Ca2+在紫外线诱导成纤维细胞凋亡中的作用
作者：王振岳 吴永恒 邓永键 周一平
单位：王振岳(第一军医大学南方医院 烧伤科，广东 广州 510515)；吴永恒(第一军医大学南方医院 烧伤科，广东 广州 510515)；邓永键(第一军医大学南方医院病理科，广东 广州 510515)；周一平(第一军医大学南方医院 烧伤科，广东 广州 510515)
关键词：钙；凋亡；成纤维细胞
第一军医大学学报000404 摘要：目的 了解细胞内外钙离子浓度对紫外线(UVB)辐射诱导成纤维细胞(NIH3T3)凋亡作用的影响。方法 UVB照射成纤维细胞10 min，培养12 h后，用流式细胞仪测定凋亡率。 结果 UVB照射组比UVB不照射组凋亡率有明显增加；UVB照射组内各组间凋亡率因细胞内外Ca2+浓度不同存在明显差异。 结论 UVB辐射诱导成纤维细胞发生凋亡与胞内外Ca2+浓度有关，Ca2+参与了凋亡的信号转导。UVB诱导成纤维细胞发生的凋亡，主要通过Ca2+转导凋亡信号这一途径，还反映出胞浆Ca2+升高既来源于胞内钙池，又来源于胞外游离Ca2+。
, http://www.100md.com
中图分类号：R329.25; R363.121 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)04-0316-03
The key role of cytosola Ca2+ in the apoptosis of NIH3T3 cells induced by UVB irradiation
WANG Zhen-yue, WU Yong-heng, ZHOU Yi-ping
(Departments of Burnsl, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
DENG Yong-jian
(Departments ofPathology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To explore the changes of intracellular Ca2+ in the NIH3T3 cells after UVB-induced apoptosis. Methods With a flow cytometer (EPICS ELITE), the apoptotic rate of the NIH3T3 cells was determined after being irradiated by UVB for 10 min and incubated for 12 h. Results The rates of apotosis in UVB irradiation groups were significantly higher as compared with the control group, and the rates significantly varied depending on the intracellular and extracellular concentration gradient of calcium. Conclusions The apoptosis of NIH3T3 cells induced by UVB was associated with the intracellular and extracellular concentration gradient of calcium, as Ca2+ constitutes the signal transduction mechanism for apoptosis. The increased cytosol Ca2+ came from both intracellular and extracellular calcium pool.
, 百拇医药
Key words: calcium; apoptosis; 3T3 cells
细胞内Ca2+是公认的细胞第二信使，大多数实验表明细胞内Ca2+参与了凋亡信号转导[1]。但也有人发现在CHO系细胞内游离钙并不参与传导凋亡信号，在胸腺细胞和CTLL-2细胞中，核内DNA消化时，胞浆Ca2+升高，但当细胞内外钙被螯合后，并不能阻止DNA被消化[2]。此外亦有人发现，胞浆Ca2+降低能诱导凋亡。本实验通过紫外线(UVB)照射成纤维细胞10 min，培养12 h，用流式细胞仪测定细胞凋亡率，了解细胞内外钙离子浓度对UVB诱导细胞凋亡作用的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞准备
将NIH3T3细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液稀释成106/ml，接种于100 mm规格的培养皿(美国Corning公司)中，在37 ℃、5% CO2和饱和湿度下培养48 h后，弃原液，在Hanks液或D-Hanks液环境下，UVB照射10 min(空白对照组不经UVB照射)，静置30 min后弃覆盖液，换回含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，在原条件下培养12 h备用。
