TNFα在严重烫伤大鼠骨骼肌泛素依赖的蛋白质降解途径中的作用
作者：唐新国 董燕麟
单位：唐新国(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学 教研室，重庆 400038)；董燕麟(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学 教研室，重庆 400038)
关键词：TNFα；烫伤；Ub;蛋白质降解
第三军医大学学报000412 提 要： 目的 探讨大鼠烫伤后骨骼肌蛋白质降 解增强的机制和TNFα作用的关系。方法 以30%和37%TBSA全层烫伤大鼠 为模型，观察局部和远隔部位比目鱼肌泛素(Ub)含量、酪氧酸(Tyr)释放量、血清TNFα水平 及TNFα作用下比目鱼肌Ub和Ub mRNA表达水平。结果 TNFα注射后24 h 内比目鱼肌Ub、Ub mRNA、Tyr释放量均显著增加。烫伤后伤肢Ub含量、Tyr释放量皆显著增 加，变化趋势一致；未伤肢Ub增加而Tyr释放量增加不明显；血清TNFα水平显著升高。TNF α处理后烫伤大鼠伤肢、未伤肢比目鱼肌Ub含量、Tyr释放量皆显著升高，且伤肢变化更显 著。烫伤、TNFα的交互效应显著。结论 烫伤可能借烫伤局部产生的TN Fα作用于Ub依赖系统促进烫伤局部骨骼肌蛋白质降解。
, 百拇医药
中图法分类号： R392.1;R644 文献标识码: A
文章编号：1000-5404(2000)04-0341-0 4
Effects of TNFα on ubiquitin-dependent skeletal muscle proteolysis in severe scalding rats
TANG Xin-guo, DONG Yan-lin
(Department of Biochemistry, Th ird Military Medical University, Chongqing 400038,China)
Abstract： Objective To study the mechanism of intensified proteolysis of skeletal muscles after severe scalding in rats and its relation w ith TNFα. Methods Rats with 30% and 37% TBSA full thickness sc alding served as the animal model. The content of ubiquitin (Ub) and the amount of tyrosine released in the soleus muscle and in the scalded and remote regions were determined. The serum level of TNFα was measured. In addition, the express ion of Ub protein and mRNA in the soleus after the injection of TNFα was observ ed. Results 24 hours after TNFα injection, the expression of U b protein and mRNA and the amount of tyrosine release in the soleus were signifi cantly increased. The Ub content and the amount of tyrosine release were signifi cantly increased in a similar tendency in the scalded limb; in the unscalded lim b, the increase of Ub content was observed but no significant increase of tyrosi ne was found. After the treatment of TNFα, Ub content and the amount of tyrosin e release in the soleus were markedly increased in both the scalded and unscalde d limbs but the changes were more marked in the scalded one. The cross effects o f scalding and TNFα were clearly observed. Conclusion After sc alding, the production of certain amount of TNFα induced by scalding itself can act on the Ub-dependent system to promote proteolysis of skeletal muscles in s calded region.
, 百拇医药
Key words：TNFα; scalding; ubiquitin; proteolysis; rat▲
