猪血小板衍生生长因子的氨基酸组成和等电点分析
作者：任雨笙 崔芳 陈强 贾国良 王增禄 张英起 吴宗贵
单位：
关键词：血小板衍生生长因子；氨基酸测序；等电点
第二军医大学学报000420 【摘要】目的：测定猪血小板衍生生长因子的氨基酸组成和等电点。方法：用酸水解及聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的方法测定猪血小板衍生生长因子的氨基酸含量、组成成分和等电点。结果：酸水解法测定的猪血小板衍生生长因子含有17种不同的氨基酸，其中含有相对较多的碱性氨基酸，其等电点为9.8～10.3。结论：猪血小板衍生生长因子是一种强阳离子多肽，含有相对较多的碱性氨基酸，与其等电点为9.8～10.3是一致的。
【中图分类号】Q 571 【文献标识码】A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0369-03
, 百拇医药
Amino acid composition and isoelectric point analysis of porcine platelet-derived growth factor
REN Yu-Sheng,WU Zong-Gui
(Department of Cardiovasology，Changzheng Hospital， Second Military Medical University,Shanghai 200003,China)
CUI Fang,JIA Guo-Liang
(Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)
, http://www.100md.com CHEN Qiang
(School of Stomatology)
WANG Zeng-Lu,ZHANG Ying-Qi
(Biotechnology Center)
【ABSTRACT】Objective:To determine the amino acid composition and isoelectric point of porcine platelet-derived growth factor.Methods:In the present experiment,acid dehydroxy amino acid analysis and isoelectric focusing in polyacylamide gels were used and the amino acid composition and isoelectric point of porcine platelet-derived growth factor were studied.Results:The findings of acid dehydroxy amino acid analysis and isoelectric focusing in polyacylamide gels showed that,porcine platelet-derived growth factor contained 17 amino acid residues in which the protein was rich in the strong predominance of basic amino acid and its isoelectric point was in the range of 9.8-10.3.Conclusion:Porcine platelet-derived growth factor is a strongly positive ionic polypeptide and may contain the strong predominance of basic amino acids in its amino acids composition,as reflected by the isoelectric point range of 9.8-10.3.
, http://www.100md.com
【KEY WORDS】platelet-derived growth factor； amino acid,sequencing isoelectric focusing； isoelectric point
血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是具有广泛生物学作用的大分子蛋白质[1]。氨基酸分析是研究蛋白质的基本方法之一，对蛋白质的组成和结构分析具有重要的意义，它广泛应用于医学、分子生物学等许多领域。而对多肽、蛋白质等生物大分子的理化性质的研究，首先要了解所研究的大分子保持其生物学活性和可溶性的pH范围，因此对蛋白质的等电点(isoelectric point，pI)的研究也是十分重要的。本实验在已提取和纯化猪血小板衍生生长因子[2](porcine platelet-derived growth factor,pPDGF)的基础上，采用酸水解法及聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的方法测定pPDGF中不同氨基酸的含量和等电点，分析pPDGF的氨基酸组成及其意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 主要试剂 pPDGF(第四军医大学生物技术中心)[2]。