三七抗肝纤维化的实验研究

http://www.100md.com 《第三军医大学学报》 2000年第4期

     作者：张荣华 周子成 洪多伦 艾九松

    单位：张荣华(第三军医大学附 属西南医院中医科)；周子成(消化内科；重庆 400038)；洪多伦(第三军医大学附 属西南医院中医科)；艾九松(第三军医大学附 属西南医院中医科)

    关键词：肝纤维化；三七；透明质酸；层粘连蛋白；病理学；大鼠

    第三军医大学学报000402 提 要： 目的 探讨三七对四氯化碳(CCl₄ )中毒性肝纤维化的防治作用。方法 复制大鼠CCl₄中毒性肝纤维化模 型，并以秋水仙碱作为阳性治疗对照。采用光镜、电镜观察组织学改变，测定血清丙氨酸氨 基转移酶(ALT)、白蛋白、球蛋白、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、肝组织羟脯氨酸(Hyp) 含量，以反映肝细胞损伤及肝纤维化程度。将形态改变与功能变化相结合，对比分析三七对 CCl₄中毒性肝纤维化的防治作用。结果 三七治疗后肝细胞损害、肝 脏脂肪变性、炎细胞浸润的程度均较轻，成纤维细胞和胶原纤维增生亦较少。结 论：三七对肝细胞损伤有一定保护作用，并可明显抑制肝组织中成纤维细胞及胶 原纤维增生，是较理想的防治肝纤维化的药物。

    中图法分类号： R575.205 文献标识码：A

    文章编号：1000-5404(2000)04-0307-03

    Effects of Panax Notogenseng on CCl₄-induced liver fibrosis in rats

    ZHANG Rong-hua, ZHOU Zi-cheng, HONG Duo-lun, AI Jiu-song

    (Department of Traditional Chinese Medicine, Southwest Hospital, Third Militar y Medical University, Chongqing 400038,China)

    Abstract： Objective To investigate the effects of Panax No toginseng (PN) on liver fibrosis (LF) induced with CCl₄. Methods The model of CCl₄-induced LF was established in rats and they were treat ed with PN or colchicine (Col). The histological changes were obseved with light and electron microscopy. Serum level of alanine aminotransferase (ALT), albumin , globulin, hyaluronic acid (HA) and laminin (LN) and hydroxyproline (Hyp) in li ver tissues were determined to reveal the extent of liver damages. The Col-trea ted group served as the positive control. Results The extent of liver damages, fatty degeration and infiltration of inflammatory cells were les s severe in the PN treated group than in the Col-treated group. The formation o f fibroblasts and collagenous fibers was less in amount in the PN-treated group than in the Col-treated group.Conclusion PN exerts a pro tective effect on CCl₄-induced LF in rats and inhibits the formation of fibro blasts and collagenous fibers in liver tissues.

    Key words： liver fibrosis; therapy; Panax Notoginseng; hyal uronic acid; laminin; pathology; rat▲

    肝纤维化造成肝功异常，影响肝病预后，是慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段。因此， 防治肝纤维化具有重要意义。目前，国内外尚缺乏理想的抗肝纤维化的药物，中医中药的应 用具有广阔的前景。为探讨三七的抗肝纤维化作用，我们采用四氯化碳(Carbon tetrachlor ide,CCl₄)中毒诱导的大鼠肝纤维化模型，研究三七对某些血清学指标、肝组织羟脯氨 酸(Hydroxypro-line,Hyp)含量变化和肝组织病理形态改变的影响，并与秋水仙碱的抗肝纤维 化作用进行对比分析，为进一步研究三七防治肝纤维化作用和机制及指导临床应用提供理论 依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物

