严重烧伤后特异抗白念菌IgA下降与白念菌粘附定植的关系
作者：白晓东 刘贤华 肖光夏
单位：白晓东(第三军医大学附属 西南医院烧伤研究所)；刘贤华(预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆 4000 38)；肖光夏(第三军医大学附属 西南医院烧伤研究所)
关键词：烧伤；IgA；白色念珠菌；细菌定植；小鼠
第三军医大学学报000411 提 要： 目的 对烧伤后早期肠内特异抗白念菌IgA变化 及其白念菌粘附肠粘膜的关系进行观察。方法 利用无特殊病原菌(SPF) 的小鼠定植白念菌模型，致以20%TBSAⅢ度烧伤。ELISA法检测伤前及伤后1、2、3 d的肠内 特异抗白念菌IgA水平；同时选择培养并计数盲肠及小肠粘膜表面粘附的白念菌。 结果 伤前组特异IgA为(69.37±25.37)U/mg，伤后1 d为(48.84±26.47)U/mg，2 d明显降为(38.22±23.57)U/mg，3 d为(52.64±37.35)U/mg；肠内白念菌总量伤后第1天最 高；伤后第2、3天粘附菌量明显升高。结论 特异IgA下降与肠粘膜表面 粘附菌量增多密切相关。
, 百拇医药
中图法分类号： R392.11;R644 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0338-03
Study of the relationship of the decline of specific IgA to adherent co lonization of Candida albicans after severe burns in mice
BAI Xiao-dong, LIU Xian-hua, XIAO Guang-xia
(Institute of Burn Research, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
Abstract： Objective To study the relationship of the decli ne of specific IgA antibody in the intestine to the adherence of Candida alb icans to intestinal mucosa in the early stage after severe burns in mice . Methods SPF mice were inoculated with Candida albicans 14 days b efore the animals were inflicted with 20% TBSA full thickness burns. The level o f specific IgA against C.albicans in the intestine was determine d before and 1, 2 and 3 days after burn injury. C. albicans clonies on the m ucous membra ne of the cecum and small intestine was selectively cultured and counted. Results The decrease of the level of specific IgA was positively corr elated to the increase of the number of C.albicans colonies on t he intestina l mucosa. Conclusion The decline of specific IgA showed strong correlation to the increased amount of candida adhence to intes tinal mucosa.
, 百拇医药
Key words： burns; IgA; Candida albicans; co lonization; mouse▲
白色念珠菌是烧伤后常见的条件致病真菌，以往研究证实，烧伤后早期肠内即有真菌的 优势定植[1]。在局部肠内屏障中，粘膜免疫抗体屏障是支柱之一，过去许多文献 证实烧伤后早期局部抗体IgA有明显下降[2]，但处于检测总IgA水平阶段。目前认 为，不同的抗原种类诱生的IgA抗体特异性不同[3]。深入研究烧伤后肠腔内特异抗 白念菌IgA水平变化与白念菌定植与粘附的相互关系，对于阐明局部抗体变化如何导致肠粘 膜屏障功能下降，显然十分必要。本研究利用无特殊病原菌小鼠白念菌定植模型，对烧伤后早期局部抗体变化与白念菌定植粘附的关系进行 初步探讨。
1 材料与方法
1.1 动物分组、给菌及致伤
, http://www.100md.com
无特殊病原菌(Special pathogene free,SPF)小鼠87只，本校动物中心提供，5周龄，( 20±2)g。设正常对照组(Control)，烧伤前组(Pre-burn)，烧伤组(Post-burn)，后两组 动物给菌：白色念珠菌标准株(cmcc44104)为本所保存菌株，在沙氏平板上增菌，生理盐水 冲洗收集，调菌悬液至1.5×109 cfu/ml，每只动物经口喂入0.5 ml菌悬液，隔离饲养。 在给菌后14 d时，烧伤组动物背部剃毛后经3%凝固汽油烧7 s，致以20%烧伤总面积(Total b urn surface area,TBSA)Ⅲ度烧伤。活杀：脱颈处死对照组及烧伤前组动物；烧伤组于烧伤 后1、2、3 d处死。
