立体定向适形放疗对肝细胞癌端粒酶活性的抑制作用
作者：方学军 李朝龙 胡庆柳 王江云 李晓平
单位：方学军(第一军医大学 南方医院肝胆血管外科，广东 广州 510515)；李朝龙(第一军医大学 南方医院肝胆血管外科，广东 广州 510515)；胡庆柳(第一军医大学 防原教研室，广东 广州 510515)；王江云(第一军医大学 南方医院放射科，广东 广州 510515)；李晓平(第一军医大学 南方医院肝胆血管外科，广东 广州 510515)
关键词：肝肿瘤；立体定向适形放疗；端粒酶；凋亡
第一军医大学学报000421 摘要：目的 探讨立体定向适形放疗对原发性肝癌的生物学效应。方法 对16例原发性肝癌病人中6例术前先行立体定向适形放射治疗，1月后再行手术切除，与同期仅行手术切除的另外10例病人进行对比分析，对手术标本进行细胞端粒酶活性检测及DNA电泳分析。结果 立体定向适形放射治疗对原发性肝癌组织有确实的杀伤效应，肿瘤细胞内已无端粒酶活性，DNA电泳显示肿瘤细胞的DNA链呈片状断裂的阶梯状图象。而未行立体定向放疗的10例病人肝癌组织中的端粒酶活性全部阳性，DNA电泳显示其连续完整。结论 立体定向适形放疗对原发性肝癌有强烈的杀伤效应，其机制为射线对肿瘤细胞的DNA造成损伤，并与其对端粒酶活性的抑制有关。
, 百拇医药
中图分类号：R735.7; R815.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0310-03
Inhibition of stereotactic ally-guided conformal radiotherapy on the telomerase activity in hepatocellular carcinoma
FANG Xue-jun,LI Chao-long，LI Xiao-ping
(Department of Hepatobiliary-vascullar Surgery First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
, 百拇医药
WANG Jiang-yun
(Rontgenology, Nanfang Hospital First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
HU Qing-liu
(Department of Protective Medicine against Nuclear Weapon, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To study the biological effect of the stereotactic ally-guided conformal radiotherapy (SCRT) on hepatocellular carcinoma. Methods Sixteen patients with hepatocellular carcinoma underwent surgical resection, and 6 of them received SCRT before the resection and the others were operated on directly. The telomerase activity assay and the DNA electrophoresis of the tumor cells were performed in the 2 groups. Results The tumor cells were killed by SCRT and the telomerse activity tests were negative in the treated tumor cells, however, the untreated tumor cells were positive. The DNA electrophoresis showed that the DNA of the treated tumor cells was displayed in ladder shape while that of the untreated tumor cells was DNA displayed in comet-tail shape. Conclusion SCRT can induce apoptosis of the hepatocellular carcinoma by inhibiting the activities of telomerase.
, http://www.100md.com
Key words：liver neoplasms; stereotactic conformal radiotherapy; telomerase; apoptosis
立体定向适形放疗(Stereotactic ally-guided conformal radiotherapy, SCRT)是近几年兴起的肿瘤治疗方法，尤其是对原发性肝癌的治疗，可根据肝肿瘤形状设计照射范围，具有损伤小、治疗效果好、放射性肝炎发生率低的优点。但其对肝癌组织的生物学效应如何目前还不清楚，本文对我科1998年6月～1998年12月间收治的16例原发性肝癌病人中6例经SCRT的手术标本，进行端粒酶活性测定以及DAN电泳分析，以揭示其治疗效果与组织生物学效应之间可能存在的联系。
1 病人与方法
1.1 病人
原发性肝癌病人16例，全部男性，年龄30～47岁，平均39岁。其中6例术前用德国Varian 600C/D直线加速器行SCRT一疗程。根据肿瘤大小，放疗总剂量为36 Gy/6次、42 Gy/7次、48 Gy/8次、54 Gy/9次，每次6 Gy，隔日1次照射。根据肝功能情况及正常肝组织的受照体积估算肝脏放射耐受剂量，以尽量给予肿瘤最大剂量为原则，1月后再行手术切除。手术发现放疗后肿瘤组织均有广泛的坏死，部分区域有出血坏死灶存在，病灶外围肝组织有血肿及网膜粘连包裹。其余10例不行SCRT，直接手术切除。2组手术切除的肿瘤标本送检。
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1.2 生物学测定
