两种维甲类药物协同诱导白血病细胞HOXA1基因的表达
作者：王吉伟 陈汉春 田菁燕 刘新发 罗赛群 曾海涛
单位：湖南医科大学分子生物学研究中心，湖南 长沙 410078
关键词：人髓系白血病；细胞株HL-60；基因表达；化疗；维甲类化合物
中国医师杂志000404
【摘要】 本文研究了全反式维甲酸和9-顺维甲酸对HL-60细胞增殖及凋亡的影响，并用半 定量RT-PCR技术检测了人髓系白血病细胞株HL-60细胞中同源盒HOXA1基因的表达。结果表明 ，全反式维甲酸及9-顺维甲酸均能抑制HL-60细胞增殖并能促进其凋亡，这种效应在两药联 用时更为明显，根据上述结果，我们认为两药联用的抗癌机制之一可能是通过影响HOXA1基 因表达的网络调节系统来实现的，但在不同的白血病中，其影响程度可能有所差异。因此， 有必要更进一步探讨两种药物的抗癌调节模式，以便制定一个更有效的联合化疗方案。
, 百拇医药
[中图分类号] R733.71；R979.1+9 [文献标识码] A
[文章编号] 1008-1372(2000)04-0200-03
Changes of Gene Expression of HL-60 Cells Induced by
Synergism of Two Retinoid Compounds
WANG Ji-wei,CHEN Han-chun,TIAN Jing-yan,et al
(Research Center of Molecular Biology,Hunan Medical University Changsha,410078,China)
, 百拇医药
【Abstract】 In this paper,the effects of all-trans retinoic and 9-cis retinoic acid on the proliferation and apoptosis of HL-60 cell line were investigated.The expressions of Homeobox gene HOX A1 in human myeloid leukemia cell line HL-60 were determined by using semi-quantitative reverse transcription (RT-PCR) method.The results indicated that both all-trans retinoic acid and 9-cis retinoic acid showed an ability to suppress the proliferation of the HL-60 cells,and could promote apoptosis of the cell line specifically,when combinative treatment of the two drugs were used,their efficacy was more obviously than used alone.
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On the basis of the data,we consider that one of mechanisms for the anti-cancer synergism of the two compounds might be influence on the network regulation system of HOXA1 gene expression,and the extent of the influence has some difference in different leukemias.Therefore,the anticancer regular pattern of the two drugs should further be explored,in order to make a more effective combinative chemotherapy scheme.
Key Wods Human myeloid leukemia;HL-60 cell line;Gene expression;Chemotherapy,Retinoid compound
, 百拇医药
全反式维甲酸(ATRA)是一种可诱导某些癌变细胞向正常细胞逆转或分化的药物，目前已在临床上被广泛用于癌症特别是急性早幼粒细胞白血病(APL)的治疗。由于此药长期服用已被证明具有一定的毒副作用，因而临床上正在努力寻找一些能有效减少上述问题的合理用药方案。从某种意义上说，此目标的最终实现依赖于人们对ATRA作用机理及联合化疗分子机制的更深入了解。作者在以前的研究中曾发现，ATRA在诱导人髓系白血病细胞株HL-60细胞分化时，改变了同源盒HOXA1基因的表达，并据此提出，这种影响可能是ATRA诱导白血病细胞分化的前提之一[1]。在此基础上，本文研究了另一已被广泛用于某些癌症治疗的维甲类药物—9-顺维甲酸(9—cis RA)，对HOXA1基因的表达有何影响，并进一步探讨了此药是否与ATRA具有协同诱导白血病细胞分化的作用，以期为白血病联合化疗方案的制定提供一些合理的依据。
