司提供)；甲醇、磷酸二氢钾和四丁基溴化铵均为分析纯。
1.2 色谱条件 分析柱：250 mm×3.6 mm，id，内装 iregular-H C18，10 μm；预处理柱30 mm×5 mm，id，内装 μBondapak C18，37～50 μm；分析流动相：甲醇-磷酸二氢钾缓冲液(pH2.2)-0.05 mol/L四丁基溴化铵(30∶70∶4)；流速：1 ml/min；预处理流动相：磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.2)-0.05 mol/L四丁基溴化铵(100∶4)；流速：2 ml/min；紫外线检测波长：294 nm。
, 百拇医药
1.3 柱切换操作 柱切换系统流程见图1。样品先进入预处理柱，经预处理流动相冲洗，待腹水中杂质基本冲洗干净后，转动切换阀，使预处理柱和分析柱成串联状态，分析流动相即可将保留在预处理柱中的LVLX洗脱入分析柱，进行分离测定。然后切换阀再转回，致使分析柱和预处理柱断开，分别用甲醇清洗预柱和用预处理流动相平衡后，即可等待下次进样。柱切换操作时间表1。
图 1 柱切换HPLC系统流程图
Fig 1 Procedure of column switching HPLC system
-：Pretreating; ---:Analysis; AMP:Analytical mobile phase;
PMP1:Pretreating mobile phase;PMP2:Methanol
, 百拇医药
表 1 柱切换操作时间表
Tab 1 Time schedule of column switching Time
(t/min)
Valve
mode
Analytical
column
Pretreating
column
0.0～2.9
Pretreating
, 百拇医药
AMP
PMP1
3.0～4.4
Analysis
AMP
AMP
4.5～6.4
Pretreating
AMP
PMP2
6.5～8.4
Pretreating
, 百拇医药 AMP
PMP1
8.5～
Pretreating
AMP
Stop
AMP：Analytical mobile phase; PMP1：Pretreating mobile phase; PMP2：Methanol
1.4 样品测定 精密吸取待测腹水样本0.1 ml，于1.5 ml的塑料离心管中，加入磷酸二氢钾缓冲液0.7 ml，旋涡混匀，离心5 min，取上清液750 μl，直接进样。色谱图见图2。
, 百拇医药
图 2 左旋氧氟沙星色谱图
Fig 2 The chromatograms of levofloxacin
A: Standard solution; B: Blank ascites; C: Hepatitis sufferers′ ascites collected at 2 h post-dose
2 结 果
2.1 腹水样本标准曲线及检测限 配制系列LVLX标准溶液，使质量浓度分别为0.16，0.32，2.00，4.00，8.00，16.00 μg/ml，按前述方法测定。以LVLX标准溶液的峰面积(A)对相应的浓度(c)进行线性回归分析，得回归方程：A = 51 788+266 008 c，r = 0.999 7。最低检测浓度为50 ng/ml(S/N=3)。
, http://www.100md.com
2.2 精密度与回收率 配制系列标准溶液，同上操作，测定方法的回收率，平均为103.5%，另在日内和日间重复测定(n=5)，观察方法的精密度，结果见表2。
表 2 腹水中LVLX测定的精密度
Tab 2 Precision of the method for determination
of levofloxacin in ascites Added
(ρB/μg.ml-1)
Measured
(ρB/μg.ml-1)
, 百拇医药
SD
(ρB/μg.ml-1)
RSD
(%)
Within day
2.02
2.15
0.045 4
2.11
4.03
4.16
0.050 6
, 百拇医药
1.22
8.06
8.13
0.110 0
1.35
Between days
2.02
2.17
0.052 2
2.40
4.03
4.17
0.056 6
, http://www.100md.com
1.36
8.06
8.16
0.122 0
1.50
2.3 腹水患者的药物动力学实验 选择肝炎腹水患者8例，均为男性。口服LVLX胶囊300 mg后，于不同时刻取腹水，用本法测定LVLX的浓度，其平均药时曲线见图3。
图 3 8例肝炎患者口服LVLX 200 mg
后的腹水药物浓度-时间曲线
Fig 3 The concentration of levofloxacin in 8 hepatitis
, http://www.100md.com
sufferers' ascites after PO 200 mg
○：subject A; ●: subject B; □: subject C; ■: subject D
△: subject E; ▲: subject F; ◇: subject G; ◆: subject H
3 讨 论
体内药物分析因干扰较多，常需进行样品预处理。腹水中含有多种蛋白质[6]，易使高效液相柱堵塞，无法直接测定。柱切换技术可以实现体内标本的在线预处理[5]。本方法利用此特点，使用预处理流动相在预柱中将腹水样本中的蛋白质等内源性杂质洗脱净化后，用分析柱进行测定，避免了繁琐的预处理过程，简便快速，在体内药物分析中，特别是治疗药物监测和临床药理研究中有着良好的应用前景。 LVLX对大多数细菌的最低抑菌浓度(MIC90)均<1.56 μg/L[1,7]。本研究结果表明，一次性口服给药200 mg后，LVLX可较快进入腹水；给药后2～12 h内，LVLX腹水浓度>1.56 μg/L ，能够有效地抑制细菌，缓解病情。考虑到不同患者腹水量多少的不同，导致LVLX的浓度存在着较大差异，但是因为其分布和代谢的特点，对于腹水患者进行腹水中药物浓度的监测较血液和其他组织液药物浓度监测更具实际意义。
, 百拇医药
【参考文献】
[1]Tanaka M.DR-3355氟嗪酸光学异构体的体外与体内抗菌作用[J].国外医药.抗生素分册，1992，13 (1)：53-57.