    健康雄性Wistar大鼠107只，SPF级，体重180～210 g，由第三军医大学动物中心提供。

    1.2 药物及其配制

    生三七粉(贵阳中药厂)制成3%、6%、12%混悬液，秋水仙碱(法国HOUDE实验室)制成0.00 25%混悬液，4°C保存。

    1.3 肝纤维化模型

    每只大鼠首次后腿皮下注射纯CCl₄(重庆化学试剂厂)0.05 ml/kg，以后注射40%C Cl₄橄榄油0.03 ml/kg(V/V)，每周2次，共9周。

    1.4 动物分组及给药

    将实验动物随机分为4组：①空白对照组(Control group)，大鼠接受橄榄油(上海卫辉 化学试剂厂)后腿皮下注射，首次0.05 ml/kg，以后0.03 ml/kg，每周2次。同时予0.5% 羧甲 基纤维素钠溶液经口灌胃，5 ml/kg，1/d。②肝纤维化模型组(Model)。③秋水仙碱组(Colc hicine)。模型组和秋水仙碱组在造模的同时分别予0.5%羧甲基纤维素钠、0.0025%秋水仙碱 灌胃，5 ml/kg，1/d。④三七组(Panax notoginseng，PN)，在预实验取得最佳剂量后，造 模的同时予12%三七粉灌胃，5 ml/kg，1/d。

    1.5 标本采集

    各组每隔3周处死8只大鼠，最后一次处死大鼠为第9周末。用3%戊巴比妥钠腹腔注射0.0 2 ml/kg，麻醉后，经股动脉放血，分离血清，-20°C保存。留取肝组织标本。

    1.6 检测指标及方法

    1.6.1 应用EX₇全自动生化测定仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferas e,ALT)、白蛋白(Albumin)、球蛋白(Globulin)含量。

    1.6.2 应用上海第二军医大学海军医学研究所提供的透明质酸(Hyaluronic acid,HA)、层 粘连蛋白(Laminin,LN)放免试剂盒，按说明操作，测定HA、LN含量。

    1.6.3 肝组织Hyp含量按许志勤法^[1]进行测定。

    1.6.4 病理形态学观察 常规HE染色观察肝组织学改变，Van Gieson胶原纤维染色观察 胶原纤维增生情况，电镜观察肝脏超微结构变化。

    1.7 统计学处理

    采用第三军医大学医用数理统计程序进行统计学处理。

    2 结果

    2.1 大鼠一般情况

    对照组处死前均存活，每只体重增加(128±47)g。模型组实验中死亡7只，至9周处死前 ，每只体重增加(34±29)g，显著低于空白对照组(P< 0.05)。秋水仙碱组 实验中死亡4只 ，每只体重增加(62±23.6)g，显著低于空白对照组(P< 0.01)而高于模型 组(P< 0.05 )。三七组实验中无死亡，与模型组比较P< 0.05，每只体重增加(87±36) g，显著高于模型组(P< 0.01)。死亡者均未列入统计。

    2.2 三七对实验大鼠肝功能的影响

    模型组、秋水仙碱组、三七组不同时相ALT含量均显著高于同期空白对照组(P < 0.01 ，P< 0.05)，而以模型组最高，显著高于其它同期各组(P< 0.01)。9周时，三七组A LT低于秋水仙碱组(P< 0.05)。模型组不同时相白蛋白下降、球蛋白增加 ，与其它各组比 较差异显著(除秋水仙碱组6周外)，而9周时三七组球蛋白显著低于秋水仙碱组(P< 0.05)， 见表1。

    表1 各组大鼠肝功能变化(±s,n=8)

    Tab 1 Changes of liver function in different

    groups of rats(±s,n=8) Group

    ALT(IU/L)

    Albumin(ρ_B/g^.L^-1)

    Globulin(ρ_B/g^.L^-1)