1 材料与方法
1.1 细胞的培养 人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞为我室保存。用补充有10%新生小牛血清(杭州四季青公司产品)，及适当浓度青、链霉素的RPMI 1640培养液在37℃，5%CO2的条件下培养。取对数生长期细胞，调节至2×105。ml-1细胞浓度后加药。
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1.2 药物作用分组 共分成四组。单用ATRA组，单用9-cis RA组，联合用药组(ATRA+9-cisRA)，无水乙醇为对照组。药物组单用时的作用浓度为1μm，联用时剂量减半。对照组加入等体积的溶剂。
1.3 剂量反应曲线 ATRA及9-cis RA均购自美国Sigma公司(分析纯)，分别用无水乙醇配成储液，置-20℃冰箱避光保存。试验时用生理盐水稀释，乙醇的浓度小于0.1%。于给药后不同时间用台盼兰拒染法染色，光镜下行活细胞计数。分别计数三次取平均值，以此判明各组药物对细胞增殖的影响。
1.4 细胞形态学改变 取各实验组细胞悬液离心涂片，自然干燥后用瑞氏法染色5min。油镜下观察细胞形态并按早幼粒、中幼粒、晚幼粒、杆状和分叶粒细胞进行分类，同时进行凋亡细胞计数。每张玻片最少观察200个细胞，反复3次，然后将其凋亡细胞数取平均值。
1.5 HOXA1基因mRNA水平的检测 将经不同药物组合处理后的HL-60细胞及白血病患者的单核细胞，用Trizol总RNA提取液(Promega公司产品)抽提总RNA后，按照文献[1]法所述引物及条件，用半定量RT-PCR技术检测药物作用前后，细胞内HOXA1基因的表达情况。
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1.6 统计处理 所有数据均采用
±s表示，并进行t检验。
2 结果
2.1 不同药物组合对HL-60细胞生长的影响 从药物作用生长曲线中可以看出，三个加药组在处理3d后，均不同程度地抑制了HL-60细胞的生长(与对照组比较，P<0.05及P<0.01)，但两药联用的这种抑制作用更强(与其它用药组比较，P<0.05)，差异均有显著性，见图1。
2.2 各组不同时间细胞形态变化及凋亡细胞数 对照组HL-60细胞的形态为圆形，胞体较大，核浆比例高。胞浆中可见大小不等、粗大不规则的嗜天青颗粒。加入ATRA作用后，细胞向分叶核方向发展，表明细胞被ATRA所诱导分化，但在作用48h时鲜见凋亡细胞的出现。与此不同，加入9-cis RA组的HL-60细胞，在药物作用48h，镜下便可见凋亡细胞的典型特征。其形态学改变的主要特征包括细胞核固缩、核膜皱缩、细胞膜皱缩外突等。在药物联用组，96h凋亡细胞出现的数量比药物单用组明显增多，见附表。
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图1 HL-60细胞在不同药物作用下的细胞生长曲线
附表 药物处理HL-60细胞不同时间凋亡细胞计数(±s，%) 组别
实验
次数
作用时间(h)
24
48
96
对照组
3
0.6±0.3
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2.2±0.7
2.7±1.0*
ATRA组
3
6.8±2.4
8.6±2.3
14.8±2.8*
9-cis RA组
3
11.6±1.8#
22.8±2.5##
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49.6±3.4**##
联合用药组
3
13.6±2.5##
24.3±2.1##
68.9±3.0**##△
注：各项计数200个细胞，3次实验检测结果经t检验，与24h的凋亡细胞数比较，*P<0.05(t>2.80)，**P<0.01(t>7.00)；与ATRA组比较，#P<0.05(t>5.59)，##P<0.01(t>3.760)；与9-cis RA组比较△P<0.05(t＝6.03)
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上表显示：四组细胞凋亡数均随时间的延长而凋亡数增加，用药96h后均与24h比较差异有显著性；用药三组在24h、48h、96h中凋亡数与对照组比较，差异均有显著性或非常显著性(P<0.05或P<0.01)，而9-cis RA与ATRA比较作用显著(凋亡数比较P<0.05)，联合用药组与9-cis RA组比较，96h时差异非常显著(P<0.01)。