[2]陈勇川，刘松青，董 慧，等.胆道疾病对左旋氧氟沙星的胆药浓度的影响[J].中国临床药学杂志，1999,8(3)：140-143.
[3]张 静，施裕珍，王海燕.左旋氧氟沙星血药浓度测定及药物动力学[J].中国临床药学杂志，1999，8(3)：155-157 .
[4]史爱欣，李可欣，刘 蕾，等.甲磺酸左旋氧氟沙星注射液的人体药物动力学[J].中国临床药学杂志，1999，8(3)：161-164 .
[5]王 卓，刘荔荔，高 申，等.柱切换高效液相技术及其在复杂样品分析中的应用[J].药学实践杂志，1996，14(6)：349-354.
[6]Sherlockzh S,ed，钱本余，沈根荣，译.肝胆系统疾病[M].第3版.上海：上海科学技术出版社，1980.116-141.
[7]袁富山.喹诺酮类药物研究进展[J].国外医药.合成药、生化药、制剂分册，1996，17(2)：86-90.
【收稿日期】1999-11-04
【修回日期】2000-02-29, 百拇医药
单位：
关键词：色谱法，高效液相；柱切换；左旋氧氟沙星；腹水
第二军医大学学报000422 【摘要】目的：应用柱切换HPLC技术直接测定腹水中左旋氧氟沙星含量。方法：采用磷酸二氢钾缓冲溶液(pH 2.2)-0.05 mol/L四丁溴化化铵(100∶4)为预处理流动相，经μBondapak C18柱预处理后，切换到Irregular-H C18分析柱，以甲醇-磷酸二氢钾缓冲溶液(pH 2.2)-0.05 mol/L四丁基溴化铵(30∶70∶4)为分析流动相进行分离测定，紫外线检测波长为294 nm。结果：左旋氧氟沙星浓度在0.16～16 μg/ml范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.9997；方法平均回收率为103.5%，日内及日间差均小于2.5%；最低检测浓度50 ng/ml。结论：样品无需预处理，直接进样分析测定，方法简便可行。
, 百拇医药
【中图分类号】R 978.1 【文献标识码】A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0375-03
Determination of levofloxacin in ascites by column-switching high performance liquid chromatography
LIU Li-Li，ZHAI Zhen-Xing
(Centre of Analysis & Test,College of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
LI Xiang
, 百拇医药
(No.1 Hospital of PLA)
WANG Zhuo
(Department of Pharmacy,Changhai Hospital)
WAN Mo-Bin
(Department of Infectious diseases,Changhai Hospital)
GAO Shen
(Department of Pharmaceutics,College of Pharmacy)
【ABSTRACT】Objective：To develop an analytical method to determine the concentration of levofloxacin in ascites by HPLC without pretreatment.Methods：Good separation was achieved under the following conditions：potassium dihydrogen phosphate buffer solution (pH 2.2)-0.05 mol/L tetrabutylammonium bromide (100:4) was used as the pretreating mobile phases.Before transited into the analytical column (Irregular-H C18)，the samples were pretreated online by the column μ Bondapak C18.Finally methanol-potassium dihydrogen phosphate buffer solution (pH 2.2)-0.05 mol/L tetrabutylammonium bromide (30:70:4) was used as the analytical mobile phases.The wavelength of UV detection was 294 nm.Results：The assay was linear for levofloxacin in the range of 0.16～16 μg/ml concentration.The correlation coefficient r=0.999 7.The mean method recovery was 103.5 %，while the relative standard deviation for the within-day and between-days precision were all less than 2.5%.The minimum detective concentration was 50 ng/ml.Conclusion：This method is simple，rapid and accurate.It can be operated without pretreatment.