1.2 取材
动物活杀后，无菌取盲肠、末段回肠。其余取剩余全段小肠，在4°C下，平铺于滤纸上 ，纵行剖开，充分清洗内容物，用玻片刮取粘液约0.1 ml，-20°C保存。
, 百拇医药
1.3 白色念珠菌选择培养
盲肠内白念菌总数 取完整盲肠，称重后置于5 ml生理盐水匀浆，系列稀释后取0.1 ml均匀涂布于沙氏选择平板(内含高浓度伊米配能)，37°C下培养72 h，计数阳性菌落，并 换算出每克组织的菌落数。
肠粘膜表面粘附数量[4] 取末端回肠，经无菌程序及15 ml灭菌生理盐水彻 底冲洗肠腔，称重后入5 ml生理盐水混匀，取0.1 ml均匀涂布于沙氏选择平板表面，37°C 培养72 h，计数阳性菌落，并换算出组织中的菌落数。
1.4 肠粘液中特异抗白念菌IgA抗体的检测[5]
取肠粘液，用0.5 ml PBS(pH 7.2, 0.01 mol/L)充分混匀，离心5 000 r/min，5 min， 取上清待测。
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白色念珠菌经10%甲醛缓冲液固定过夜，次日用生理盐水充分洗涤。调菌液至3.0×10 8/ml，每孔100 μl包被96孔酶联板，4°C，72 h倾去，PBS洗3次。用0.5% BSA PBS液封闭 30 min，倾去后每孔直接加入100 μl粘液上清，37°C，1 h。PBS洗涤3次，加入HRP标记抗 鼠IgA(Sigma公司，1∶250)，27°C，1 h。OPD显色半小时，2 mol/L H2SO4 1滴终止， 492 nm比色读取D492值。0.5% BSA为阴性对照。
特异IgA相对定量：取经预实验已测其阳性的10只小鼠粘液上清，做1∶1，1∶2，1∶8 ，1∶16稀释，以1∶1时设定为1 000 U/ml。以上设定标准品与样本同时测定。制定 标准曲线。
粘液上清同时测总蛋白含量。
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1.5 统计学处理
采用第四军医大学SPLM软件作方差分析。
2 结果
2.1 烧伤后白念菌数量变化
盲肠内白念菌总数在伤后变化较大，伤后24 h明显增加，但至伤后2、3 d就基本恢复正 常。而粘附至肠粘膜表面的白念菌数量以伤后2 d最高，伤后3 d略有下降，但仍高于正常水 平，见表1。
2.2 伤后特异抗白念菌IgA的变化
定植白念菌后特异IgA水平明显升高，但烧伤后其含量有所降低，以伤后2 d最明显， 仅为伤前平均水平的一半左右，见表2。
表1 白色念珠菌数量变化
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Tab 1 Change of the amount of camdida albicans (cfu/g)
Cecum content (×105)
Adherence to intes tine
Control (n=19)
0
0
Pre-burn (n=25)
3.23±7.63
231.77±321.64
Post-burn 1 d (n=19)
, 百拇医药
14.77±38.71△
270.57±313. 35
2 d (n=12)
0.23±0.16
1663.58±2559.00△
3 d (n=12)
0.26±0.31
449.33±353.22△
△:P< 0.05 vs pre-burn 表2 肠腔内抗白色念珠菌特异IgA水平
Tab 2 Specific IgA to candida in intestine
, http://www.100md.com
Postive rate
IgA contents (U/mg)
Control (n=19)
6(32%)
18.63±6.87
Pre-burn (n=25)
10(40%)
69.37±25.37△
Post-burn 1 d (n=19)
9(47%)
48.84±26.47△ ※
, http://www.100md.com
2 d (n=12)
9(57%)
38.22±23.57△ ※
3 d (n=12)
5(42%)
52.64±37.35△ ※
△：P< 0.05 vs control;※：P< 0.05 vs pre-burn3 讨论
本研究利用SPF动物模型及选择培养技术，可以直接观察肠内白色念珠菌的粘附数量变 化。S PF动物肠内本无真菌，给人外源性白色念珠菌后，真菌选择培养的结果直接反映白色念珠菌 数量，这样优点有：①避免了普通动物可能携带的念珠菌对结果的影响；②可长期观察所给 入白念菌的定植变化，而同位素和荧光标记菌的观察则有时限性。
, 百拇医药
烧伤特异抗白念菌IgA水平下降与肠粘膜表面白念菌数量密切相关：伤后1 d，特异IgA 与伤前相比，略有下降，此时粘膜表面粘附菌量与伤前无明显差别；伤后2 d，特异IgA水平 显著下降，粘附菌量也远高于伤前水平；伤后3 d，特异IgA水平略有回升，粘附菌量亦降至 (449.33±353.22)cfu/g。而盲肠内总菌量由粘附粘膜表面菌量和肠内容物中菌量构成，伤 后总菌量亦有变化，以伤后1 d为最高，伤后2、3 d已与正常无明显差别。说明总菌量的变 化与 特异IgA以及其它一些因素有关，如肠蠕动情况。伤后第1天，肠内白念菌数量虽然较多，但 此时肠内特异IgA水平尚处于较高水平，因此粘附至肠粘膜表面的白念菌数量并无明显增多 ；而伤后2 d IgA水平下降明显，粘附菌量显著增加；由此可见，特异抗白念菌IgA在抑制白 念菌粘附肠粘膜方面起着重要作用。
基金项目：全军“九五”攻关项目(96L042)