100 μmol/L 17种氨基酸标准液 (Beckman Co.)。4 mol/L醋酸锂缓冲液(pH5.2)：氢氧化锂95.84 g，冰醋酸293 ml，加蒸馏水至1 000 ml。茚三酮溶液：二甲亚砜 675 ml，醋酸锂缓冲液 225 ml，水合茚三酮 189 g，硼氢化钠 75 ml。柠檬酸钠缓冲液，配制参见文献[3]。30.8%单体母液：丙烯酰胺30 g，双丙烯酰胺0.8 g，加蒸馏水至100 ml，过滤后4℃贮藏。40%两性电解质(Ampholine，Pharmacia-LKB Co.)。平衡液与洗脱液：乙醇100 ml，冰醋酸32 ml，加蒸馏水268 ml。染色液：平衡液500 ml，考马斯亮蓝R-250 500 mg，过滤备用。pI标准品(pI 4.7～10.6)(Pharmacia-LKB)。电极液：阴极1 mol/L NaOH，阳极1 mol/L H3PO4。Triton X-100 (Gibco Co.) 。
, 百拇医药
1.2 主要仪器 氨基酸水解管，121MB氨基酸分析仪(Beckman Co.)，AA-10型阳离子交换柱(Beckman Co.)，恒温烤箱(上海爱斯佩克仪器有限公司)，TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。 LKB2117多用电泳槽 (Pharmacia Co.) 。LKB电泳仪 (Pharmacia Co.) 。
1.3 pPDGF的氨基酸分析
1.3.1 样品酸水解 按刘智广等[4]的方法，取pPDGF样品200 μg，置于水解管中；加入6 mol/L盐酸2 ml，向水解管中充入氮气30 s后立即封管。将水解管置于烤箱中110℃水解22 h。待自然冷却后，将水解液移入坩锅内水浴干燥，待蒸干后再加入去离子水，再蒸干，重复2次。最后加入柠檬酸缓冲液(pH 2.2)，溶解pPDGF水解样品，离心后备用。
1.3.2 水解样品氨基酸分析 将pPDGF水解样品和17种氨基酸标准液在121MB氨基酸分析仪上，样品自动加样，采用双柱蛋白水解氨基酸程序进行氨基酸分析。分析条件：固定相：AA-10型阳离子交换柱，柱床体积：长柱2.8 mm×200 mm，短柱2.8 mm×50 mm，柱温变化范围：45～55℃。流动相：用柠檬酸钠缓冲液阶梯梯度洗脱，流速：缓冲液流速10 ml/h，茚三酮流速5 ml/h。检测波长：440 nm，570 nm。
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1.3.3 数据处理 由氨基酸标准品分析的面积和浓度在HP积分仪上计算出校正因子，然后根据待测pPDGF水解样品分析的面积和校正因子求出待测pPDGF样品的氨基酸浓度。样品的氨基酸浓度用μmol/g表示。
1.4 pPDGF的等电点测定
1.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备 取10 cm×13 cm×0.2 cm玻璃板3块，取一张玻璃纸用蒸馏水浸湿，将其平整地铺于玻璃板上，将玻璃纸四周反折包边，再用另一玻璃板压住反折过去的玻璃纸，用滤纸吸干玻璃纸表面的水渍。在玻璃纸四周放一厚1 mm的橡胶框，再放上一块玻璃板，四周用夹子夹紧。按下述配方制备6%聚丙烯酰胺凝胶。单体母液 2.0 ml，两性电解质(pH 3.5～9.5) 0.4 ml，两性电解质(pH 7.5～10.5) 0.1 ml，97%甘油 1.0 ml，10%过硫酸铵50 μl，蒸馏水6.4 ml。将各试剂充分混匀，用注射器将其加入模具中，封口平放使胶体聚合为凝胶，过夜备用。
, 百拇医药
1.4.2 样品的预处理 将待测pPDGF样品、pI标准品(pI 4.7～10.6)溶于1%甘氨酸，备用。
1.4.3 电泳 打开LKB 2117多用电泳槽盖，于冷却板上滴少许1%Triton X-100作为绝缘剂，铺上模板。将预先作好的6%凝胶连同玻璃纸平铺于模板上，将凝胶边缘与模板上的线对齐。将预先处理好的待测样品及pI标准品用1 cm×0.5 cm的滤纸浸润后，贴于凝胶表面。取0.8 cm宽的滤纸4层，长度与凝胶宽度相同，将滤纸分别在阴、阳极电极液中浸湿，作为电极条。将电极条置于凝胶两侧，轻压使电极条与凝胶两端贴紧。将电极放在电极条上通电，电压 1 500 V，电流50 mA，功率1 W/cm宽凝胶。电泳1 h后，去掉贴附于凝胶表面的点样滤纸，继续通电1 h。
1.4.4 染色 将电泳后的凝胶取出，置于12.5%三氯醋酸中固定30 min，再置入平衡液中20 min后取出凝胶，放入染色液中染色50 min，最后将凝胶放入洗脱液中洗脱染料，至背景干净为止。
, 百拇医药
1.4.5 pI值的计算 待凝胶自然干燥后，以pI蛋白质标准品在凝胶的迁移距离为横座标，以pI蛋白标准品的pH值(pI)为纵座标，绘制出pH梯度曲线。根据pH梯度曲线与待测pPDGF样品在凝胶中的迁移距离，求出pPDGF的pI值。
2 结 果
2.1 pPDGF的氨基酸含量和组分 pPDGF经酸水解后，测定、分析结果显示，pPDGF含有17种氨基酸，其各氨基酸的含量和组分见表1。
表 1 pPDGF的氨基酸含量总结
Tab 1 Summary of amino acids content of pPDGF Amino acid
