氯霉素注射液的细菌内毒素检查
作者：柯正方 袁惠德
单位：浙江省台州市药检所 浙江临海 317000
关键词：内毒素，细菌；干扰试验；注射液，氯霉素
中国药师000420
摘 要 目的：考察氯霉素注射液细菌内毒素检查法的可引性。 方法：干扰试验和对比试验。 结果：0.5 mg.ml-1的样品溶液无干扰作用， 与热原检查法结果一致。 结论：将氯毒素注射液稀释250倍或250倍以上可用灵敏度为0.5 EU.ml-1的鲎试剂作细菌内毒素检查。
Determination of Bacterial Endotoxin of Chloramphenicol Injection
, http://www.100md.com
Ke Zhengfang, Yuan Huide
(Taizhou Institute for Drug Control, Linhai, Zhejiang 317000，P.R.China)
ABSTRACT Objective： To inspect the feasibility of bacterial endotoxin testing method for chloramphenicol injection. Method: Interferential test and contrast test were used. Results: There was no interfering with 0.5mg.ml-1 of the sample solution, as test with rabbit was. Conclusion: Chloramphenicol injection diluted up to 250 times or more could be tested by tachpleus amebocyte lysate of which sentivity was 0.5Eu.ml-1.
, 百拇医药
KEY WORDS BET, Interferential test, Chloramphenicol injection
氯霉素注射液为临床上较常用的抗生素。 收载于卫生部药品标准抗生素药品第一册， 规定其热原检查方法为家兔法， 而美国药典23版已采用细菌内毒素检查法， 规定细菌内毒素限值为0.2EU.mg-1。 为此， 参照美国药典23版的“细菌内毒素检查法”中抑制增强试验基本原理及细菌内毒素检查的实验设计[1]， 我们对氯霉素注射液用细菌内毒素检查法取代热原检查法的可行性进行了研究， 报道如下。
1 试验材料
鲎试剂(批号：980503， 0.5 EU.ml-1， 0.5 ml.支-1， 福建平潭东方鲎试剂厂生产)； (批号： 980421， 0.5 EU.ml-1， 0.1 ml.支-1， 湛江安度斯生物有限公司生产)。
, http://www.100md.com
细菌内毒素工作标准品(批号：970925， 10 EU.支-1， 福建福州东方鲎试剂厂生产)。
细菌内毒素检查用水(批号：2， 5 ml.支-1， 卫生部药品生物制品检定所生产)；
氯霉素注射液(批号：990703， 990827， 990902， 2ml：0.25 g， 浙江尖峰海洲制药有限公司生产)。
2 方法和结果
2.1 细菌内毒素理论限值计算
卫生部药品标准规定本品热原检查为： 将样品加注射用水制成5 000单位.ml-1的溶液， 剂量按家兔体重1ml.kg-1注射， 相当于注射原液0.04 ml。 采用公式L=K/M计算出氯霉毒注射液内毒素理论限值， 其中K为家兔和人的致热阈(5EU.kg-1)[2]， M为家兔静脉注射剂量， 计算得出本品的细菌内毒素理论限值为L=125 EU.ml-1或L=1 EU.mg-1)。 当鲎试剂灵敏度为0.5 EU.ml-1时， 其MVD=250。
, 百拇医药
2.2 鲎试剂灵敏度复核
按文献[3]“细菌内毒素检查法”将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶液后置旋涡混合器上混合15 min， 然后制成1, 05， 0.25， 0.125 EU.ml-1的溶液， 每稀释一步均置旋涡混合器上混合30s， 每一浓度平行做4管， 同时做2管阴性对照， 结果见表1。
表1 鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂
内毒素浓度(EU.ml-1)
阴性
对照
λc
, http://www.100md.com
EU.ml-1
1
0.5
0.25
0.125
980503
++++
++++----------
0.5
980421
++++
++++
, http://www.100md.com
++--------
0.35
结果表明： 两批鲎试剂灵敏度均在0.5λ～2.0λ之间， 可用于细菌内毒素检查。
2.3 干扰试验
2.3.1 抑制增强试验
用细菌内毒素检查用水将样品稀释250倍制成0.5 mg.ml-1的溶液， 然后再按等比稀释， 将样品制成含0.25， 0.125， 0.0625 mg.ml-1浓度的溶液， 以各浓度的样品溶液分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0， 1.0， 0.5和0.25 λ的4种浓度的内毒素溶液。 其稀释制备过程为：10→2→1→0.5→0.25→0.125EU.ml-1， 每个浓度平行做两管， 结果见表2。表2 氯霉素注射液抑制增强试验 样品浓度