作者简介：白晓东(1969-)，男，山西省太原市人，博士，主 治医师，主要从事烧伤感染方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754149-8041
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] 陈 军，张雅萍，肖光夏，等.双歧杆菌制剂防治烧伤鼠肠源性感染 的初步研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1996，16(增刊)：62-64.
[2] 白晓东，粟永萍，刘贤华.严重烧伤后肠粘液成份变化与肠源性感染的关系[ J].中华整形烧伤外科杂志，1996，12(2)：90-92.
[3] Lomm M E. Interaction of antigens and antibodys at mucosal surface [J]. Annu Rev Microbiol,1997,51:311-320.
[4] 郭宁如，沈永军，吕桂霞，等.不同免疫状态下的白念珠菌对小鼠肠粘膜的粘 附及影响[J].中华皮肤科杂志，1994，27(2)：86-87.
[5] Maeve M C. Simont T, Stephen J C. Immunogolbulin A, IgA1, and IgA2 antibodies to candida albican in whole and parotid saliva in human inmmuno-defi ciency virus infection and AIDS[J]. Infection Immun,1994,62(3):892-894.
收稿日期：1999-09-02；修回日期：1999-12-22, 百拇医药
单位：白晓东(第三军医大学附属 西南医院烧伤研究所)；刘贤华(预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆 4000 38)；肖光夏(第三军医大学附属 西南医院烧伤研究所)
关键词：烧伤；IgA；白色念珠菌；细菌定植；小鼠
第三军医大学学报000411 提 要： 目的 对烧伤后早期肠内特异抗白念菌IgA变化 及其白念菌粘附肠粘膜的关系进行观察。方法 利用无特殊病原菌(SPF) 的小鼠定植白念菌模型，致以20%TBSAⅢ度烧伤。ELISA法检测伤前及伤后1、2、3 d的肠内 特异抗白念菌IgA水平；同时选择培养并计数盲肠及小肠粘膜表面粘附的白念菌。 结果 伤前组特异IgA为(69.37±25.37)U/mg，伤后1 d为(48.84±26.47)U/mg，2 d明显降为(38.22±23.57)U/mg，3 d为(52.64±37.35)U/mg；肠内白念菌总量伤后第1天最 高；伤后第2、3天粘附菌量明显升高。结论 特异IgA下降与肠粘膜表面 粘附菌量增多密切相关。
, 百拇医药
中图法分类号： R392.11;R644 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0338-03
Study of the relationship of the decline of specific IgA to adherent co lonization of Candida albicans after severe burns in mice
BAI Xiao-dong, LIU Xian-hua, XIAO Guang-xia
(Institute of Burn Research, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
Abstract： Objective To study the relationship of the decli ne of specific IgA antibody in the intestine to the adherence of Candida alb icans to intestinal mucosa in the early stage after severe burns in mice . Methods SPF mice were inoculated with Candida albicans 14 days b efore the animals were inflicted with 20% TBSA full thickness burns. The level o f specific IgA against C.albicans in the intestine was determine d before and 1, 2 and 3 days after burn injury. C. albicans clonies on the m ucous membra ne of the cecum and small intestine was selectively cultured and counted. Results The decrease of the level of specific IgA was positively corr elated to the increase of the number of C.albicans colonies on t he intestina l mucosa. Conclusion The decline of specific IgA showed strong correlation to the increased amount of candida adhence to intes tinal mucosa.