, http://www.100md.com
1.2 凋亡率的测定
试剂配制：用缓冲液(5 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，140 mmol/L NaCl，pH 7.4)将碘化丙啶(PI，美国 Molecular probe公司)配成10 mg/ml储存液，-20 ℃冻存；Annexin-V-Flous(德国 Boehringer Mannheim公司)为液状染料，-20 ℃冻存。取5 μl PI以及20 μl Annexin-V-Fluos加入1 000 μl缓冲液中，配成标记液。
收集细胞置于离心管中离心，1 000 r/min，10 min，弃上清液；加入100 μl标记液将细胞团吹打成细胞悬液，避光室温下静置15 min；加入0.4 ml缓冲液，经300目不锈钢滤网过滤，选择适当波长的激光源以及带通滤过器后，进行流式细胞仪(美国Coulter公司)检测。激光源波长为488 nm，带通滤过器的波长选2个：检测Annexin-V-Fluos的波长为525 nm，另一个检测PI的波长为633 nm。
, 百拇医药
1.3 实验分组
1.3.1 Hanks液环境下 设立空白对照组和UVB照射组。
1.3.2 D-Hanks液环境下 设立D-Hanks组、D-Hanks+10 mmol/L EGTA组、无处理因素组、钌红(Sigma公司)组、肝素组、肝素+钌红组以及每组相应的空白对照组。处理组：只接受UVB照射；EGTA组：加入10 mmol/L EGTA(Ca2+螯合剂) 90 s后UVB照射。无处理因素组：只加入50 μg/ml皂角素(细胞膜打洞剂)，孵化15 min后UVB照射；钌红组：先加入50 μg/ml皂角素以及10 mol/L钌红(钙池上ryanodine受体系统的特异性抑制剂)，孵化15 s后UVB照射；肝素组：先加入50 μg/ml皂角素以及100 mol/L肝素(钙池上IP3受体系统的特异性抑制剂)，孵化15 min后UVB照射；肝素+钌红组：先加入50 μg/ml皂角素、10 mol/L钌红以及100 mol/L肝素，孵化15 min后UVB照射。
, http://www.100md.com
1.4 数据处理
细胞凋亡率经流式细胞仪测量获得，凋亡率采用两样本配对t检验和完全随机设计方差分析进行分析。
2 结果
2.1 细胞有无内外钙对UVB诱导的细胞凋亡率的影响(表1)
表1 细胞内外有无钙时UVB诱导NIH3T3细胞发生的凋亡率
(%, n=6,
±s)
Tab.1 The apoptotic rate of the NIH3T3 cells induced by UVB with
or without intracellular and extracellular Ca2+ (%, n=6, Mean±SD)
, http://www.100md.com
Group
Non-irradiation
Irradiation
Hanks
0.383±0.147
18.250±0.973Δ
D-Hanks
8.517±0.930*
14.917±2.313Δ*
D-Hanks+10 mmol/L EGTA
2.813±1.703**
, 百拇医药
6.567±2.175Δ**
ΔP<0.05 vs non-radiation group；*P<0.05 vs Hanks group；** P<0.05 vs Hanks group or D-Hanks group
2.2 胞外无钙时细胞内钙池的动员对UVB诱导的凋亡率的影响(表2)
表2 在胞外无钙情况下，抑制细胞内钙池的动员时UVB诱导
NIH3T3细胞发生的凋亡率 (%, n=6,±s)
Tab.2 The apoptotic rate of the NIH3T3 cells induced by UVB without
, 百拇医药
extracellular Ca2+ and with inhibited mobilization of the intracellular
Ca2+ pool (%, n=6, Mean±SD)
Group
Non-radiation
Irradiation
P
Normal
4.667±1.011*
15.833±1.579Δ
, 百拇医药
<0.05
Ruthenium red
3.183±1.459*
10.833±1.261Δ
<0.05
Heparin
3.167±1.275*
6.400±2.366Δ
<0.05
Heparin+ruthenium red
3.217±0.783*
, 百拇医药
1.817±0.960Δ
>0.05