, 百拇医药
(mg.ml-1)
内毒素浓度(EU.ml-1)
1
0.5
0.25
0.125
0.5
++
++----
0.25
++
++----
, 百拇医药
0.125
++
++----
0.0625
++
++----
以上结果表明， 0.062 5～0.5 mg.ml-1均无干扰现象(即无抑制或增强作用)，考核3批样品反应结果均一致。故0.5 mg.ml-1为最大不干扰浓度。
2.3.2 干扰试验(确认试验)
用细菌内毒素检查用水和样品按最大有效稀释倍数(MVD)250倍的稀释液0.5mg.ml-1， 分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0， 1.0， 0.5和0.25λ的4种浓度的内毒素溶液， 其制备过程为：10→2→1→0.5→0.25→0.125EU.ml-1， 参照文献[3]， 对3批样品作干扰试验， 结果见表3。
, 百拇医药
表3 氯霉素注射液干扰试验结果 鲎试剂
(批号、生产厂)
供试品
内毒素浓度(EU.ml-1)
阴性对照
E值
EU.ml-1
1.0
0.5
0.25
0.125
, 百拇医药
980503(福建平潭东方鲎试剂厂)
细菌内毒素检查用水
++++
++++----------
0.5(Es)
990703
++++
++++----------
0.5(Et)
990827
++++
, 百拇医药
+++-----------
0.59(Et)
990902
++++
++++
+---------
0.42(Et)
980421(湛江安度斯生物有限公司)
细菌内毒素检查用水
++++
++++
, 百拇医药
++--------
0.35(Es)
990703
++++
+++-----------
0.59(Et)
990827
++++
+++-----------
0.59(Et)
990902
, http://www.100md.com
++++
++++----------
0.5(Et)
注：表中供试品项下用数字表示者， 均为氯霉素注射液的3个批号。
试验结果显示： 用两个不同生产厂家的两批鲎试剂分别对3批样品进行干扰试验， 其Et值均在0.5～2.0Es。 故确认本品在0.5mg.ml-1浓度下不干扰细菌内毒素试验， 该品种采用细菌内毒素检查法是可行的。
2.4 样品热原检查法与细菌内毒素检查法结果比较
将3批样品按卫生部药品标准用家兔检查热原结果均符合规定。 另外再分别将3批样品稀释制成0.5 mg.ml-1的溶液(250倍)， 参照文献[3]进行检查， 结果均符合规定。见表4。
, 百拇医药
表4 样品的细菌内毒素检查 鲎试剂
样品批号
供试品管
阳性
对照
阴性
对照
供试品
阳性对照
980503
990703--
+
-
, http://www.100md.com
+
990827--
+
-
+
990902--
+
-
+
980421
990703--
+
-
, http://www.100md.com
+
990827--
+
-
+
990902--
+
-
+
3 讨论
药品采用细菌内毒素检查的先决条件是对细菌内毒素试验不产生干扰作用， 如果药品在高浓度时对细菌内毒素无干扰， 则在更低浓度时也不会产生干扰[1]， 鲎试剂灵敏度复核试验表明试验所用的鲎试剂符合要求； 干扰试验表明样品稀释250倍或250倍以上即0.5 mg.ml-1或低于0.5 mg.ml-1对灵敏度为0.5 EU.ml-1的鲎试剂无干扰作用； 细菌内毒素检查法与热原检查法的结果一致表明采用细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的。 此外， 按国家标准计算的L值与美国药典的L值存在着较大差异， 由于细菌内毒素检查是一种限度试验， 故L值的确定直接影响检查结果的判断， 故L值取多大有待深入研究。 参 考 文 献
1，黄清泉， 夏振民. 细菌内毒素检查的实验设计. 中国药学杂志， 1997， 32(2)：72
2，夏振民. 细菌内毒素检查的限值. 药物分析杂志， 1995，15(3)：54
3，中国药典. 1995年版. 二部. 1998年增补本. 附录144
1999-08-23 收稿 2000-04-01 修回, http://www.100md.com
单位：浙江省台州市药检所 浙江临海 317000
关键词：内毒素，细菌；干扰试验；注射液，氯霉素
中国药师000420
摘 要 目的：考察氯霉素注射液细菌内毒素检查法的可引性。 方法：干扰试验和对比试验。 结果：0.5 mg.ml-1的样品溶液无干扰作用， 与热原检查法结果一致。 结论：将氯毒素注射液稀释250倍或250倍以上可用灵敏度为0.5 EU.ml-1的鲎试剂作细菌内毒素检查。
Determination of Bacterial Endotoxin of Chloramphenicol Injection
, http://www.100md.com