哺乳动物细胞内有多种不同的蛋白质降解途径承担着蛋白质的分解。其中泛素(Ubiquit in,Ub)依赖的26S蛋白酶体途径由多个酶参与共同完成[1]。我室早期研究提示Ub依 赖的蛋白质降解途径是烫伤后骨骼肌蛋白质降解增强的主要原因[2]。在烫伤早期 主要限于烫伤局部骨骼肌蛋白质分解代谢增强，无法用激素的作用得到圆满的解释。肿瘤坏 死因子-α(Tumour ne- crosis factor-α,TNFα)、IL-1、IL-6均参与增 强创伤机体蛋白质分解代谢，但机理不清楚。为此建立大鼠烫伤模型，以进一步探讨烫伤后 大鼠骨骼肌蛋白质降解增强和TNFα的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
, 百拇医药
Wistar雄性大鼠，体重70～80 g，由第三军医大学动物所提供。
1.2 主要材料与试剂
1.2.1 泛素 Sigma。
1.2.2 泛素抗血清(兔抗鼠) 美国Dr. Steve Nocker赠予本室。
1.2.3 菌种 为JM101，携含多聚泛素基因的质粒pRB130由澳大利亚Dr. Rohan Baker惠 赠本室。
1.2.4 Dig标记、检测试剂 Boehinger Mannheim。
1.2.5 TNF试剂盒、rHu-TNFα 北京邦定生物医学试剂公司。
1.2.6 DNA预杂交缓冲液(高SDS缓冲液) 7% SDS，50 mmol/L磷酸钠盐缓冲液(pH 7.0) ，50%甲酰胺，2%封阻试剂，5×SSC，0.1×月桂酰肌氨酸。
, http://www.100md.com
1.2.7 Krebs-Ringers缓冲液 碳酸盐缘冲液(pH 7.4),5 mmol/L葡萄糖,0.13% BSA,0.5 mmol/L放线菌酮，除酪氨酸外的其它19种大鼠血浆浓度的编码氨基酸。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物的处理 30%与37%TBSA烫伤模型按我室建立的方法进行[3]。TN Fα处理动物为rHu-TNFα经尾静脉注入，剂量为670×103U/kg体重，共注射3次，间隔30 min。剪毛或心脏穿刺采集血液标本，断头活杀取比目鱼肌。
1.3.2 实验动物分组 大鼠随机分组，每组6只。
1.3.2.1 烫伤与对照组 分正常对照组和伤后第3天(3PBD)、第5天(5PBD)、第7天(7PBD) 共4组。
, 百拇医药
1.3.2.2 rHu-TNFα处理组 分正常对照组和最后一次注射后6、12、24 h 3个时相共 4组。
1.3.2.3 烫伤与注射rHu-TNFα双因素处理组 伤后第3天(3PBD)分为未烫伤、烫伤大鼠 的未伤肢与伤肢3组，注射rHu-TNFα处理则是伤后第2天(2PBD)注射rHu-TNFα，于第3天 (3PBD)分为未烫伤注射与烫伤注射的未伤肢与伤肢3组。
1.3.3 比目鱼肌蛋白质降解速率测定[酪氨酸(Tyrosine,Tyr)体外总释放量] 按本室 已建立的方法测定每克比目鱼肌每2 h的Tyr释放量[6]。Tyr含量测定用改良荧光分 光光度法测定。
1.3.4 血清TNFα水平测定 用邦定医学试剂公司的试剂盒测定。
1.3.5 组织中泛素的测定 用标准泛素或待测比目鱼肌匀浆上清液包被微孔板，用泛素 抗血清与酶标二抗建立间接ELISA法测定每克比目鱼肌的泛素蛋白含量。
, 百拇医药
1.3.6 组织总RNA的提取 肌肉于D溶液中匀浆，酚、氯仿∶异丙醇抽提，无水乙醇沉淀 ，DEPC处理的ddH2O溶解。
1.3.8 泛素DNA探针的制备[4] 碱裂解法提取并初步纯化质粒，酶切后低熔点 琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，Dig随机引物法标记泛素cDNA。
1.3.9 泛素mRNA水平测定 建立Slot blot法测定泛素mRNA。
1.4 数据统计学处理
用第三军医大学的统计程序处理，分别用一元线性回归、单因素方差分析、有重复固定 型双因素方差分析。
2 结果
2.1 烫伤和rHu-TNFα对在体大鼠比目鱼肌Tyr释放量的影响
, 百拇医药
在体rHu-TNFα处理后24 h大鼠比目鱼肌Tyr释放量比未经TNFα处理的对应组有显著 增加(P< 0.05)；烫伤大鼠未伤肢在3PBD与未烫伤大鼠相应组没有显著差 异(P>0.05 )；烫伤大鼠伤肢较未伤肢和未烫伤大鼠的相应组，Tyr释放量皆有显著增加(P< 0.0 5)；烫伤、TNFα的单独效应皆有非常显著差异(P< 0.01)，见表1。
表1 在体烫伤和rHu-TNFα处理组比目鱼肌Tyr
释放量(nmol.g-1.2 h-1)
Tab 1 Tyrosine release of the soleus muscle of scalded and
r Hu-TNFα treated groups (nmol.g-1.2 h-1)
, 百拇医药
Scalded group
Unscalded group
Unscalded leg
scaled leg
No TNFα
211±4.9
213±5.5
240±12.5* △
TNFα injection
258±10.7★
264±20.0★
, http://www.100md.com
303±13.3★ * △
★：P<0.05 vs no TNFα；*：P<0.05 vs unscalded group；
△：P<0.05 vs unscalded leg
2.2 大鼠烫伤后血清TNFα水平的变化
大鼠烫伤后的3PBD、5PBD、7PBD血清中TNFα水平较对照组升高非常显著(P< 0.01)，3PBD时最高，5PBD时有所下降，7PBD时又升高，见表2。
表2 烫伤后血清TNFα浓度