    Control

    week3

    38.47±4.39

    34.51±1.69

    24.19±1.57

    week6

    37.59±5.32

    35.09±1.87

    23.78±1.45

    week9

    39.63±5.13

    35.55±2.09

    24.01±1.62

    Model

    week3

    225.38±99.78^{* *}

    31.24±1.92^{* *}

    27.76±2.20^{* *}

    week6

    312.63±72.21^{* *}

    27,82±2.93^{* *}

    30.78±1.88^{* *}

    week9

    348.63±90.75^{* *}

    24.41±2.81^{* *}

    36.52±1.09^{* *}

    Colchicine

    week3

    58.38±12.68^{* * △ △}

    33.86±2.62^△

    24.14±2.25^{△ △}

    week6

    90.2±58.26^{* △ △}

    32.10±3.97^*

    24.78±2.09^{△ △}

    week9

    110.0±37.55^{* * △ △}

    32.41±1.96^{△ △}

    26.45±2.60^{* △ △}

    PN

    week3

    67.13±18.39^{* * △ △}

    34.83±1.58^{△ △}

    24.01±2.50^{△ △}

    week6

    97.63±38.59^{* * △ △}

    34.35±1.54^△

    23.91±1.88^{△ △}

    week9

    68.12±14.34^{* * △ △ #}

    34.50±2.74^{△ △}

    23.88±1.69<sup>△ △ #

    *</sup>：P<0.05,^{* *}：P<0.01 vs control；^△：P<0.05,^{△ △}：P<0.01 vs model；#：P<0.05 vs Colchicine

    2.3 三七对大鼠血清HA、LN和肝组织中Hyp的影响

    各组大鼠不同时相血清HA、LN、肝Hyp均较空白对照组有不同程度升高，但3周时均无显 著性差异，6周时秋水仙碱组Hyp升高及三七组3项指标升高无统计学意义，各组以9周时3项 指标升高(除三七组Hyp外)最为明显，而2个药物治疗组6、9周时各项指标显著低于同期模 型组(除秋水仙碱组6周时血HA、9周时肝Hyp外)，见表2。

    表2 大鼠血清HA、LN和肝组织Hyp的变化(±s,n=8)

    Tab 2 Levels of HA、LN in serum and Hyp in liver tissue

    in different groups of rats(±s,n=8) Group

    HA(ρ_B/μg*L^-1)

    LN(ρ_B/μg*L^-1)

    Hyp(mg/g)

    Control

    week3

    97.32±15.28

    32.47±5.01

    2.01±0.39

    week6

    98.45±16.03

    33.38±4.56

    2.22±0.41

    week9

    100.13±17.1

    33.86±4.28

    2.39±0.46

    Model

    week3

    116.16±20.2

    37.48±5.79

    2.86±0.77

    week6

    139.69±18.97^*

    55.70±7.32^{* *}

    3.56±0.77^{* *}

    week9

    198.78±34.54^{* *}

    85.56±12.34^{* *}

    3.95±0.98^{* *}

    Colchicine

    week3

    115.91±21.86

    35.47±3.78

    2.60±0.57

    week6

    129.64±22.07^{* *}

    40.01±6.14^{* △ △}

    2.78±0.54^△

    week9

    147.51±21.89^{* * △ △}

    45.81±9.30^{* * △ △}

    3.11±0.42^{* *}

    PN

    week3

    109.50±17.76

    30.04±4.93

    2.48±0.41

    week6

    112.99±20.54^△

    37.44±4.90^{△ △}

    2.80±0.64^△

    week9

    141.56±23.55^{* △ △}

    39.20±4.93^{* △ △}

    2.97±0.69<sup>△

    *</sup>：P<0.05,^{* *}：P<0.01 vs control；

    ^△:P<0.05,^{△ △}：P<0.01 vs model 2.4 病理形态学观察

    2.4.1 肝脾大体形态观察 模型组3周末肝脏开始肿大，9周末停止肿大，韧度增加，有 油腻感。其中有1只大鼠肝脏体积缩小，黄褐色，表面呈细结节状，有腹水。脾脏从第6周末 开始肿大，9周末肿大最明显。秋水仙碱组、三七组3周末肝脏开始肿大，9周末仍肿大，但 较模型组轻，脾脏肿大不明显。

    2.4.2 光镜观察 HE染色和Van Gieson胶原纤维染色后观察，见对照组肝小叶结构完整 ，无变性、坏死、炎细胞浸润及纤维组织增生。模型组3周是地肝细胞广泛脂肪变性，可见 少量增生的纤维组织；6周时肝细胞脂肪变性加重，残存少量肝细胞；9周时肝组织大片脂肪 变性，呈空网状，仅残存少量肝细胞，变性肝组织中穿插纤维组织条索。秋水仙碱组3周时 界板区大量脂肪空泡，炎细胞浸润较多，有少量纤维组织增生；6周时肝细胞呈大片网状变 性坏死，变民生区有纤维细胞增生和炎细胞浸润，小叶间少量纤维组织增生；9周时汇管区 纤维组织增生，并向周围放射生长，可见再生肝细胞，界板区纤维组织增生。三七组3周时 肝细胞脂肪变性较模型组及秋水仙碱组轻，汇管区少量纤维组织；6周时部分肝细胞脂肪变 性，肝内灶性炎细胞浸润，肝小叶间和中央静脉周围少量纤维组织增生；9周时中央静脉周 围大片肝细胞脂肪变性，汇管区及界板区纤维组织少量增生。