2.3 ATRA和9-cis RA对HL-60细胞HOXA1基因表达的动力学检测 见图2。结果表明，与对照组相比，加药组均在药物作用的早期便上调了HOXA1基因的表达，说明这两种不同的维甲酸异构体对HOXA1基因的表达均有影响。24h达高峰，但三组间无统计学差异。在作用96h后，两组联用对HOXA1基因的下调作用要强于单用时的影响，差异非常显著(P<0.01)。另外，我们还检测另一衍生白血病的细胞株K562，此类药物组合对其HOXA1基因表达的影响，发现上述药物组合并不对其表达水平产生任何影响。
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图2 不同加药组对HL-60细胞HOXA1基因表达的影响
3 讨论
临床上应用ATRA治疗APL能获得较高的完全缓解率。分子机理研究已初步证明，这种作用实现的前提之一是维甲酸受体α(RARα)的活化，另一方面，由于在细胞发育过程中有许多其它起关键调节作用的基因存在，如本文所研究的同源盒HOX家族基因，它能在ATRA的作用下不同程度地在RNA水平发生表达的改变，因而现在人们已逐渐开始关注此类基因的表达改变在ATRA诱导白血病细胞分化中的作用[3]。目前的一个较为肯定的观点认为：RARa被ATRA激活后，可与某些HOX基因5’调控区上的维甲酸应答元件(RARE)结合，重新启动特定白血病细胞(如HL-60、NB4)因癌变而关闭了的分化程序，实现ATRA诱导癌变细胞向成熟分化的治疗效应[4]。本研究可见，用药后基因表达的波动也证实了这一点。
鉴于ATRA目前还主要局限于初发APL患者的治疗，而RARα又已知能被某些其它药物如VitD3等协同活化，因而已有人开始尝试将ATRA或其异构体与这些化合物联合，用于治疗其它类型癌症的可能性[5]。作为ATRA的一种异构体，9-顺维甲酸(9-cis RA)早在100多年前便已被人们认识到是一种能有效杀伤某些癌变细胞的抗癌药物。已有报导证实，这种效应主要是通过诱导癌细胞凋亡来完成的[6]。虽然已有人尝试将ATRA与9-cis RA联合用于白血病的治疗，但这种药物组合的理论依据及适用范畴目前尚无人对其加以探讨。本研究用已知能被ATRA诱导分化的HL-60细胞为实验模型，比较这两种作用机制迥异的药物单用及联用时，对细胞增殖、分化及凋亡的影响。研究结果证实：⑴两种药物均能有效地抑制HL-60细胞的增殖，但即使在浓度减半的情况下，联用对细胞增殖的抑制作用也明显强于药物单用时。提示，临床上这种药物的联用，有可能在最大限度地减少毒副作用的前提下，更好地达到治疗的目的。⑵两药联用虽然也可诱导HL-60细胞向成熟粒系分化，但增强癌细胞的凋亡似乎是其更重要的途径。⑶已知，HOX基因表达的改变主要是影响造血细胞的分化[7]，本组两药联用能更有效的调节HL-60细胞内HOXA1基因的表达，而对K562则无此作用。暗示对诱导分化的协同作用，也可能是两药联用引发癌变细胞死亡的原因之一，但在不同的白血病细胞内，这种效应可能是各异的。
, 百拇医药
国家自然科学基金(No.39670822)，CMB基金(No.99-668)资助。
参考文献
[1]王吉伟，田菁燕，陈汉春.同源盒HOXA1基因的髓系白血病细胞内的表达.湖南医学 2000；17(1)：3～4
[2]王吉伟，田菁燕，陈汉春.HL-60细胞内同源盒HOXA1 cDNA基因的克隆.中国现代医学杂志 1999；12(12)：14～16
[3]王吉伟，王学铭.维甲酸、同源盒基因的细胞分化.中国医师杂志 1999；1(3)：56～57
[4]Look AT.Oncogenic transcripition factors in the human acute leukemias.Science 1997；278：1059～1066
, http://www.100md.com
[5]Guzey M,Stattler C,Deluca HF.Combinational effects of Vitamin D3 and Retinoic acid (All trans and 9 cis) on proliferation cell death in two small cell lung carcinoma cell lines.Biochem.Biophys.Res.Commun 1998；249：735～744
[6]Fujimura S,Suzumiya J,Anzai K,et al.Retinoic acids growth inhibition and apoptosis in adult T-cell leukemia (ATL) cell lines.Leukemia Res 1998；22：611～618