Tab 2 Serum TNFα levels after scalding
, http://www.100md.com Scalded group(d)
Control
3
5
7
TNFα (ρB/ng.ml-1)
0.9±0.16
12.88±3.47* *
4.97±2.07* *
7.14±1.58* *
, 百拇医药
Times
14.2
5.5
7.8
* *：P<0.01 vs control
2.3 rHu-TNFα对在体大鼠比目鱼肌Tyr释放量的影响
在体rHu-TNFα注射后6、12、24 h比目鱼肌Tyr释放量与对照组比较，增高非常显著( P< 0.01)，24 h虽有所下降，但仍显著地高于对照组(P < 0.05)。在测定时段随时间的推移变化趋于减小，见表3。
表3 在体rHu-TNFα处理组比目鱼肌Tyr释放量
Tab 3 The effects of Tyrosine release of soleus after
, http://www.100md.com
TNFα injection group (h)
Control
6
12
24
Tyr release(nmol.g-1.2 h-1)
211±4.9
393±46.0* *
312±37.7* *
258±10.7*
, http://www.100md.com
Percentage(%)
100
186
148
122
*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.4 严重体表烫伤后比目鱼肌泛素蛋白含量变化
烫伤后3PBD、7PBD比目鱼肌泛素蛋白含量比对照组有显著增加(P< 0. 01和P< 0.05),而在3PBD与对照组无显著差异，见表4。
表4 烫伤组比目鱼肌泛素蛋白含量
Tab 4 Contents of Ubiquitin of soleus in scalded group
, http://www.100md.com
Scalded group (d)
Control
3
5
7
Ubiquitin comtent (μg/g)
36.4±3.6
62.8±6.0* *
40.4±5.0
46.4±7.0*
Percentage (%)
, http://www.100md.com
100
173
111
127
*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.5 rHu-TNFα对在体比目鱼肌泛素mRNA和泛素蛋白水平的影响
注射rHu-TNFα后的6、12 h比目鱼肌泛素mRNA水平比正常对照组显著增高(P < 0. 01)，24 h后虽含量有所降低，但仍显著高于对照(P< 0.05)。3个时相泛 素蛋白含量比对照组增高皆非常显著(P< 0.01)，见表5。
表5 在体rHu-TNFα处理组比目鱼肌泛素mRNA
, 百拇医药
表达与泛素蛋白含量的变化
Tab 5 Changes of ubiquitin contents and of ubiquitin mRNA ex pression after rHu-TNFα injection in vivo
The unit of ubiquitin mRNA: Arbitrary unit.control mean-1 ；*：P< 0.05,* *：P< 0.01 vs control
rHu-TNFα injection(h)
Control
6
12
, http://www.100md.com
24
Ubiquitin mRNA
100±20
342±83* *
278±47* *
170±47*
Ubiquitin (μg/g)
39.6±2.5
155.4±10.5* *
124.4±19.3* *
, 百拇医药
73.7±13.8* *
Ubiquitin(%)
100
392
314
186
The unit of ubiquitin mRNA: Arbitrary unit*control mean-1；*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.6 烫伤和rHu-TNFα对在体比目鱼肌泛素蛋白含量的影响
在体rHu-TNFα处理后，正常大鼠，烫伤大鼠未伤肢、伤肢比目鱼肌泛素蛋白含量显著 增加(P< 0.05)；烫伤组未伤肢、伤肢皆显著高于未烫伤组(P< 0.05)；烫伤组中伤肢 泛素含量显著高于未伤肢(P< 0.05)；rHu-TNFα、烫伤对比目鱼肌泛素 含量的单独和交互效应非常显著(P< 0.01)，见表6。
, http://www.100md.com
表6 在体烫伤和rHu-TNFα处理组比目鱼肌
泛素蛋白含量(ωB/μg.g-1)
Tab 6 Contents of Ubiquitin of soleus after scalding and
in rHu-TNFα treated group in vivo(ωB/μg.g-1)
Scalded group
Unscalded group
Unscalded leg
, 百拇医药 Scalded leg
No TNFα
36.9±2.5
65.5±4.9*
86.2±7.9* △
TNFα injection
73.7±13.8★
81.5±5.3★ *
132.4±13.9★ * △
★：P<0.05 vs no TNFα；*：P<0.05 vs unscalded group；
, http://www.100md.com
△：P<0.05 vs unscalded leg