Content (mB/μmol.g-1)
, 百拇医药
Composition (%)
Ala(A)
714.33
7.97
Asp(D)
473.53
5.28
Phe(F)
192.28
2.16
His(H)
293.47
, 百拇医药
3.27
Lys(K)
679.28
7.56
Met(M)
153.65
1.73
Arg(R)
894.03
9.97
Thr(T)
496.88
5.54
, 百拇医药
Tyr(Y)
58.40
0.65
Cys(C)
425.01
4.75
Glu(E)
1050.38
11.74
Gly(G)
639.75
7.15
Ile(I)
, 百拇医药
383.67
4.28
Leu(L)
787.11
8.28
Pro(P)
537.32
5.98
Ser(S)
516.43
5.75
Val(V)
668.31
, http://www.100md.com
7.44
2.2 pPDGF的等电点 聚丙烯酰胺等电聚焦的结果显示，电泳后，从正极到负极，等电点渐增，pI值渐增，标准蛋白质pH值为4.7～10.6，pPDGF的pH值为9.8～10.3，在电泳带上表现为一个碱性范围(图1)。
图 1 pPDGF的等电点分析
Fig 1 Isoelectric point analysis of pPDGF
A:pI of standard protein ; B:pI OF pPDGF
3 讨 论
通过对蛋白质的氨基酸组成成分的研究，进而了解蛋白质的氨基酸序列，对于认识蛋白质的二、三级结构以及其生物学作用具有重要的意义，因此，氨基酸分析对蛋白质的组成和结构的研究十分必要。氨基酸分离、测定的方法较多，酸水解法分析蛋白质的氨基酸组成是氨基酸分析中常用的方法，在该方法中除了色氨酸被破坏不能被检测外，其余17种L-型氨基酸均可得到测定[5]。由于酸水解，谷氨酰胺水解为谷氨酸，天冬酰胺水解为天冬氨酸，但能基本反映蛋白质的组成成分。由PDGF的氨基酸组成分析发现，pPDGF含有较多的碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸分别占7.56%，9.97%和3.27%，其碱性氨基酸组分共占20.8%，说明pPDGF是一种碱性蛋白质，与其等电点为9.8～10.3是一致的。半胱氨酸含量为425.01 μmol/g，占pPDGF组成成分的4.75%，虽然数量不多，但半胱氨酸对于形成和维系PDGF亚基的二硫键，保持其三级结构和生物学活性起着十分重要的作用。本研究中酪氨酸含量为58.40 μmol/g，虽然只占0.65%，但已表明提取的pPDGF含有少量的酪氨酸。有文献[6]报道成熟的PDGF-BB无酪氨酸的存在，这也是PDGF A链与B链的区别。我们分析这可能有以下原因：(1) pPDGF主要含有PDGF-BB，但也可能有少量的PDGF其他类型的二聚体，即有PDGF-A链的存在；(2) 有无其他杂蛋白的存在。我们进行了重复试验仍发现有酪氨酸的存在，除外了测试误差。因此对pPDGF的二聚体的类型需作进一步的研究，并有必要对pPDGF作进一步的纯化。
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聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦是利用两性电解质载体，沿分离凝胶在电场中建立一个从正极到负极依次增加的pH梯度。在pH梯度环境中，加入含有不同pI的蛋白质混合样品进行电泳，蛋白质样品在电场的作用下无论它们的原始分布如何(或在正极端，或在负极端，或分布在整个凝胶中)，经过一定的时间后，样品中各组分都将分别聚焦在pH等于各自pI的区域，形成蛋白质电泳带，分别测定样品各组分聚焦部位凝胶的pH值，就可以得到各自的pI[7]。本实验中pPDGF的pI为9.8～10.3，表明pPDGF是一种强碱性蛋白质，为强阳离子多肽，提示pPDGF可能含有相对较多的碱性氨基酸。PDGF不仅在碱性环境中表现出其生物学活性，在其他的pH值范围内也保持其生物学活性[6，8]。而极碱性蛋白如组蛋白、鱼精蛋白可以抑制PDGF与其受体的结合[9]。这一现象可能与PDGF的pI特性有关。
【参考文献】
[1]Harker LA.Physiology and clinical applications of platelet growth factors[J].Curr Opin Hematol,1999,6(3):127-134.
, http://www.100md.com
[2]任雨笙,陈 强,贾国良,等.猪血小板衍化生长因子的提取和纯化[J].第二军医大学学报,2000,21(3):246-249
[3]刘智广,陈镔复,苏成芝.蛋白质水解液氨基酸分析用茚三酮试剂和缓冲液的研制[J].第四军医大学学报,1990,11(3)：218-219.
[4]刘智广,陈镔复.蛋白质酸水解方法的改进[J].第四军医大学学报,1992,13(3)：231-233.
[5]汲言山.蛋白质的结构与功能.见:孙志贤主编.现代生物化学理论与研究技术[M].北京：军事医学科学出版社,1995.9-24.