    2.4.3 电镜观察 模型组肝细胞胞浆内充满大小不等的脂肪空泡，有的肝细胞核被挤压 变形，核内亦可见空泡。胞浆内滑面内质网增生，呈典型的肝细胞中毒损伤后的超微结构特 征性改变。变性的肝细胞内线粒体电子密度增强，嵴模糊或消失呈均质状。而秋水仙碱组和 三七组上述改变较轻微。

    3 讨论

    本研究以CCl₄复制肝纤维化动物模型，使肝细胞发生变性坏死，通过炎症肝脏结缔组 织 增生，分割肝小叶，最后导致肝硬变。肝纤维化的实质是由于胶原和其他细胞外基质(ECM) 的合成与降解失衡，导致ECM在肝内过量沉积^[2]。参与肝纤维化的细胞外基质成分 包括胶原蛋白、非胶原性糖蛋白和蛋白多糖3大类^[3]。HA是构成ECM中蛋白多糖的 主要成分，是反映肝内皮细胞功能和肝硬化程度的指标，其对慢性肝损伤和肝纤维化的诊断 价值已得到普遍承认^[4]。LN是一种重要的结构糖蛋白，当肝细胞受损伤时，各种 细胞因子及ECM本身的破坏可激活LN的合成，LN升高程度与肝纤维化程度呈正相关^[5] 。胶原纤维主要由胶原蛋白所构成，Hyp为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝脏中的 含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度相平行。

    根据中医辨证，结缔组织增生性疾病(包括肝纤维化和肝硬化)与血瘀证相关，而活血化 瘀药物对此类疾病有独特的功效。在肝纤维化的治疗中，目前以活血化瘀及益气活血法应用 得最为广泛。

    三七是经典的止血活血良药。临床观察发现，三七有利胆、退黄、降酶等作用，可提高 慢性肝病患者的血浆白蛋白^[6]。药理研究证实，三七对动物实验性急性肝损伤有 明显的防治作用，其有效成分三七总皂甙是缺血再灌注损伤的有效保护药物^[7]， 但其对肝纤维化的防治研究报道甚少。

    本研究结果表明，三七可显著降低血清ALT、球蛋白，升高白蛋白，减轻肝细胞脂肪变 性及炎细胞浸润，说明三七具有保护肝细胞、肝细胞损伤的作用。结果还表明，三七组6、9 周时血HA、LN、肝Hyp与同期模型组相比显著降低，且病理观察提示三七可明显地拟制肝组 织中成纤维细胞及胶原纤维增生，说明三七确能抑制肝脏胶原纤维合成与沉积，具有抗肝纤 维化作用。

    秋水仙碱已用于临床治疗慢性肝病，长期应用可防治实验性和临床病人的肝纤维化和肝 硬化，并有抑制胶原分泌的作用，被认为是治疗人类肝纤维化的有希望的药物^[8] 。从本研究结果分析，秋水仙碱确有抗肝纤维化作用，且血清学指标变化与形态学改变相吻 合。

    本研究表明，三七有保护肝细胞、减轻CCl₄中毒性肝脏损害、减少胶原蛋白合成、促 进胶原蛋白分解的作用，是较理想的防治肝纤维化的药物。其作用比秋水仙碱强。作用机制 有待进一步研究。

    基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700185)

    作者简介：张荣华(1962-)，女，河南省武陟县人，博士研究 生，主治医师，讲师，主要从事中药防治肝纤维化方面的研究，发表论文9篇。电话：(023) 65318301-73071

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    收稿日期：1999-07-08；修回日期：2000-01-18

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2000/04/01/15/151.htm