3 讨论
3.1 严重烫伤诱导TNFα的产生
李林等[5]观察到烫伤大鼠血清，未伤肢。伤肢骨骼肌TNFα水平持续升高，伤 肢显著高于未伤肢和血清。本文烫伤后的3PBD、5PBD、7PBD血清TNFα水平显著高于正常对 照。结果与Liu等[6]的相似。TNFα由多种介质刺激下的网状内皮细胞系统产生。 创伤早期TNFα的产生是机体对组织损伤产生的应激反应，本试验观测3个时相点血清TNFα 水 平升高可能为晚期刺激因素LPS、TSST-1、补体等的刺激所致。7PBD时血清TNFα高于3PBD 可能与烫伤后感染的发生有关，感染与局部产生的LPS刺激局部巨噬细胞等释放TNFα，从而 引起血中TNFα的升高。
3.2 rHu-TNFα对烫伤大鼠骨骼肌蛋白质分解代谢速率的影响
, 百拇医药
正常大鼠经rHu-TNFα处理后6、12、24 h比未处理组，烫伤大鼠的伤肢、未伤肢经rH u-TNFα处理后比未处理组Tyr释放量皆有显著增加，提示TNFα能对在体正常和烫伤大鼠的 伤肢、未伤肢的骨骼肌蛋白质降解皆有促进作用，即TNFα具有全身效应，能通过血路促进 骨骼肌蛋白质降解。Goodman[7]也发现TNFα能增强骨骼肌蛋白质降解。
烫伤后血清TNFα水平显著升高，但未能引起未伤肢Tyr释放量显著增加。Sternes等 [8]研究认为低剂量TNFα不能促进骨骼肌蛋白质降解。推测血清TNFα主要来自烫伤 局部，随血流运输达未伤肢，其浓度会有所下降。TNFα在哺乳动物血流中的半寿期仅为6～ 20 min。循环因子TNFα-BP能在急性期下向调节TNFα生物活性，但其免疫活性并未减弱。 李林等[5]发现烫伤大鼠伤肢比目鱼肌中TNFα含量显著高于未伤肢。提示烫伤局部 产生TNFα的增多成为血中TNFα水平升高的主要原因，同时引起烫伤局部骨骼肌蛋白质分解 代谢增强。
, 百拇医药
3.3 烫伤后比目鱼肌泛素水平
泛素是一种热休克蛋白，在3PBD、5PBD、7PBD骨骼肌中泛素含量皆有增加，伤肢泛素的 增加与蛋白质降解显著相关。谭银玲等[2]曾发现大鼠于1PBD、2PBD、3PBD伤 、未 伤肢泛素皆显著增加，伤肢变化更显著，且烫伤局部蛋白质分解的主要原因是依赖泛素系统 26S蛋白酶体活性的增强。Lowell等[9]发现溶酶体与骨骼肌中肌原纤维蛋白质降解 无关。大鼠饥饿去 神经导致的肌萎缩中泛素表达增加，26S蛋白酶复合体的某些亚基的mRNA增加，同时骨骼肌 蛋白质分解代谢增强[10]。故本研究认为泛素表达水平的提高有利于待分解蛋白质 的泛素化，从而引起烫伤局部比目鱼肌蛋白质分解增强。未伤肢中二者不相关，机制尚需进 一步研究。
3.4 TNFα对泛素mRNA、泛素蛋白水平的影响
rHu-TNFα处理后大鼠骨骼肌泛素mRNA、泛素水平皆显著提高，这与Martinez等[ 11]的报道相似，且与Tyr释放量的增加显著相关。提示在体TNFα急性处理可激活泛 素依赖的系统从而促进骨骼肌蛋白质降解。TNFα对该系统的激活是否需要糖皮质激素的参 与还有待探讨。
, 百拇医药
TNFα对正常大鼠、烫伤大鼠骨骼肌泛素表达皆有显著促进作用，同时Tyr释放显著提高 。烫伤能刺激受损局部TNFα的产生，从而引起局部泛素依赖的蛋白质降解途径活性增强。
烫伤与rHu-TNFα对比目鱼肌泛素表达的交互效应显著，提示烫伤使受损局部对TNFα 的作用变得敏感，再遇外源TNFα刺激时，可能局部释放更多TNFα等介质，从而使局部骨骼 肌泛素表达水平提高。
基金项目：全军“九五”指令性攻关项目(96L043)
作者简介：唐新国(1966-)，男，硕士，讲师，现在南京军 医学院生化教研室工作，南京 210099。
参考文献：
[1] Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathwa y[J]. Cell,1994,79(1):13-21.
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[2] 谭银玲，董燕麟.严重烫伤大鼠骨骼肌蛋白质降解途径及泛素作用的研究[J ]. 中华创伤杂志，1998，14(6)：384-387.
[3] 黄涛生，董燕麟.离体骨骼肌蛋白质代谢速率的测定[J].生物化学与生物物 理学进展，1988，15(1)：64-67.
[4] 丁.萨姆布鲁克，EF.费里奇，T.曼尼阿蒂斯 著.金冬雁 译.分子 克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1996.16-395.
[5] 李 林，董燕麟，杨 春.严重体表烫伤早期TNF对骨骼肌蛋白质分解代谢影 响的实验研究[J].第三军医大学学报，1995，17(5)：382-386.
[6] Liu X S, Luo Z H, Yang Z C, et al. The significance of ch anges in serum tumour necrosis factor (TNF) activity in severely burned patients [J]. Burn,1994,20(1):40-44.
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[7] Goodman M N. Tumor necrosis factor induces skeletal muscle protein breakdown in rats[J]. Am J Physiol,1991,260(Endocrinol Metab 23):E727-E730.