*P>0.05 vs any group among normal, ruthenium red, heparin and heparin+ruthenium red group; ΔP<0.05 vs any group among normal, ruthenium red, heparin and heparin+ruthenium red group
3 讨论
UVB能够诱导NIH3T3细胞发生凋亡。表1显示，在细胞外无钙或内外钙全被螯合情况下，UVB均能诱导NIH3T3细胞发生凋亡，表明通过Ca2+转导凋亡信号并不是UVB诱导NIH3T3细胞凋亡的唯一途径，尚存在其它途径，主要是通过神经酰胺或氧化中间产物转导信号的途径来诱导凋亡[4]，也可能是UVB直接作用于核DNA的结果[5]，或许以上几种情况都存在。此外，UVB诱导的NIH3T3胞内Ca2+升高既来源于外钙内流，又来源于胞内钙池钙离子动员。外钙内流是引起和维持胞内Ca2+处于较高水平的主要因素。 表1亦显示 ，细胞经UVB照射后，各组凋亡率之间存在明显差异，胞内外Ca2+越趋于正常，凋亡率越高，可见，UVB诱导NIH3T3细胞发生的凋亡，主要是通过Ca2+转导凋亡信号这一途径。
, 百拇医药
另一方面，在皂角素增加细胞膜通透性，打破了细胞内正常反应体系的前提下，UVB诱导细胞凋亡过程中胞内钙池钙动员是通过哪些途径呢？ 表2显示 ，无处理因素组、钌红组和肝素组在细胞经UVB照射后，与各自空白对照组相比较，细胞凋亡率增高，但钌红+肝素组却无明显差异。可见UVB诱导NIH3T3细胞发生凋亡时，钙池钙离子发生动员，参与了凋亡信号转导过程，而且表明NIH3T3细胞内钙池只存在两种受体：IP3受体和ryanodine受体[6]。同时，细胞经UVB照射后，各组凋亡率之间存在明显差异，无处理因素组>钌红组>肝素组>肝素+钌红组，可见肝素抑制钙池钙离子动员的能力比钌红强，反映出NIH3T3细胞内钙池上IP3受体占优势。 凡能抑制钙池钙离子释放的因素都能降低细胞凋亡率，无处理因素组(不加肝素、钌红)细胞凋亡率最高；钙池钙离子释放越多，胞浆Ca2+水平越高，细胞凋亡率也越高。从另一个角度证实了UVB诱导NIH3T3细胞发生的凋亡，主要是通过Ca2+转导凋亡信号这一途径。从表2的结果来看，细胞在不经UVB照射时，各组之间凋亡率无明显差异，表明NIH3T3细胞在无外来因素刺激时，不会发生钙池钙离子动员。
, 百拇医药
综上所述， UVB辐射能诱导NIH3T3细胞发生凋亡，维持细胞内外正常Ca2+平衡是细胞生存必不可少的条件，有助于抵抗UVB辐射损害。其次，胞浆Ca2+参与了UVB诱导的凋亡信号的转导，但Ca2+转导凋亡信号并不是UVB诱导NIH3T3细胞凋亡的唯一途径，但可能是主要途径。在细胞内外钙被螯合情况下，可能尚存在其它途径激活一些非Ca2+依赖性机制来诱导凋亡。第三，UVB诱导NIH3T3细胞发生凋亡时，胞浆Ca2+升高既源于外钙内流，又源于钙池动员，而且外钙内流是维持胞浆Ca2+处于较高水平的主要因素。
作者简介：王振岳(1969-)，男，湖南长沙人，1993年毕业于第一军医大学，医学学士，医师，助教，电话：85141857
参考文献：
[1] David J, McConkey, Sten O. The role of calcium in the regulation of apoptosis[J]. J Leukoc Biol, 1996, 59(6):775-83.
, http://www.100md.com
[2] Li J, Eastman A. Apoptosis in an interleukin-2-dependent cytotoxic T lymphocyte cell line is associated with intracellular acidification.Role of the Na(+)/H(+)-antiport[J]. J Biol Chem, 1995, 270(7):3203-11.
[3] Surh CD, Sprent J. T-cell apoptosis detected in situ during positive and negative selection in the thymus[J]. Nature, 1994, 372(6501):100-3.
[4] Martin SJ, Newmeyer DD, Mathias S, et al. Cell-free reconstitution of Fas-, UV radiation-and ceramide-induced apoptosis[J]. EMBO J, 1995, 14(21):5191-200.
[5] Haimovitz-Friedman A, Kan CC, Ehleiter D, et al. Ionizing radiation acts on cellular membranes to generate ceramide and initiate apoptosis [J]. J Exp Med, 1994, 180(2):525-35.
[6] 林曙光. 细胞信号转导系统[M]. 天津：科学出版社, 1996.76-80.