, 百拇医药
【KEY WORDS】chromatography,high performance liguid；column switching；levofloxacin；ascites
左旋氧氟沙星(levofloxacin，下称LVLX)是日本第一制药株式会社于1986年研制的三环类氟喹诺酮类抗菌药，具有抗菌谱广、抗菌活性强、细菌很少产生耐药性等优点，对G+和包括铜绿假单孢菌在内的G-杆菌均有很强的抑制作用[1]。该药在临床抗感染用药中的比例逐渐增加，其口服制剂已经广泛应用于呼吸系统、泌尿系统和消化系统等各种全身细菌感染症的治疗。LVLX具有口服吸收迅速，峰浓度高，副作用少等特点，在体内可广泛分布于组织和体液中，几乎不被代谢，在肝、肺、肾组织中的浓度也高于血浓度。LVLX的药物动力学监测方法较多[2～4]，但它们均需对样本进行预处理，包括有机溶剂萃取、蒸干以及再溶解等过程，操作繁杂、费时费力、应用不便。本实验应用柱切换技术[5]，以腹水中LVLX浓度监测肝腹水患者服药后的情况，样本不需预处理，可直接进样分析，具有快速、简便、灵敏的优点，取得了良好的结果，达到了预期的目的，尤其适合于临床药物动力学研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 仪器和试药 高效液相色谱仪(Water-Model 510/996/2010系统)；XW-80A型旋涡混合器(上海第一医科大学仪器厂生产)；82-0型离心沉淀器(上海手术器械厂生产)。LVLX标准品(日本Daiichi公司提供)；甲醇、磷酸二氢钾和四丁基溴化铵均为分析纯。
1.2 色谱条件 分析柱：250 mm×3.6 mm，id，内装 iregular-H C18，10 μm；预处理柱30 mm×5 mm，id，内装 μBondapak C18，37～50 μm；分析流动相：甲醇-磷酸二氢钾缓冲液(pH2.2)-0.05 mol/L四丁基溴化铵(30∶70∶4)；流速：1 ml/min；预处理流动相：磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.2)-0.05 mol/L四丁基溴化铵(100∶4)；流速：2 ml/min；紫外线检测波长：294 nm。
, 百拇医药
1.3 柱切换操作 柱切换系统流程见图1。样品先进入预处理柱，经预处理流动相冲洗，待腹水中杂质基本冲洗干净后，转动切换阀，使预处理柱和分析柱成串联状态，分析流动相即可将保留在预处理柱中的LVLX洗脱入分析柱，进行分离测定。然后切换阀再转回，致使分析柱和预处理柱断开，分别用甲醇清洗预柱和用预处理流动相平衡后，即可等待下次进样。柱切换操作时间表1。
图 1 柱切换HPLC系统流程图
Fig 1 Procedure of column switching HPLC system
-：Pretreating; ---:Analysis; AMP:Analytical mobile phase;
PMP1:Pretreating mobile phase;PMP2:Methanol
, 百拇医药
表 1 柱切换操作时间表
Tab 1 Time schedule of column switching Time
(t/min)
Valve
mode
Analytical
column
Pretreating
column
0.0～2.9
Pretreating
, 百拇医药
AMP
PMP1
3.0～4.4
Analysis
AMP
AMP
4.5～6.4
Pretreating
AMP
PMP2
6.5～8.4
Pretreating
, 百拇医药 AMP
PMP1
8.5～
Pretreating
AMP
Stop
AMP：Analytical mobile phase; PMP1：Pretreating mobile phase; PMP2：Methanol
1.4 样品测定 精密吸取待测腹水样本0.1 ml，于1.5 ml的塑料离心管中，加入磷酸二氢钾缓冲液0.7 ml，旋涡混匀，离心5 min，取上清液750 μl，直接进样。色谱图见图2。
, 百拇医药
图 2 左旋氧氟沙星色谱图
Fig 2 The chromatograms of levofloxacin
A: Standard solution; B: Blank ascites; C: Hepatitis sufferers′ ascites collected at 2 h post-dose
2 结 果