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Key words： burns; IgA; Candida albicans; co lonization; mouse▲
白色念珠菌是烧伤后常见的条件致病真菌，以往研究证实，烧伤后早期肠内即有真菌的 优势定植[1]。在局部肠内屏障中，粘膜免疫抗体屏障是支柱之一，过去许多文献 证实烧伤后早期局部抗体IgA有明显下降[2]，但处于检测总IgA水平阶段。目前认 为，不同的抗原种类诱生的IgA抗体特异性不同[3]。深入研究烧伤后肠腔内特异抗 白念菌IgA水平变化与白念菌定植与粘附的相互关系，对于阐明局部抗体变化如何导致肠粘 膜屏障功能下降，显然十分必要。本研究利用无特殊病原菌小鼠白念菌定植模型，对烧伤后早期局部抗体变化与白念菌定植粘附的关系进行 初步探讨。
1 材料与方法
1.1 动物分组、给菌及致伤
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无特殊病原菌(Special pathogene free,SPF)小鼠87只，本校动物中心提供，5周龄，( 20±2)g。设正常对照组(Control)，烧伤前组(Pre-burn)，烧伤组(Post-burn)，后两组 动物给菌：白色念珠菌标准株(cmcc44104)为本所保存菌株，在沙氏平板上增菌，生理盐水 冲洗收集，调菌悬液至1.5×109 cfu/ml，每只动物经口喂入0.5 ml菌悬液，隔离饲养。 在给菌后14 d时，烧伤组动物背部剃毛后经3%凝固汽油烧7 s，致以20%烧伤总面积(Total b urn surface area,TBSA)Ⅲ度烧伤。活杀：脱颈处死对照组及烧伤前组动物；烧伤组于烧伤 后1、2、3 d处死。
1.2 取材
动物活杀后，无菌取盲肠、末段回肠。其余取剩余全段小肠，在4°C下，平铺于滤纸上 ，纵行剖开，充分清洗内容物，用玻片刮取粘液约0.1 ml，-20°C保存。
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1.3 白色念珠菌选择培养
盲肠内白念菌总数 取完整盲肠，称重后置于5 ml生理盐水匀浆，系列稀释后取0.1 ml均匀涂布于沙氏选择平板(内含高浓度伊米配能)，37°C下培养72 h，计数阳性菌落，并 换算出每克组织的菌落数。
肠粘膜表面粘附数量[4] 取末端回肠，经无菌程序及15 ml灭菌生理盐水彻 底冲洗肠腔，称重后入5 ml生理盐水混匀，取0.1 ml均匀涂布于沙氏选择平板表面，37°C 培养72 h，计数阳性菌落，并换算出组织中的菌落数。
1.4 肠粘液中特异抗白念菌IgA抗体的检测[5]
取肠粘液，用0.5 ml PBS(pH 7.2, 0.01 mol/L)充分混匀，离心5 000 r/min，5 min， 取上清待测。
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白色念珠菌经10%甲醛缓冲液固定过夜，次日用生理盐水充分洗涤。调菌液至3.0×10 8/ml，每孔100 μl包被96孔酶联板，4°C，72 h倾去，PBS洗3次。用0.5% BSA PBS液封闭 30 min，倾去后每孔直接加入100 μl粘液上清，37°C，1 h。PBS洗涤3次，加入HRP标记抗 鼠IgA(Sigma公司，1∶250)，27°C，1 h。OPD显色半小时，2 mol/L H2SO4 1滴终止， 492 nm比色读取D492值。0.5% BSA为阴性对照。
特异IgA相对定量：取经预实验已测其阳性的10只小鼠粘液上清，做1∶1，1∶2，1∶8 ，1∶16稀释，以1∶1时设定为1 000 U/ml。以上设定标准品与样本同时测定。制定 标准曲线。
粘液上清同时测总蛋白含量。
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1.5 统计学处理
采用第四军医大学SPLM软件作方差分析。
2 结果
2.1 烧伤后白念菌数量变化
盲肠内白念菌总数在伤后变化较大，伤后24 h明显增加，但至伤后2、3 d就基本恢复正 常。而粘附至肠粘膜表面的白念菌数量以伤后2 d最高，伤后3 d略有下降，但仍高于正常水 平，见表1。
2.2 伤后特异抗白念菌IgA的变化
定植白念菌后特异IgA水平明显升高，但烧伤后其含量有所降低，以伤后2 d最明显， 仅为伤前平均水平的一半左右，见表2。
表1 白色念珠菌数量变化
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Tab 1 Change of the amount of camdida albicans (cfu/g)
Cecum content (×105)
Adherence to intes tine