收稿日期：1999-12-25, 百拇医药
单位：王振岳(第一军医大学南方医院 烧伤科，广东 广州 510515)；吴永恒(第一军医大学南方医院 烧伤科，广东 广州 510515)；邓永键(第一军医大学南方医院病理科，广东 广州 510515)；周一平(第一军医大学南方医院 烧伤科，广东 广州 510515)
关键词：钙；凋亡；成纤维细胞
第一军医大学学报000404 摘要：目的 了解细胞内外钙离子浓度对紫外线(UVB)辐射诱导成纤维细胞(NIH3T3)凋亡作用的影响。方法 UVB照射成纤维细胞10 min，培养12 h后，用流式细胞仪测定凋亡率。 结果 UVB照射组比UVB不照射组凋亡率有明显增加；UVB照射组内各组间凋亡率因细胞内外Ca2+浓度不同存在明显差异。 结论 UVB辐射诱导成纤维细胞发生凋亡与胞内外Ca2+浓度有关，Ca2+参与了凋亡的信号转导。UVB诱导成纤维细胞发生的凋亡，主要通过Ca2+转导凋亡信号这一途径，还反映出胞浆Ca2+升高既来源于胞内钙池，又来源于胞外游离Ca2+。
, http://www.100md.com
中图分类号：R329.25; R363.121 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)04-0316-03
The key role of cytosola Ca2+ in the apoptosis of NIH3T3 cells induced by UVB irradiation
WANG Zhen-yue, WU Yong-heng, ZHOU Yi-ping
(Departments of Burnsl, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
DENG Yong-jian
(Departments ofPathology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To explore the changes of intracellular Ca2+ in the NIH3T3 cells after UVB-induced apoptosis. Methods With a flow cytometer (EPICS ELITE), the apoptotic rate of the NIH3T3 cells was determined after being irradiated by UVB for 10 min and incubated for 12 h. Results The rates of apotosis in UVB irradiation groups were significantly higher as compared with the control group, and the rates significantly varied depending on the intracellular and extracellular concentration gradient of calcium. Conclusions The apoptosis of NIH3T3 cells induced by UVB was associated with the intracellular and extracellular concentration gradient of calcium, as Ca2+ constitutes the signal transduction mechanism for apoptosis. The increased cytosol Ca2+ came from both intracellular and extracellular calcium pool.
, 百拇医药
Key words: calcium; apoptosis; 3T3 cells
细胞内Ca2+是公认的细胞第二信使，大多数实验表明细胞内Ca2+参与了凋亡信号转导[1]。但也有人发现在CHO系细胞内游离钙并不参与传导凋亡信号，在胸腺细胞和CTLL-2细胞中，核内DNA消化时，胞浆Ca2+升高，但当细胞内外钙被螯合后，并不能阻止DNA被消化[2]。此外亦有人发现，胞浆Ca2+降低能诱导凋亡。本实验通过紫外线(UVB)照射成纤维细胞10 min，培养12 h，用流式细胞仪测定细胞凋亡率，了解细胞内外钙离子浓度对UVB诱导细胞凋亡作用的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞准备
将NIH3T3细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液稀释成106/ml，接种于100 mm规格的培养皿(美国Corning公司)中，在37 ℃、5% CO2和饱和湿度下培养48 h后，弃原液，在Hanks液或D-Hanks液环境下，UVB照射10 min(空白对照组不经UVB照射)，静置30 min后弃覆盖液，换回含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，在原条件下培养12 h备用。