2.1 腹水样本标准曲线及检测限 配制系列LVLX标准溶液，使质量浓度分别为0.16，0.32，2.00，4.00，8.00，16.00 μg/ml，按前述方法测定。以LVLX标准溶液的峰面积(A)对相应的浓度(c)进行线性回归分析，得回归方程：A = 51 788+266 008 c，r = 0.999 7。最低检测浓度为50 ng/ml(S/N=3)。
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2.2 精密度与回收率 配制系列标准溶液，同上操作，测定方法的回收率，平均为103.5%，另在日内和日间重复测定(n=5)，观察方法的精密度，结果见表2。
表 2 腹水中LVLX测定的精密度
Tab 2 Precision of the method for determination
of levofloxacin in ascites Added
(ρB/μg.ml-1)
Measured
(ρB/μg.ml-1)
, 百拇医药
SD
(ρB/μg.ml-1)
RSD
(%)
Within day
2.02
2.15
0.045 4
2.11
4.03
4.16
0.050 6
, 百拇医药
1.22
8.06
8.13
0.110 0
1.35
Between days
2.02
2.17
0.052 2
2.40
4.03
4.17
0.056 6
, http://www.100md.com
1.36
8.06
8.16
0.122 0
1.50
2.3 腹水患者的药物动力学实验 选择肝炎腹水患者8例，均为男性。口服LVLX胶囊300 mg后，于不同时刻取腹水，用本法测定LVLX的浓度，其平均药时曲线见图3。
图 3 8例肝炎患者口服LVLX 200 mg
后的腹水药物浓度-时间曲线
Fig 3 The concentration of levofloxacin in 8 hepatitis
, http://www.100md.com
sufferers' ascites after PO 200 mg
○：subject A; ●: subject B; □: subject C; ■: subject D
△: subject E; ▲: subject F; ◇: subject G; ◆: subject H
3 讨 论
体内药物分析因干扰较多，常需进行样品预处理。腹水中含有多种蛋白质[6]，易使高效液相柱堵塞，无法直接测定。柱切换技术可以实现体内标本的在线预处理[5]。本方法利用此特点，使用预处理流动相在预柱中将腹水样本中的蛋白质等内源性杂质洗脱净化后，用分析柱进行测定，避免了繁琐的预处理过程，简便快速，在体内药物分析中，特别是治疗药物监测和临床药理研究中有着良好的应用前景。 LVLX对大多数细菌的最低抑菌浓度(MIC90)均<1.56 μg/L[1,7]。本研究结果表明，一次性口服给药200 mg后，LVLX可较快进入腹水；给药后2～12 h内，LVLX腹水浓度>1.56 μg/L ，能够有效地抑制细菌，缓解病情。考虑到不同患者腹水量多少的不同，导致LVLX的浓度存在着较大差异，但是因为其分布和代谢的特点，对于腹水患者进行腹水中药物浓度的监测较血液和其他组织液药物浓度监测更具实际意义。
, 百拇医药
【参考文献】
[1]Tanaka M.DR-3355氟嗪酸光学异构体的体外与体内抗菌作用[J].国外医药.抗生素分册，1992，13 (1)：53-57.
[2]陈勇川，刘松青，董 慧，等.胆道疾病对左旋氧氟沙星的胆药浓度的影响[J].中国临床药学杂志，1999,8(3)：140-143.
[3]张 静，施裕珍，王海燕.左旋氧氟沙星血药浓度测定及药物动力学[J].中国临床药学杂志，1999，8(3)：155-157 .
[4]史爱欣，李可欣，刘 蕾，等.甲磺酸左旋氧氟沙星注射液的人体药物动力学[J].中国临床药学杂志，1999，8(3)：161-164 .
[5]王 卓，刘荔荔，高 申，等.柱切换高效液相技术及其在复杂样品分析中的应用[J].药学实践杂志，1996，14(6)：349-354.
[6]Sherlockzh S,ed，钱本余，沈根荣，译.肝胆系统疾病[M].第3版.上海：上海科学技术出版社，1980.116-141.
[7]袁富山.喹诺酮类药物研究进展[J].国外医药.合成药、生化药、制剂分册，1996，17(2)：86-90.
【收稿日期】1999-11-04
【修回日期】2000-02-29, 百拇医药