[6]Hart CE,Bailey M,Curtis DA,et al.Purification of PDGF-AB and PDGF-BB from human platelet extracts and identification of all three PDGF dimmers in human platelets[J].Biochemistry,1990,29(1):166-172.
, 百拇医药
[7]刘晓颖.凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点.见:张龙翔,吴国利主编.高级生物化学实验选编[M].北京：高等教育出版社,1989.23-29.
[8]Craig S,Clements JM,Cook AL,et al.Characterization of the structure and conformation of platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and proteinase-resistant mutants of PDGF-BB expressed in Saccharomyces cerevisiae[J].Biochem J,1992,281 (Pt 1):67-72。
[9]张宏权.血小板衍化生长因子.见:周廷冲主编,多肽生长因子基础与临床[M].北京：中国科学技术出版社,1992.163-186.
【收稿日期】1999-11-12
【修回日期】2000-02-12, 百拇医药
单位：
关键词：血小板衍生生长因子；氨基酸测序；等电点
第二军医大学学报000420 【摘要】目的：测定猪血小板衍生生长因子的氨基酸组成和等电点。方法：用酸水解及聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的方法测定猪血小板衍生生长因子的氨基酸含量、组成成分和等电点。结果：酸水解法测定的猪血小板衍生生长因子含有17种不同的氨基酸，其中含有相对较多的碱性氨基酸，其等电点为9.8～10.3。结论：猪血小板衍生生长因子是一种强阳离子多肽，含有相对较多的碱性氨基酸，与其等电点为9.8～10.3是一致的。
【中图分类号】Q 571 【文献标识码】A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0369-03
, 百拇医药
Amino acid composition and isoelectric point analysis of porcine platelet-derived growth factor
REN Yu-Sheng,WU Zong-Gui
(Department of Cardiovasology，Changzheng Hospital， Second Military Medical University,Shanghai 200003,China)
CUI Fang,JIA Guo-Liang
(Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)
, http://www.100md.com CHEN Qiang
(School of Stomatology)
WANG Zeng-Lu,ZHANG Ying-Qi
(Biotechnology Center)
【ABSTRACT】Objective:To determine the amino acid composition and isoelectric point of porcine platelet-derived growth factor.Methods:In the present experiment,acid dehydroxy amino acid analysis and isoelectric focusing in polyacylamide gels were used and the amino acid composition and isoelectric point of porcine platelet-derived growth factor were studied.Results:The findings of acid dehydroxy amino acid analysis and isoelectric focusing in polyacylamide gels showed that,porcine platelet-derived growth factor contained 17 amino acid residues in which the protein was rich in the strong predominance of basic amino acid and its isoelectric point was in the range of 9.8-10.3.Conclusion:Porcine platelet-derived growth factor is a strongly positive ionic polypeptide and may contain the strong predominance of basic amino acids in its amino acids composition,as reflected by the isoelectric point range of 9.8-10.3.