[7]Lawrence HJ,Suvageau G,Humphries RK,et al.The role of HOX humeobox genes in normal and leukemichematopoiesis Stem.Cell 1996；14：281～286
收稿日期：1999-11-08, 百拇医药
单位：湖南医科大学分子生物学研究中心，湖南 长沙 410078
关键词：人髓系白血病；细胞株HL-60；基因表达；化疗；维甲类化合物
中国医师杂志000404
【摘要】 本文研究了全反式维甲酸和9-顺维甲酸对HL-60细胞增殖及凋亡的影响，并用半 定量RT-PCR技术检测了人髓系白血病细胞株HL-60细胞中同源盒HOXA1基因的表达。结果表明 ，全反式维甲酸及9-顺维甲酸均能抑制HL-60细胞增殖并能促进其凋亡，这种效应在两药联 用时更为明显，根据上述结果，我们认为两药联用的抗癌机制之一可能是通过影响HOXA1基 因表达的网络调节系统来实现的，但在不同的白血病中，其影响程度可能有所差异。因此， 有必要更进一步探讨两种药物的抗癌调节模式，以便制定一个更有效的联合化疗方案。
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[中图分类号] R733.71；R979.1+9 [文献标识码] A
[文章编号] 1008-1372(2000)04-0200-03
Changes of Gene Expression of HL-60 Cells Induced by
Synergism of Two Retinoid Compounds
WANG Ji-wei,CHEN Han-chun,TIAN Jing-yan,et al
(Research Center of Molecular Biology,Hunan Medical University Changsha,410078,China)
, 百拇医药
【Abstract】 In this paper,the effects of all-trans retinoic and 9-cis retinoic acid on the proliferation and apoptosis of HL-60 cell line were investigated.The expressions of Homeobox gene HOX A1 in human myeloid leukemia cell line HL-60 were determined by using semi-quantitative reverse transcription (RT-PCR) method.The results indicated that both all-trans retinoic acid and 9-cis retinoic acid showed an ability to suppress the proliferation of the HL-60 cells,and could promote apoptosis of the cell line specifically,when combinative treatment of the two drugs were used,their efficacy was more obviously than used alone.
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On the basis of the data,we consider that one of mechanisms for the anti-cancer synergism of the two compounds might be influence on the network regulation system of HOXA1 gene expression,and the extent of the influence has some difference in different leukemias.Therefore,the anticancer regular pattern of the two drugs should further be explored,in order to make a more effective combinative chemotherapy scheme.
Key Wods Human myeloid leukemia;HL-60 cell line;Gene expression;Chemotherapy,Retinoid compound
, 百拇医药