Ke Zhengfang, Yuan Huide
(Taizhou Institute for Drug Control, Linhai, Zhejiang 317000，P.R.China)
ABSTRACT Objective： To inspect the feasibility of bacterial endotoxin testing method for chloramphenicol injection. Method: Interferential test and contrast test were used. Results: There was no interfering with 0.5mg.ml-1 of the sample solution, as test with rabbit was. Conclusion: Chloramphenicol injection diluted up to 250 times or more could be tested by tachpleus amebocyte lysate of which sentivity was 0.5Eu.ml-1.
, 百拇医药
KEY WORDS BET, Interferential test, Chloramphenicol injection
氯霉素注射液为临床上较常用的抗生素。 收载于卫生部药品标准抗生素药品第一册， 规定其热原检查方法为家兔法， 而美国药典23版已采用细菌内毒素检查法， 规定细菌内毒素限值为0.2EU.mg-1。 为此， 参照美国药典23版的“细菌内毒素检查法”中抑制增强试验基本原理及细菌内毒素检查的实验设计[1]， 我们对氯霉素注射液用细菌内毒素检查法取代热原检查法的可行性进行了研究， 报道如下。
1 试验材料
鲎试剂(批号：980503， 0.5 EU.ml-1， 0.5 ml.支-1， 福建平潭东方鲎试剂厂生产)； (批号： 980421， 0.5 EU.ml-1， 0.1 ml.支-1， 湛江安度斯生物有限公司生产)。
, http://www.100md.com
细菌内毒素工作标准品(批号：970925， 10 EU.支-1， 福建福州东方鲎试剂厂生产)。
细菌内毒素检查用水(批号：2， 5 ml.支-1， 卫生部药品生物制品检定所生产)；
氯霉素注射液(批号：990703， 990827， 990902， 2ml：0.25 g， 浙江尖峰海洲制药有限公司生产)。
2 方法和结果
2.1 细菌内毒素理论限值计算
卫生部药品标准规定本品热原检查为： 将样品加注射用水制成5 000单位.ml-1的溶液， 剂量按家兔体重1ml.kg-1注射， 相当于注射原液0.04 ml。 采用公式L=K/M计算出氯霉毒注射液内毒素理论限值， 其中K为家兔和人的致热阈(5EU.kg-1)[2]， M为家兔静脉注射剂量， 计算得出本品的细菌内毒素理论限值为L=125 EU.ml-1或L=1 EU.mg-1)。 当鲎试剂灵敏度为0.5 EU.ml-1时， 其MVD=250。
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2.2 鲎试剂灵敏度复核
按文献[3]“细菌内毒素检查法”将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶液后置旋涡混合器上混合15 min， 然后制成1, 05， 0.25， 0.125 EU.ml-1的溶液， 每稀释一步均置旋涡混合器上混合30s， 每一浓度平行做4管， 同时做2管阴性对照， 结果见表1。
表1 鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂
内毒素浓度(EU.ml-1)
阴性
对照
λc
, http://www.100md.com
EU.ml-1
1
0.5
0.25
0.125
980503
++++
++++----------
0.5
980421
++++
++++
, http://www.100md.com
++--------
0.35
结果表明： 两批鲎试剂灵敏度均在0.5λ～2.0λ之间， 可用于细菌内毒素检查。
2.3 干扰试验
2.3.1 抑制增强试验
用细菌内毒素检查用水将样品稀释250倍制成0.5 mg.ml-1的溶液， 然后再按等比稀释， 将样品制成含0.25， 0.125， 0.0625 mg.ml-1浓度的溶液， 以各浓度的样品溶液分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0， 1.0， 0.5和0.25 λ的4种浓度的内毒素溶液。 其稀释制备过程为：10→2→1→0.5→0.25→0.125EU.ml-1， 每个浓度平行做两管， 结果见表2。表2 氯霉素注射液抑制增强试验 样品浓度
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(mg.ml-1)
内毒素浓度(EU.ml-1)
1
0.5
0.25
0.125
0.5
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0.25