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【KEY WORDS】platelet-derived growth factor； amino acid,sequencing isoelectric focusing； isoelectric point
血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是具有广泛生物学作用的大分子蛋白质[1]。氨基酸分析是研究蛋白质的基本方法之一，对蛋白质的组成和结构分析具有重要的意义，它广泛应用于医学、分子生物学等许多领域。而对多肽、蛋白质等生物大分子的理化性质的研究，首先要了解所研究的大分子保持其生物学活性和可溶性的pH范围，因此对蛋白质的等电点(isoelectric point，pI)的研究也是十分重要的。本实验在已提取和纯化猪血小板衍生生长因子[2](porcine platelet-derived growth factor,pPDGF)的基础上，采用酸水解法及聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的方法测定pPDGF中不同氨基酸的含量和等电点，分析pPDGF的氨基酸组成及其意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 主要试剂 pPDGF(第四军医大学生物技术中心)[2]。100 μmol/L 17种氨基酸标准液 (Beckman Co.)。4 mol/L醋酸锂缓冲液(pH5.2)：氢氧化锂95.84 g，冰醋酸293 ml，加蒸馏水至1 000 ml。茚三酮溶液：二甲亚砜 675 ml，醋酸锂缓冲液 225 ml，水合茚三酮 189 g，硼氢化钠 75 ml。柠檬酸钠缓冲液，配制参见文献[3]。30.8%单体母液：丙烯酰胺30 g，双丙烯酰胺0.8 g，加蒸馏水至100 ml，过滤后4℃贮藏。40%两性电解质(Ampholine，Pharmacia-LKB Co.)。平衡液与洗脱液：乙醇100 ml，冰醋酸32 ml，加蒸馏水268 ml。染色液：平衡液500 ml，考马斯亮蓝R-250 500 mg，过滤备用。pI标准品(pI 4.7～10.6)(Pharmacia-LKB)。电极液：阴极1 mol/L NaOH，阳极1 mol/L H3PO4。Triton X-100 (Gibco Co.) 。
, 百拇医药
1.2 主要仪器 氨基酸水解管，121MB氨基酸分析仪(Beckman Co.)，AA-10型阳离子交换柱(Beckman Co.)，恒温烤箱(上海爱斯佩克仪器有限公司)，TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。 LKB2117多用电泳槽 (Pharmacia Co.) 。LKB电泳仪 (Pharmacia Co.) 。
1.3 pPDGF的氨基酸分析
1.3.1 样品酸水解 按刘智广等[4]的方法，取pPDGF样品200 μg，置于水解管中；加入6 mol/L盐酸2 ml，向水解管中充入氮气30 s后立即封管。将水解管置于烤箱中110℃水解22 h。待自然冷却后，将水解液移入坩锅内水浴干燥，待蒸干后再加入去离子水，再蒸干，重复2次。最后加入柠檬酸缓冲液(pH 2.2)，溶解pPDGF水解样品，离心后备用。
1.3.2 水解样品氨基酸分析 将pPDGF水解样品和17种氨基酸标准液在121MB氨基酸分析仪上，样品自动加样，采用双柱蛋白水解氨基酸程序进行氨基酸分析。分析条件：固定相：AA-10型阳离子交换柱，柱床体积：长柱2.8 mm×200 mm，短柱2.8 mm×50 mm，柱温变化范围：45～55℃。流动相：用柠檬酸钠缓冲液阶梯梯度洗脱，流速：缓冲液流速10 ml/h，茚三酮流速5 ml/h。检测波长：440 nm，570 nm。