全反式维甲酸(ATRA)是一种可诱导某些癌变细胞向正常细胞逆转或分化的药物，目前已在临床上被广泛用于癌症特别是急性早幼粒细胞白血病(APL)的治疗。由于此药长期服用已被证明具有一定的毒副作用，因而临床上正在努力寻找一些能有效减少上述问题的合理用药方案。从某种意义上说，此目标的最终实现依赖于人们对ATRA作用机理及联合化疗分子机制的更深入了解。作者在以前的研究中曾发现，ATRA在诱导人髓系白血病细胞株HL-60细胞分化时，改变了同源盒HOXA1基因的表达，并据此提出，这种影响可能是ATRA诱导白血病细胞分化的前提之一[1]。在此基础上，本文研究了另一已被广泛用于某些癌症治疗的维甲类药物—9-顺维甲酸(9—cis RA)，对HOXA1基因的表达有何影响，并进一步探讨了此药是否与ATRA具有协同诱导白血病细胞分化的作用，以期为白血病联合化疗方案的制定提供一些合理的依据。
1 材料与方法
1.1 细胞的培养 人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞为我室保存。用补充有10%新生小牛血清(杭州四季青公司产品)，及适当浓度青、链霉素的RPMI 1640培养液在37℃，5%CO2的条件下培养。取对数生长期细胞，调节至2×105。ml-1细胞浓度后加药。
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1.2 药物作用分组 共分成四组。单用ATRA组，单用9-cis RA组，联合用药组(ATRA+9-cisRA)，无水乙醇为对照组。药物组单用时的作用浓度为1μm，联用时剂量减半。对照组加入等体积的溶剂。
1.3 剂量反应曲线 ATRA及9-cis RA均购自美国Sigma公司(分析纯)，分别用无水乙醇配成储液，置-20℃冰箱避光保存。试验时用生理盐水稀释，乙醇的浓度小于0.1%。于给药后不同时间用台盼兰拒染法染色，光镜下行活细胞计数。分别计数三次取平均值，以此判明各组药物对细胞增殖的影响。
1.4 细胞形态学改变 取各实验组细胞悬液离心涂片，自然干燥后用瑞氏法染色5min。油镜下观察细胞形态并按早幼粒、中幼粒、晚幼粒、杆状和分叶粒细胞进行分类，同时进行凋亡细胞计数。每张玻片最少观察200个细胞，反复3次，然后将其凋亡细胞数取平均值。
1.5 HOXA1基因mRNA水平的检测 将经不同药物组合处理后的HL-60细胞及白血病患者的单核细胞，用Trizol总RNA提取液(Promega公司产品)抽提总RNA后，按照文献[1]法所述引物及条件，用半定量RT-PCR技术检测药物作用前后，细胞内HOXA1基因的表达情况。
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1.6 统计处理 所有数据均采用
±s表示，并进行t检验。2 结果
2.1 不同药物组合对HL-60细胞生长的影响 从药物作用生长曲线中可以看出，三个加药组在处理3d后，均不同程度地抑制了HL-60细胞的生长(与对照组比较，P<0.05及P<0.01)，但两药联用的这种抑制作用更强(与其它用药组比较，P<0.05)，差异均有显著性，见图1。
2.2 各组不同时间细胞形态变化及凋亡细胞数 对照组HL-60细胞的形态为圆形，胞体较大，核浆比例高。胞浆中可见大小不等、粗大不规则的嗜天青颗粒。加入ATRA作用后，细胞向分叶核方向发展，表明细胞被ATRA所诱导分化，但在作用48h时鲜见凋亡细胞的出现。与此不同，加入9-cis RA组的HL-60细胞，在药物作用48h，镜下便可见凋亡细胞的典型特征。其形态学改变的主要特征包括细胞核固缩、核膜皱缩、细胞膜皱缩外突等。在药物联用组，96h凋亡细胞出现的数量比药物单用组明显增多，见附表。
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图1 HL-60细胞在不同药物作用下的细胞生长曲线
附表 药物处理HL-60细胞不同时间凋亡细胞计数(
±s，%) 组别实验
次数
作用时间(h)
24
48
96
对照组
3
0.6±0.3
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2.2±0.7
2.7±1.0*
ATRA组
3
6.8±2.4
8.6±2.3
14.8±2.8*
9-cis RA组
3
11.6±1.8#
22.8±2.5##
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49.6±3.4**##
联合用药组
3
13.6±2.5##
24.3±2.1##
68.9±3.0**##△
注：各项计数200个细胞，3次实验检测结果经t检验，与24h的凋亡细胞数比较，*P<0.05(t>2.80)，**P<0.01(t>7.00)；与ATRA组比较，#P<0.05(t>5.59)，##P<0.01(t>3.760)；与9-cis RA组比较△P<0.05(t＝6.03)