, http://www.100md.com
1.2 凋亡率的测定
试剂配制：用缓冲液(5 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，140 mmol/L NaCl，pH 7.4)将碘化丙啶(PI，美国 Molecular probe公司)配成10 mg/ml储存液，-20 ℃冻存；Annexin-V-Flous(德国 Boehringer Mannheim公司)为液状染料，-20 ℃冻存。取5 μl PI以及20 μl Annexin-V-Fluos加入1 000 μl缓冲液中，配成标记液。
收集细胞置于离心管中离心，1 000 r/min，10 min，弃上清液；加入100 μl标记液将细胞团吹打成细胞悬液，避光室温下静置15 min；加入0.4 ml缓冲液，经300目不锈钢滤网过滤，选择适当波长的激光源以及带通滤过器后，进行流式细胞仪(美国Coulter公司)检测。激光源波长为488 nm，带通滤过器的波长选2个：检测Annexin-V-Fluos的波长为525 nm，另一个检测PI的波长为633 nm。
, 百拇医药
1.3 实验分组
1.3.1 Hanks液环境下 设立空白对照组和UVB照射组。
1.3.2 D-Hanks液环境下 设立D-Hanks组、D-Hanks+10 mmol/L EGTA组、无处理因素组、钌红(Sigma公司)组、肝素组、肝素+钌红组以及每组相应的空白对照组。处理组：只接受UVB照射；EGTA组：加入10 mmol/L EGTA(Ca2+螯合剂) 90 s后UVB照射。无处理因素组：只加入50 μg/ml皂角素(细胞膜打洞剂)，孵化15 min后UVB照射；钌红组：先加入50 μg/ml皂角素以及10 mol/L钌红(钙池上ryanodine受体系统的特异性抑制剂)，孵化15 s后UVB照射；肝素组：先加入50 μg/ml皂角素以及100 mol/L肝素(钙池上IP3受体系统的特异性抑制剂)，孵化15 min后UVB照射；肝素+钌红组：先加入50 μg/ml皂角素、10 mol/L钌红以及100 mol/L肝素，孵化15 min后UVB照射。
, http://www.100md.com
1.4 数据处理
细胞凋亡率经流式细胞仪测量获得，凋亡率采用两样本配对t检验和完全随机设计方差分析进行分析。
2 结果
2.1 细胞有无内外钙对UVB诱导的细胞凋亡率的影响(表1)
表1 细胞内外有无钙时UVB诱导NIH3T3细胞发生的凋亡率
(%, n=6,
±s)Tab.1 The apoptotic rate of the NIH3T3 cells induced by UVB with
or without intracellular and extracellular Ca2+ (%, n=6, Mean±SD)
, http://www.100md.com
Group
Non-irradiation
Irradiation
Hanks
0.383±0.147
18.250±0.973Δ
D-Hanks
8.517±0.930*
14.917±2.313Δ*
D-Hanks+10 mmol/L EGTA
2.813±1.703**
, 百拇医药
6.567±2.175Δ**
ΔP<0.05 vs non-radiation group；*P<0.05 vs Hanks group；** P<0.05 vs Hanks group or D-Hanks group
2.2 胞外无钙时细胞内钙池的动员对UVB诱导的凋亡率的影响(表2)
表2 在胞外无钙情况下，抑制细胞内钙池的动员时UVB诱导
NIH3T3细胞发生的凋亡率 (%, n=6,
±s)Tab.2 The apoptotic rate of the NIH3T3 cells induced by UVB without
, 百拇医药
extracellular Ca2+ and with inhibited mobilization of the intracellular
Ca2+ pool (%, n=6, Mean±SD)
Group
Non-radiation
Irradiation
P
Normal
4.667±1.011*
15.833±1.579Δ
, 百拇医药
<0.05
Ruthenium red
3.183±1.459*
10.833±1.261Δ
<0.05
Heparin
3.167±1.275*
6.400±2.366Δ
<0.05
Heparin+ruthenium red
3.217±0.783*
, 百拇医药
1.817±0.960Δ
>0.05
*P>0.05 vs any group among normal, ruthenium red, heparin and heparin+ruthenium red group; ΔP<0.05 vs any group among normal, ruthenium red, heparin and heparin+ruthenium red group