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1.3.3 数据处理 由氨基酸标准品分析的面积和浓度在HP积分仪上计算出校正因子，然后根据待测pPDGF水解样品分析的面积和校正因子求出待测pPDGF样品的氨基酸浓度。样品的氨基酸浓度用μmol/g表示。
1.4 pPDGF的等电点测定
1.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备 取10 cm×13 cm×0.2 cm玻璃板3块，取一张玻璃纸用蒸馏水浸湿，将其平整地铺于玻璃板上，将玻璃纸四周反折包边，再用另一玻璃板压住反折过去的玻璃纸，用滤纸吸干玻璃纸表面的水渍。在玻璃纸四周放一厚1 mm的橡胶框，再放上一块玻璃板，四周用夹子夹紧。按下述配方制备6%聚丙烯酰胺凝胶。单体母液 2.0 ml，两性电解质(pH 3.5～9.5) 0.4 ml，两性电解质(pH 7.5～10.5) 0.1 ml，97%甘油 1.0 ml，10%过硫酸铵50 μl，蒸馏水6.4 ml。将各试剂充分混匀，用注射器将其加入模具中，封口平放使胶体聚合为凝胶，过夜备用。
, 百拇医药
1.4.2 样品的预处理 将待测pPDGF样品、pI标准品(pI 4.7～10.6)溶于1%甘氨酸，备用。
1.4.3 电泳 打开LKB 2117多用电泳槽盖，于冷却板上滴少许1%Triton X-100作为绝缘剂，铺上模板。将预先作好的6%凝胶连同玻璃纸平铺于模板上，将凝胶边缘与模板上的线对齐。将预先处理好的待测样品及pI标准品用1 cm×0.5 cm的滤纸浸润后，贴于凝胶表面。取0.8 cm宽的滤纸4层，长度与凝胶宽度相同，将滤纸分别在阴、阳极电极液中浸湿，作为电极条。将电极条置于凝胶两侧，轻压使电极条与凝胶两端贴紧。将电极放在电极条上通电，电压 1 500 V，电流50 mA，功率1 W/cm宽凝胶。电泳1 h后，去掉贴附于凝胶表面的点样滤纸，继续通电1 h。
1.4.4 染色 将电泳后的凝胶取出，置于12.5%三氯醋酸中固定30 min，再置入平衡液中20 min后取出凝胶，放入染色液中染色50 min，最后将凝胶放入洗脱液中洗脱染料，至背景干净为止。
, 百拇医药
1.4.5 pI值的计算 待凝胶自然干燥后，以pI蛋白质标准品在凝胶的迁移距离为横座标，以pI蛋白标准品的pH值(pI)为纵座标，绘制出pH梯度曲线。根据pH梯度曲线与待测pPDGF样品在凝胶中的迁移距离，求出pPDGF的pI值。
2 结 果
2.1 pPDGF的氨基酸含量和组分 pPDGF经酸水解后，测定、分析结果显示，pPDGF含有17种氨基酸，其各氨基酸的含量和组分见表1。
表 1 pPDGF的氨基酸含量总结
Tab 1 Summary of amino acids content of pPDGF Amino acid
Content (mB/μmol.g-1)
, 百拇医药
Composition (%)
Ala(A)
714.33
7.97
Asp(D)
473.53
5.28
Phe(F)
192.28
2.16
His(H)
293.47
, 百拇医药
3.27
Lys(K)
679.28
7.56
Met(M)
153.65
1.73
Arg(R)
894.03
9.97
Thr(T)
496.88
5.54
, 百拇医药
Tyr(Y)
58.40
0.65
Cys(C)
425.01
4.75
Glu(E)
1050.38
11.74
Gly(G)
639.75
7.15
Ile(I)
, 百拇医药
383.67
4.28