Control (n=19)
0
0
Pre-burn (n=25)
3.23±7.63
231.77±321.64
Post-burn 1 d (n=19)
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14.77±38.71△
270.57±313. 35
2 d (n=12)
0.23±0.16
1663.58±2559.00△
3 d (n=12)
0.26±0.31
449.33±353.22△
△:P< 0.05 vs pre-burn 表2 肠腔内抗白色念珠菌特异IgA水平
Tab 2 Specific IgA to candida in intestine
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Postive rate
IgA contents (U/mg)
Control (n=19)
6(32%)
18.63±6.87
Pre-burn (n=25)
10(40%)
69.37±25.37△
Post-burn 1 d (n=19)
9(47%)
48.84±26.47△ ※
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2 d (n=12)
9(57%)
38.22±23.57△ ※
3 d (n=12)
5(42%)
52.64±37.35△ ※
△：P< 0.05 vs control;※：P< 0.05 vs pre-burn3 讨论
本研究利用SPF动物模型及选择培养技术，可以直接观察肠内白色念珠菌的粘附数量变 化。S PF动物肠内本无真菌，给人外源性白色念珠菌后，真菌选择培养的结果直接反映白色念珠菌 数量，这样优点有：①避免了普通动物可能携带的念珠菌对结果的影响；②可长期观察所给 入白念菌的定植变化，而同位素和荧光标记菌的观察则有时限性。
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烧伤特异抗白念菌IgA水平下降与肠粘膜表面白念菌数量密切相关：伤后1 d，特异IgA 与伤前相比，略有下降，此时粘膜表面粘附菌量与伤前无明显差别；伤后2 d，特异IgA水平 显著下降，粘附菌量也远高于伤前水平；伤后3 d，特异IgA水平略有回升，粘附菌量亦降至 (449.33±353.22)cfu/g。而盲肠内总菌量由粘附粘膜表面菌量和肠内容物中菌量构成，伤 后总菌量亦有变化，以伤后1 d为最高，伤后2、3 d已与正常无明显差别。说明总菌量的变 化与 特异IgA以及其它一些因素有关，如肠蠕动情况。伤后第1天，肠内白念菌数量虽然较多，但 此时肠内特异IgA水平尚处于较高水平，因此粘附至肠粘膜表面的白念菌数量并无明显增多 ；而伤后2 d IgA水平下降明显，粘附菌量显著增加；由此可见，特异抗白念菌IgA在抑制白 念菌粘附肠粘膜方面起着重要作用。
基金项目：全军“九五”攻关项目(96L042)
作者简介：白晓东(1969-)，男，山西省太原市人，博士，主 治医师，主要从事烧伤感染方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754149-8041
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参考文献：
[1] 陈 军，张雅萍，肖光夏，等.双歧杆菌制剂防治烧伤鼠肠源性感染 的初步研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1996，16(增刊)：62-64.
[2] 白晓东，粟永萍，刘贤华.严重烧伤后肠粘液成份变化与肠源性感染的关系[ J].中华整形烧伤外科杂志，1996，12(2)：90-92.
[3] Lomm M E. Interaction of antigens and antibodys at mucosal surface [J]. Annu Rev Microbiol,1997,51:311-320.
[4] 郭宁如，沈永军，吕桂霞，等.不同免疫状态下的白念珠菌对小鼠肠粘膜的粘 附及影响[J].中华皮肤科杂志，1994，27(2)：86-87.
[5] Maeve M C. Simont T, Stephen J C. Immunogolbulin A, IgA1, and IgA2 antibodies to candida albican in whole and parotid saliva in human inmmuno-defi ciency virus infection and AIDS[J]. Infection Immun,1994,62(3):892-894.
收稿日期：1999-09-02；修回日期：1999-12-22, 百拇医药