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0.125
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以上结果表明， 0.062 5～0.5 mg.ml-1均无干扰现象(即无抑制或增强作用)，考核3批样品反应结果均一致。故0.5 mg.ml-1为最大不干扰浓度。
2.3.2 干扰试验(确认试验)
用细菌内毒素检查用水和样品按最大有效稀释倍数(MVD)250倍的稀释液0.5mg.ml-1， 分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0， 1.0， 0.5和0.25λ的4种浓度的内毒素溶液， 其制备过程为：10→2→1→0.5→0.25→0.125EU.ml-1， 参照文献[3]， 对3批样品作干扰试验， 结果见表3。
, 百拇医药
表3 氯霉素注射液干扰试验结果 鲎试剂
(批号、生产厂)
供试品
内毒素浓度(EU.ml-1)
阴性对照
E值
EU.ml-1
1.0
0.5
0.25
0.125
, 百拇医药
980503(福建平潭东方鲎试剂厂)
细菌内毒素检查用水
++++
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0.5(Es)
990703
++++
++++----------
0.5(Et)
990827
++++
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+++-----------
0.59(Et)
990902
++++
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0.42(Et)
980421(湛江安度斯生物有限公司)
细菌内毒素检查用水
++++
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0.35(Es)
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0.5(Et)
注：表中供试品项下用数字表示者， 均为氯霉素注射液的3个批号。
试验结果显示： 用两个不同生产厂家的两批鲎试剂分别对3批样品进行干扰试验， 其Et值均在0.5～2.0Es。 故确认本品在0.5mg.ml-1浓度下不干扰细菌内毒素试验， 该品种采用细菌内毒素检查法是可行的。
2.4 样品热原检查法与细菌内毒素检查法结果比较
将3批样品按卫生部药品标准用家兔检查热原结果均符合规定。 另外再分别将3批样品稀释制成0.5 mg.ml-1的溶液(250倍)， 参照文献[3]进行检查， 结果均符合规定。见表4。
, 百拇医药
表4 样品的细菌内毒素检查 鲎试剂
样品批号
供试品管
阳性
对照
阴性
对照
供试品
阳性对照
980503
990703--
+
-
, http://www.100md.com
+
990827--
+
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+
990902--
+
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980421
990703--
+
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, http://www.100md.com
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990827--
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990902--
+
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3 讨论
药品采用细菌内毒素检查的先决条件是对细菌内毒素试验不产生干扰作用， 如果药品在高浓度时对细菌内毒素无干扰， 则在更低浓度时也不会产生干扰[1]， 鲎试剂灵敏度复核试验表明试验所用的鲎试剂符合要求； 干扰试验表明样品稀释250倍或250倍以上即0.5 mg.ml-1或低于0.5 mg.ml-1对灵敏度为0.5 EU.ml-1的鲎试剂无干扰作用； 细菌内毒素检查法与热原检查法的结果一致表明采用细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的。 此外， 按国家标准计算的L值与美国药典的L值存在着较大差异， 由于细菌内毒素检查是一种限度试验， 故L值的确定直接影响检查结果的判断， 故L值取多大有待深入研究。 参 考 文 献
1，黄清泉， 夏振民. 细菌内毒素检查的实验设计. 中国药学杂志， 1997， 32(2)：72
2，夏振民. 细菌内毒素检查的限值. 药物分析杂志， 1995，15(3)：54
3，中国药典. 1995年版. 二部. 1998年增补本. 附录144
1999-08-23 收稿 2000-04-01 修回, http://www.100md.com