3 讨论
UVB能够诱导NIH3T3细胞发生凋亡。表1显示，在细胞外无钙或内外钙全被螯合情况下，UVB均能诱导NIH3T3细胞发生凋亡，表明通过Ca2+转导凋亡信号并不是UVB诱导NIH3T3细胞凋亡的唯一途径，尚存在其它途径，主要是通过神经酰胺或氧化中间产物转导信号的途径来诱导凋亡[4]，也可能是UVB直接作用于核DNA的结果[5]，或许以上几种情况都存在。此外，UVB诱导的NIH3T3胞内Ca2+升高既来源于外钙内流，又来源于胞内钙池钙离子动员。外钙内流是引起和维持胞内Ca2+处于较高水平的主要因素。 表1亦显示 ，细胞经UVB照射后，各组凋亡率之间存在明显差异，胞内外Ca2+越趋于正常，凋亡率越高，可见，UVB诱导NIH3T3细胞发生的凋亡，主要是通过Ca2+转导凋亡信号这一途径。
, 百拇医药
另一方面，在皂角素增加细胞膜通透性，打破了细胞内正常反应体系的前提下，UVB诱导细胞凋亡过程中胞内钙池钙动员是通过哪些途径呢？ 表2显示 ，无处理因素组、钌红组和肝素组在细胞经UVB照射后，与各自空白对照组相比较，细胞凋亡率增高，但钌红+肝素组却无明显差异。可见UVB诱导NIH3T3细胞发生凋亡时，钙池钙离子发生动员，参与了凋亡信号转导过程，而且表明NIH3T3细胞内钙池只存在两种受体：IP3受体和ryanodine受体[6]。同时，细胞经UVB照射后，各组凋亡率之间存在明显差异，无处理因素组>钌红组>肝素组>肝素+钌红组，可见肝素抑制钙池钙离子动员的能力比钌红强，反映出NIH3T3细胞内钙池上IP3受体占优势。 凡能抑制钙池钙离子释放的因素都能降低细胞凋亡率，无处理因素组(不加肝素、钌红)细胞凋亡率最高；钙池钙离子释放越多，胞浆Ca2+水平越高，细胞凋亡率也越高。从另一个角度证实了UVB诱导NIH3T3细胞发生的凋亡，主要是通过Ca2+转导凋亡信号这一途径。从表2的结果来看，细胞在不经UVB照射时，各组之间凋亡率无明显差异，表明NIH3T3细胞在无外来因素刺激时，不会发生钙池钙离子动员。
, 百拇医药
综上所述， UVB辐射能诱导NIH3T3细胞发生凋亡，维持细胞内外正常Ca2+平衡是细胞生存必不可少的条件，有助于抵抗UVB辐射损害。其次，胞浆Ca2+参与了UVB诱导的凋亡信号的转导，但Ca2+转导凋亡信号并不是UVB诱导NIH3T3细胞凋亡的唯一途径，但可能是主要途径。在细胞内外钙被螯合情况下，可能尚存在其它途径激活一些非Ca2+依赖性机制来诱导凋亡。第三，UVB诱导NIH3T3细胞发生凋亡时，胞浆Ca2+升高既源于外钙内流，又源于钙池动员，而且外钙内流是维持胞浆Ca2+处于较高水平的主要因素。
作者简介：王振岳(1969-)，男，湖南长沙人，1993年毕业于第一军医大学，医学学士，医师，助教，电话：85141857
参考文献：
[1] David J, McConkey, Sten O. The role of calcium in the regulation of apoptosis[J]. J Leukoc Biol, 1996, 59(6):775-83.
, http://www.100md.com
[2] Li J, Eastman A. Apoptosis in an interleukin-2-dependent cytotoxic T lymphocyte cell line is associated with intracellular acidification.Role of the Na(+)/H(+)-antiport[J]. J Biol Chem, 1995, 270(7):3203-11.
[3] Surh CD, Sprent J. T-cell apoptosis detected in situ during positive and negative selection in the thymus[J]. Nature, 1994, 372(6501):100-3.
[4] Martin SJ, Newmeyer DD, Mathias S, et al. Cell-free reconstitution of Fas-, UV radiation-and ceramide-induced apoptosis[J]. EMBO J, 1995, 14(21):5191-200.
[5] Haimovitz-Friedman A, Kan CC, Ehleiter D, et al. Ionizing radiation acts on cellular membranes to generate ceramide and initiate apoptosis [J]. J Exp Med, 1994, 180(2):525-35.
[6] 林曙光. 细胞信号转导系统[M]. 天津：科学出版社, 1996.76-80.
收稿日期：1999-12-25, 百拇医药