[8] Sternes H F, Warren R S, Conti P S, et al. Redistribution of a mino acids in rat liver and muscle induced by tumor necrosis factor requires the adrenal response[J], Surg Forum,1987,18:41-42.
[9] Lowell B B, Ruderman N B, Goodman M N. Evidence that lysosomes are not involved in the degradation of myofibrillar proteins in rat skeletal muscle [J]. Biochem J,1986,234(1):237-240.
, 百拇医药
[10] Medina R, Wing S S, Goldberg A L. Increase in levels of po lyubiquitin and proteasome mRNA in skeletal muscle during starvation and denervation atrophy [J]. Biochem J,1995,307(3):631-637.
[11] Martinez C G, Llovera M, Agell N, et al. Ubiquitin gene expres sion in skeletal musscle is increased by tumour necrosis factor-α[J], Bioche m Biophysi Res Comm,1994,201(2):682-686.
收稿日期：1999-09-30；修回日期：1999-12-22, http://www.100md.com
单位：唐新国(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学 教研室，重庆 400038)；董燕麟(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学 教研室，重庆 400038)
关键词：TNFα；烫伤；Ub;蛋白质降解
第三军医大学学报000412 提 要： 目的 探讨大鼠烫伤后骨骼肌蛋白质降 解增强的机制和TNFα作用的关系。方法 以30%和37%TBSA全层烫伤大鼠 为模型，观察局部和远隔部位比目鱼肌泛素(Ub)含量、酪氧酸(Tyr)释放量、血清TNFα水平 及TNFα作用下比目鱼肌Ub和Ub mRNA表达水平。结果 TNFα注射后24 h 内比目鱼肌Ub、Ub mRNA、Tyr释放量均显著增加。烫伤后伤肢Ub含量、Tyr释放量皆显著增 加，变化趋势一致；未伤肢Ub增加而Tyr释放量增加不明显；血清TNFα水平显著升高。TNF α处理后烫伤大鼠伤肢、未伤肢比目鱼肌Ub含量、Tyr释放量皆显著升高，且伤肢变化更显 著。烫伤、TNFα的交互效应显著。结论 烫伤可能借烫伤局部产生的TN Fα作用于Ub依赖系统促进烫伤局部骨骼肌蛋白质降解。
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中图法分类号： R392.1;R644 文献标识码: A
文章编号：1000-5404(2000)04-0341-0 4
Effects of TNFα on ubiquitin-dependent skeletal muscle proteolysis in severe scalding rats
TANG Xin-guo, DONG Yan-lin
(Department of Biochemistry, Th ird Military Medical University, Chongqing 400038,China)
Abstract： Objective To study the mechanism of intensified proteolysis of skeletal muscles after severe scalding in rats and its relation w ith TNFα. Methods Rats with 30% and 37% TBSA full thickness sc alding served as the animal model. The content of ubiquitin (Ub) and the amount of tyrosine released in the soleus muscle and in the scalded and remote regions were determined. The serum level of TNFα was measured. In addition, the express ion of Ub protein and mRNA in the soleus after the injection of TNFα was observ ed. Results 24 hours after TNFα injection, the expression of U b protein and mRNA and the amount of tyrosine release in the soleus were signifi cantly increased. The Ub content and the amount of tyrosine release were signifi cantly increased in a similar tendency in the scalded limb; in the unscalded lim b, the increase of Ub content was observed but no significant increase of tyrosi ne was found. After the treatment of TNFα, Ub content and the amount of tyrosin e release in the soleus were markedly increased in both the scalded and unscalde d limbs but the changes were more marked in the scalded one. The cross effects o f scalding and TNFα were clearly observed. Conclusion After sc alding, the production of certain amount of TNFα induced by scalding itself can act on the Ub-dependent system to promote proteolysis of skeletal muscles in s calded region.