Leu(L)
787.11
8.28
Pro(P)
537.32
5.98
Ser(S)
516.43
5.75
Val(V)
668.31
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7.44
2.2 pPDGF的等电点 聚丙烯酰胺等电聚焦的结果显示，电泳后，从正极到负极，等电点渐增，pI值渐增，标准蛋白质pH值为4.7～10.6，pPDGF的pH值为9.8～10.3，在电泳带上表现为一个碱性范围(图1)。
图 1 pPDGF的等电点分析
Fig 1 Isoelectric point analysis of pPDGF
A:pI of standard protein ; B:pI OF pPDGF
3 讨 论
通过对蛋白质的氨基酸组成成分的研究，进而了解蛋白质的氨基酸序列，对于认识蛋白质的二、三级结构以及其生物学作用具有重要的意义，因此，氨基酸分析对蛋白质的组成和结构的研究十分必要。氨基酸分离、测定的方法较多，酸水解法分析蛋白质的氨基酸组成是氨基酸分析中常用的方法，在该方法中除了色氨酸被破坏不能被检测外，其余17种L-型氨基酸均可得到测定[5]。由于酸水解，谷氨酰胺水解为谷氨酸，天冬酰胺水解为天冬氨酸，但能基本反映蛋白质的组成成分。由PDGF的氨基酸组成分析发现，pPDGF含有较多的碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸分别占7.56%，9.97%和3.27%，其碱性氨基酸组分共占20.8%，说明pPDGF是一种碱性蛋白质，与其等电点为9.8～10.3是一致的。半胱氨酸含量为425.01 μmol/g，占pPDGF组成成分的4.75%，虽然数量不多，但半胱氨酸对于形成和维系PDGF亚基的二硫键，保持其三级结构和生物学活性起着十分重要的作用。本研究中酪氨酸含量为58.40 μmol/g，虽然只占0.65%，但已表明提取的pPDGF含有少量的酪氨酸。有文献[6]报道成熟的PDGF-BB无酪氨酸的存在，这也是PDGF A链与B链的区别。我们分析这可能有以下原因：(1) pPDGF主要含有PDGF-BB，但也可能有少量的PDGF其他类型的二聚体，即有PDGF-A链的存在；(2) 有无其他杂蛋白的存在。我们进行了重复试验仍发现有酪氨酸的存在，除外了测试误差。因此对pPDGF的二聚体的类型需作进一步的研究，并有必要对pPDGF作进一步的纯化。
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聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦是利用两性电解质载体，沿分离凝胶在电场中建立一个从正极到负极依次增加的pH梯度。在pH梯度环境中，加入含有不同pI的蛋白质混合样品进行电泳，蛋白质样品在电场的作用下无论它们的原始分布如何(或在正极端，或在负极端，或分布在整个凝胶中)，经过一定的时间后，样品中各组分都将分别聚焦在pH等于各自pI的区域，形成蛋白质电泳带，分别测定样品各组分聚焦部位凝胶的pH值，就可以得到各自的pI[7]。本实验中pPDGF的pI为9.8～10.3，表明pPDGF是一种强碱性蛋白质，为强阳离子多肽，提示pPDGF可能含有相对较多的碱性氨基酸。PDGF不仅在碱性环境中表现出其生物学活性，在其他的pH值范围内也保持其生物学活性[6，8]。而极碱性蛋白如组蛋白、鱼精蛋白可以抑制PDGF与其受体的结合[9]。这一现象可能与PDGF的pI特性有关。
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【收稿日期】1999-11-12
【修回日期】2000-02-12, 百拇医药