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上表显示：四组细胞凋亡数均随时间的延长而凋亡数增加，用药96h后均与24h比较差异有显著性；用药三组在24h、48h、96h中凋亡数与对照组比较，差异均有显著性或非常显著性(P<0.05或P<0.01)，而9-cis RA与ATRA比较作用显著(凋亡数比较P<0.05)，联合用药组与9-cis RA组比较，96h时差异非常显著(P<0.01)。
2.3 ATRA和9-cis RA对HL-60细胞HOXA1基因表达的动力学检测 见图2。结果表明，与对照组相比，加药组均在药物作用的早期便上调了HOXA1基因的表达，说明这两种不同的维甲酸异构体对HOXA1基因的表达均有影响。24h达高峰，但三组间无统计学差异。在作用96h后，两组联用对HOXA1基因的下调作用要强于单用时的影响，差异非常显著(P<0.01)。另外，我们还检测另一衍生白血病的细胞株K562，此类药物组合对其HOXA1基因表达的影响，发现上述药物组合并不对其表达水平产生任何影响。
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图2 不同加药组对HL-60细胞HOXA1基因表达的影响
3 讨论
临床上应用ATRA治疗APL能获得较高的完全缓解率。分子机理研究已初步证明，这种作用实现的前提之一是维甲酸受体α(RARα)的活化，另一方面，由于在细胞发育过程中有许多其它起关键调节作用的基因存在，如本文所研究的同源盒HOX家族基因，它能在ATRA的作用下不同程度地在RNA水平发生表达的改变，因而现在人们已逐渐开始关注此类基因的表达改变在ATRA诱导白血病细胞分化中的作用[3]。目前的一个较为肯定的观点认为：RARa被ATRA激活后，可与某些HOX基因5’调控区上的维甲酸应答元件(RARE)结合，重新启动特定白血病细胞(如HL-60、NB4)因癌变而关闭了的分化程序，实现ATRA诱导癌变细胞向成熟分化的治疗效应[4]。本研究可见，用药后基因表达的波动也证实了这一点。
鉴于ATRA目前还主要局限于初发APL患者的治疗，而RARα又已知能被某些其它药物如VitD3等协同活化，因而已有人开始尝试将ATRA或其异构体与这些化合物联合，用于治疗其它类型癌症的可能性[5]。作为ATRA的一种异构体，9-顺维甲酸(9-cis RA)早在100多年前便已被人们认识到是一种能有效杀伤某些癌变细胞的抗癌药物。已有报导证实，这种效应主要是通过诱导癌细胞凋亡来完成的[6]。虽然已有人尝试将ATRA与9-cis RA联合用于白血病的治疗，但这种药物组合的理论依据及适用范畴目前尚无人对其加以探讨。本研究用已知能被ATRA诱导分化的HL-60细胞为实验模型，比较这两种作用机制迥异的药物单用及联用时，对细胞增殖、分化及凋亡的影响。研究结果证实：⑴两种药物均能有效地抑制HL-60细胞的增殖，但即使在浓度减半的情况下，联用对细胞增殖的抑制作用也明显强于药物单用时。提示，临床上这种药物的联用，有可能在最大限度地减少毒副作用的前提下，更好地达到治疗的目的。⑵两药联用虽然也可诱导HL-60细胞向成熟粒系分化，但增强癌细胞的凋亡似乎是其更重要的途径。⑶已知，HOX基因表达的改变主要是影响造血细胞的分化[7]，本组两药联用能更有效的调节HL-60细胞内HOXA1基因的表达，而对K562则无此作用。暗示对诱导分化的协同作用，也可能是两药联用引发癌变细胞死亡的原因之一，但在不同的白血病细胞内，这种效应可能是各异的。
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参考文献
[1]王吉伟，田菁燕，陈汉春.同源盒HOXA1基因的髓系白血病细胞内的表达.湖南医学 2000；17(1)：3～4
[2]王吉伟，田菁燕，陈汉春.HL-60细胞内同源盒HOXA1 cDNA基因的克隆.中国现代医学杂志 1999；12(12)：14～16
[3]王吉伟，王学铭.维甲酸、同源盒基因的细胞分化.中国医师杂志 1999；1(3)：56～57
[4]Look AT.Oncogenic transcripition factors in the human acute leukemias.Science 1997；278：1059～1066
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[6]Fujimura S,Suzumiya J,Anzai K,et al.Retinoic acids growth inhibition and apoptosis in adult T-cell leukemia (ATL) cell lines.Leukemia Res 1998；22：611～618
[7]Lawrence HJ,Suvageau G,Humphries RK,et al.The role of HOX humeobox genes in normal and leukemichematopoiesis Stem.Cell 1996；14：281～286
收稿日期：1999-11-08, 百拇医药