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Key words：TNFα; scalding; ubiquitin; proteolysis; rat▲
哺乳动物细胞内有多种不同的蛋白质降解途径承担着蛋白质的分解。其中泛素(Ubiquit in,Ub)依赖的26S蛋白酶体途径由多个酶参与共同完成[1]。我室早期研究提示Ub依 赖的蛋白质降解途径是烫伤后骨骼肌蛋白质降解增强的主要原因[2]。在烫伤早期 主要限于烫伤局部骨骼肌蛋白质分解代谢增强，无法用激素的作用得到圆满的解释。肿瘤坏 死因子-α(Tumour ne- crosis factor-α,TNFα)、IL-1、IL-6均参与增 强创伤机体蛋白质分解代谢，但机理不清楚。为此建立大鼠烫伤模型，以进一步探讨烫伤后 大鼠骨骼肌蛋白质降解增强和TNFα的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
, 百拇医药
Wistar雄性大鼠，体重70～80 g，由第三军医大学动物所提供。
1.2 主要材料与试剂
1.2.1 泛素 Sigma。
1.2.2 泛素抗血清(兔抗鼠) 美国Dr. Steve Nocker赠予本室。
1.2.3 菌种 为JM101，携含多聚泛素基因的质粒pRB130由澳大利亚Dr. Rohan Baker惠 赠本室。
1.2.4 Dig标记、检测试剂 Boehinger Mannheim。
1.2.5 TNF试剂盒、rHu-TNFα 北京邦定生物医学试剂公司。
1.2.6 DNA预杂交缓冲液(高SDS缓冲液) 7% SDS，50 mmol/L磷酸钠盐缓冲液(pH 7.0) ，50%甲酰胺，2%封阻试剂，5×SSC，0.1×月桂酰肌氨酸。
, http://www.100md.com
1.2.7 Krebs-Ringers缓冲液 碳酸盐缘冲液(pH 7.4),5 mmol/L葡萄糖,0.13% BSA,0.5 mmol/L放线菌酮，除酪氨酸外的其它19种大鼠血浆浓度的编码氨基酸。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物的处理 30%与37%TBSA烫伤模型按我室建立的方法进行[3]。TN Fα处理动物为rHu-TNFα经尾静脉注入，剂量为670×103U/kg体重，共注射3次，间隔30 min。剪毛或心脏穿刺采集血液标本，断头活杀取比目鱼肌。
1.3.2 实验动物分组 大鼠随机分组，每组6只。
1.3.2.1 烫伤与对照组 分正常对照组和伤后第3天(3PBD)、第5天(5PBD)、第7天(7PBD) 共4组。
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1.3.2.2 rHu-TNFα处理组 分正常对照组和最后一次注射后6、12、24 h 3个时相共 4组。
1.3.2.3 烫伤与注射rHu-TNFα双因素处理组 伤后第3天(3PBD)分为未烫伤、烫伤大鼠 的未伤肢与伤肢3组，注射rHu-TNFα处理则是伤后第2天(2PBD)注射rHu-TNFα，于第3天 (3PBD)分为未烫伤注射与烫伤注射的未伤肢与伤肢3组。
1.3.3 比目鱼肌蛋白质降解速率测定[酪氨酸(Tyrosine,Tyr)体外总释放量] 按本室 已建立的方法测定每克比目鱼肌每2 h的Tyr释放量[6]。Tyr含量测定用改良荧光分 光光度法测定。
1.3.4 血清TNFα水平测定 用邦定医学试剂公司的试剂盒测定。
1.3.5 组织中泛素的测定 用标准泛素或待测比目鱼肌匀浆上清液包被微孔板，用泛素 抗血清与酶标二抗建立间接ELISA法测定每克比目鱼肌的泛素蛋白含量。
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1.3.6 组织总RNA的提取 肌肉于D溶液中匀浆，酚、氯仿∶异丙醇抽提，无水乙醇沉淀 ，DEPC处理的ddH2O溶解。
1.3.8 泛素DNA探针的制备[4] 碱裂解法提取并初步纯化质粒，酶切后低熔点 琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，Dig随机引物法标记泛素cDNA。
1.3.9 泛素mRNA水平测定 建立Slot blot法测定泛素mRNA。
1.4 数据统计学处理
用第三军医大学的统计程序处理，分别用一元线性回归、单因素方差分析、有重复固定 型双因素方差分析。
2 结果
2.1 烫伤和rHu-TNFα对在体大鼠比目鱼肌Tyr释放量的影响
, 百拇医药
在体rHu-TNFα处理后24 h大鼠比目鱼肌Tyr释放量比未经TNFα处理的对应组有显著 增加(P< 0.05)；烫伤大鼠未伤肢在3PBD与未烫伤大鼠相应组没有显著差 异(P>0.05 )；烫伤大鼠伤肢较未伤肢和未烫伤大鼠的相应组，Tyr释放量皆有显著增加(P< 0.0 5)；烫伤、TNFα的单独效应皆有非常显著差异(P< 0.01)，见表1。
表1 在体烫伤和rHu-TNFα处理组比目鱼肌Tyr
释放量(nmol.g-1.2 h-1)
Tab 1 Tyrosine release of the soleus muscle of scalded and
r Hu-TNFα treated groups (nmol.g-1.2 h-1)
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Scalded group
Unscalded group
Unscalded leg
scaled leg
No TNFα
211±4.9
213±5.5
240±12.5* △
TNFα injection
258±10.7★
264±20.0★
, http://www.100md.com
303±13.3★ * △
★：P<0.05 vs no TNFα；*：P<0.05 vs unscalded group；
△：P<0.05 vs unscalded leg
2.2 大鼠烫伤后血清TNFα水平的变化
大鼠烫伤后的3PBD、5PBD、7PBD血清中TNFα水平较对照组升高非常显著(P< 0.01)，3PBD时最高，5PBD时有所下降，7PBD时又升高，见表2。
表2 烫伤后血清TNFα浓度
Tab 2 Serum TNFα levels after scalding
, http://www.100md.com Scalded group(d)
Control
3
5
7
TNFα (ρB/ng.ml-1)
0.9±0.16
12.88±3.47* *
4.97±2.07* *
7.14±1.58* *
, 百拇医药
Times
14.2
5.5
7.8
* *：P<0.01 vs control
2.3 rHu-TNFα对在体大鼠比目鱼肌Tyr释放量的影响
在体rHu-TNFα注射后6、12、24 h比目鱼肌Tyr释放量与对照组比较，增高非常显著( P< 0.01)，24 h虽有所下降，但仍显著地高于对照组(P < 0.05)。在测定时段随时间的推移变化趋于减小，见表3。
表3 在体rHu-TNFα处理组比目鱼肌Tyr释放量
Tab 3 The effects of Tyrosine release of soleus after
, http://www.100md.com
TNFα injection group (h)
Control
6
12
24
Tyr release(nmol.g-1.2 h-1)
211±4.9
393±46.0* *
312±37.7* *
258±10.7*
, http://www.100md.com
Percentage(%)
100
186
148
122
*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.4 严重体表烫伤后比目鱼肌泛素蛋白含量变化
烫伤后3PBD、7PBD比目鱼肌泛素蛋白含量比对照组有显著增加(P< 0. 01和P< 0.05),而在3PBD与对照组无显著差异，见表4。
表4 烫伤组比目鱼肌泛素蛋白含量
Tab 4 Contents of Ubiquitin of soleus in scalded group
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Scalded group (d)
Control
3
5
7
Ubiquitin comtent (μg/g)
36.4±3.6
62.8±6.0* *
40.4±5.0
46.4±7.0*
Percentage (%)
, http://www.100md.com
100
173
111
127
*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.5 rHu-TNFα对在体比目鱼肌泛素mRNA和泛素蛋白水平的影响
注射rHu-TNFα后的6、12 h比目鱼肌泛素mRNA水平比正常对照组显著增高(P < 0. 01)，24 h后虽含量有所降低，但仍显著高于对照(P< 0.05)。3个时相泛 素蛋白含量比对照组增高皆非常显著(P< 0.01)，见表5。
表5 在体rHu-TNFα处理组比目鱼肌泛素mRNA
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表达与泛素蛋白含量的变化
Tab 5 Changes of ubiquitin contents and of ubiquitin mRNA ex pression after rHu-TNFα injection in vivo
The unit of ubiquitin mRNA: Arbitrary unit.control mean-1 ；*：P< 0.05,* *：P< 0.01 vs control
rHu-TNFα injection(h)
Control
6
12
, http://www.100md.com
24
Ubiquitin mRNA
100±20
342±83* *
278±47* *
170±47*
Ubiquitin (μg/g)
39.6±2.5
155.4±10.5* *
124.4±19.3* *
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73.7±13.8* *
Ubiquitin(%)
100
392
314
186
The unit of ubiquitin mRNA: Arbitrary unit*control mean-1；*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.6 烫伤和rHu-TNFα对在体比目鱼肌泛素蛋白含量的影响
在体rHu-TNFα处理后，正常大鼠，烫伤大鼠未伤肢、伤肢比目鱼肌泛素蛋白含量显著 增加(P< 0.05)；烫伤组未伤肢、伤肢皆显著高于未烫伤组(P< 0.05)；烫伤组中伤肢 泛素含量显著高于未伤肢(P< 0.05)；rHu-TNFα、烫伤对比目鱼肌泛素 含量的单独和交互效应非常显著(P< 0.01)，见表6。
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表6 在体烫伤和rHu-TNFα处理组比目鱼肌
泛素蛋白含量(ωB/μg.g-1)
Tab 6 Contents of Ubiquitin of soleus after scalding and
in rHu-TNFα treated group in vivo(ωB/μg.g-1)
Scalded group
Unscalded group
Unscalded leg
, 百拇医药 Scalded leg
No TNFα
36.9±2.5
65.5±4.9*
86.2±7.9* △
TNFα injection
73.7±13.8★
81.5±5.3★ *
132.4±13.9★ * △
★：P<0.05 vs no TNFα；*：P<0.05 vs unscalded group；
, http://www.100md.com
△：P<0.05 vs unscalded leg
3 讨论
3.1 严重烫伤诱导TNFα的产生
李林等[5]观察到烫伤大鼠血清，未伤肢。伤肢骨骼肌TNFα水平持续升高，伤 肢显著高于未伤肢和血清。本文烫伤后的3PBD、5PBD、7PBD血清TNFα水平显著高于正常对 照。结果与Liu等[6]的相似。TNFα由多种介质刺激下的网状内皮细胞系统产生。 创伤早期TNFα的产生是机体对组织损伤产生的应激反应，本试验观测3个时相点血清TNFα 水 平升高可能为晚期刺激因素LPS、TSST-1、补体等的刺激所致。7PBD时血清TNFα高于3PBD 可能与烫伤后感染的发生有关，感染与局部产生的LPS刺激局部巨噬细胞等释放TNFα，从而 引起血中TNFα的升高。
3.2 rHu-TNFα对烫伤大鼠骨骼肌蛋白质分解代谢速率的影响
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正常大鼠经rHu-TNFα处理后6、12、24 h比未处理组，烫伤大鼠的伤肢、未伤肢经rH u-TNFα处理后比未处理组Tyr释放量皆有显著增加，提示TNFα能对在体正常和烫伤大鼠的 伤肢、未伤肢的骨骼肌蛋白质降解皆有促进作用，即TNFα具有全身效应，能通过血路促进 骨骼肌蛋白质降解。Goodman[7]也发现TNFα能增强骨骼肌蛋白质降解。
烫伤后血清TNFα水平显著升高，但未能引起未伤肢Tyr释放量显著增加。Sternes等 [8]研究认为低剂量TNFα不能促进骨骼肌蛋白质降解。推测血清TNFα主要来自烫伤 局部，随血流运输达未伤肢，其浓度会有所下降。TNFα在哺乳动物血流中的半寿期仅为6～ 20 min。循环因子TNFα-BP能在急性期下向调节TNFα生物活性，但其免疫活性并未减弱。 李林等[5]发现烫伤大鼠伤肢比目鱼肌中TNFα含量显著高于未伤肢。提示烫伤局部 产生TNFα的增多成为血中TNFα水平升高的主要原因，同时引起烫伤局部骨骼肌蛋白质分解 代谢增强。
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3.3 烫伤后比目鱼肌泛素水平
泛素是一种热休克蛋白，在3PBD、5PBD、7PBD骨骼肌中泛素含量皆有增加，伤肢泛素的 增加与蛋白质降解显著相关。谭银玲等[2]曾发现大鼠于1PBD、2PBD、3PBD伤 、未 伤肢泛素皆显著增加，伤肢变化更显著，且烫伤局部蛋白质分解的主要原因是依赖泛素系统 26S蛋白酶体活性的增强。Lowell等[9]发现溶酶体与骨骼肌中肌原纤维蛋白质降解 无关。大鼠饥饿去 神经导致的肌萎缩中泛素表达增加，26S蛋白酶复合体的某些亚基的mRNA增加，同时骨骼肌 蛋白质分解代谢增强[10]。故本研究认为泛素表达水平的提高有利于待分解蛋白质 的泛素化，从而引起烫伤局部比目鱼肌蛋白质分解增强。未伤肢中二者不相关，机制尚需进 一步研究。
3.4 TNFα对泛素mRNA、泛素蛋白水平的影响
rHu-TNFα处理后大鼠骨骼肌泛素mRNA、泛素水平皆显著提高，这与Martinez等[ 11]的报道相似，且与Tyr释放量的增加显著相关。提示在体TNFα急性处理可激活泛 素依赖的系统从而促进骨骼肌蛋白质降解。TNFα对该系统的激活是否需要糖皮质激素的参 与还有待探讨。
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TNFα对正常大鼠、烫伤大鼠骨骼肌泛素表达皆有显著促进作用，同时Tyr释放显著提高 。烫伤能刺激受损局部TNFα的产生，从而引起局部泛素依赖的蛋白质降解途径活性增强。
烫伤与rHu-TNFα对比目鱼肌泛素表达的交互效应显著，提示烫伤使受损局部对TNFα 的作用变得敏感，再遇外源TNFα刺激时，可能局部释放更多TNFα等介质，从而使局部骨骼 肌泛素表达水平提高。
基金项目：全军“九五”指令性攻关项目(96L043)
作者简介：唐新国(1966-)，男，硕士，讲师，现在南京军 医学院生化教研室工作，南京 210099。
参考文献：
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[4] 丁.萨姆布鲁克，EF.费里奇，T.曼尼阿蒂斯 著.金冬雁 译.分子 克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1996.16-395.
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[8] Sternes H F, Warren R S, Conti P S, et al. Redistribution of a mino acids in rat liver and muscle induced by tumor necrosis factor requires the adrenal response[J], Surg Forum,1987,18:41-42.
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, 百拇医药
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收稿日期：1999-09-30；修回日期：1999-12-22, http://www.100md.com