1.2.1 端粒酶活性检测 采用端粒重复序列扩增法(Telomeric repeat amplification protocol,TRAP)测定，参照Kim[1]方法并加以改进。TS引物：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3', CX引物：5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′⑴组织抽提：取2～10 mg待检组织，加入200 μl的预冷裂解液，匀浆器匀浆，冰浴30 min后10 000 r/min离心15 min，取上清100 μl，用1～3 μl(相当于1～50 μg蛋白)进行端粒酶延伸/PCR扩增。⑵扩增条件：92℃预变性5 min，变性92 ℃ 45 s, 退火50 ℃ 45 s，延伸70 ℃ 90 s，共30循环，最后70 ℃延伸5 min。⑶5 μl扩增产物加20 μl变性液变性10 min，加225 μl杂交缓冲液，混匀后取100 μl加入avidin包被的微孔板中37 ℃ 2 h。⑷ 甩去杂交液，洗涤液洗板3次，加抗DIG的酶标记物100μl /孔，37 ℃ 30 min后甩去酶标记物，洗板5次。⑸ 加TMB底物100μl /孔，蔽光显色20 min后测D(? )450值。⑹ 标本D(? )450≥0.2判为阳性，否则判为阴性。
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1.2.2 组织DNA抽提及电泳 ⑴ 取0.1～0.5 g组织与3 ml TE(pH7.5)匀浆，转入Ep管中加入SDS至终浓度0.5%，加EDTA至终浓度0.1 mol/L和适量RNase，37℃水浴30 min。⑵ 加入蛋白酶K至终浓度100 μg/ml，50℃水浴过夜。⑶ 用等体积的平衡酚抽提，离心取上层水相。⑷ 加三倍体积无水乙醇，离心取沉淀。⑸ 用75%乙醇洗数次，离心取沉淀。⑹ 50 μl无菌水溶解沉淀。⑺ 1.5%琼脂糖胶电泳。结果判断：呈慧尾的弥散性片状为坏死组织DNA，规则梯状条带为程序性死亡组织DNA，单一亮带为正常组织DNA。
2 结果
2.1 肿瘤、瘤旁组织端粒酶活性
16例原发性肝癌标本端粒酶的活性检测发现，6例SCRT后的肝癌组织端粒酶活性均为阴性，其瘤旁组织内有1例呈弱阳性反应，其余5例阴性。未行放疗的10例病人肝癌组织端粒酶活性为阳性，瘤旁组织有2例为弱阳性，其余8例均呈阴性。
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2.2 组织DNA电泳
SCRT后的肝癌组织DNA为规则梯状条带，说明肝癌组织出现了癌细胞程序性死亡； 而完全液化坏死的组织DNA 为慧尾状， 提示肝癌组织有程序性死亡与坏死并存的现象；未经放疗的肝癌组织为单一亮带，说明为正常组织DNA(图1)。
图1 立体定向适形放疗后肝癌组织DNA电泳图
Fig.1 DNA electrophoretogram of the hepatocellular carcinoma tissue after SCRT
3 讨论
, http://www.100md.com SCRT除能有效杀灭肝癌细胞、缩小肿瘤体积，为手术创造有利条件外，还能诱发肝癌细胞的程序性死亡。射线适形集中瘤体照射，能造成肿瘤细胞DNA断裂，引起细胞死亡。但如何引起肝癌细胞的程序性死亡，机制还不清楚。我们发现SCRT后，肝癌细胞的端粒酶活性明显降低，说明射线能抑制肝癌细胞的端粒酶活性，但是否与细胞程序性死亡有关还需进一步探讨。90年代通过对端粒酶与肿瘤细胞生长关系的研究发现了包括肝细胞癌在内的大多数恶性肿瘤细胞的端粒长度及端粒酶活性异常[1]，主要表现为端粒缩短及高端粒酶活性表达，而正常体细胞内不存在端粒酶活性或活性很低。因而提出了端粒假说：端粒的长度限制着细胞分裂的次数，而端粒酶的激活可维持端粒长度的相对稳定，使细胞得以永生化[2]。现已清楚，端粒是染色体末端的帽状结构，其实质是不含基因的DNA。在人类，其序列为5＇-TTAGGG-3＇的重复，长度为15 kb，随着细胞的每次分裂，DNA复制的末端难题会致端粒缩短50～200 bp，当其缩短到一定长度时，细胞就会进入危象期，分裂停止，衰老死亡。肝癌细胞由于p53和Rb等抑癌基因失活，细胞能越过危象期不断分裂，形成永生细胞系。肝癌细胞的连续分裂，导致端粒的异常缩短，最终会危及染色体的稳定性。在这种压力下，肝癌细胞端粒酶激活，不断地向染色体的3＇端添加TTAGGG重复片段，使端粒的长度维持在稳定的较短水平，以致肝癌细胞得以持续恶性生长。我们的实验发现肝癌病人经SCRT后，肝癌细胞的端粒酶活性明显降低，说明放疗射线能通过某种机制使端粒酶活性受抑，可能是肝癌细胞发生程序性死亡的一种机制[3]，但其作用部位是端粒酶RNA成分还是其蛋白成分，或二者兼而有之还不清楚，其详细的机制还有待进一步深入研究。
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作者简介：方学军(1962-)，男，湖北当阳人，1995年毕业于第三军医大学，硕士，电话：85147148
参考文献：
[1] Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of telomeras activity with immortal cells and cancer[J]. Science, 1994, 266:2011.
[2] Kojima H, Yokosuka O, Imazeki F, et al. Telomerase activity and telomere length in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease[J]. Gastroenterology, 1997, 112(2):493-500.
[3] Autexier C, Greider CW. Telomerase and cancer: revisiting the telomere hypothesis[J]. Trends Biochem Sci, 1996, 21(10):387-91.
收稿日期：1999-09-21, 百拇医药
单位：方学军(第一军医大学 南方医院肝胆血管外科，广东 广州 510515)；李朝龙(第一军医大学 南方医院肝胆血管外科，广东 广州 510515)；胡庆柳(第一军医大学 防原教研室，广东 广州 510515)；王江云(第一军医大学 南方医院放射科，广东 广州 510515)；李晓平(第一军医大学 南方医院肝胆血管外科，广东 广州 510515)
关键词：肝肿瘤；立体定向适形放疗；端粒酶；凋亡
第一军医大学学报000421 摘要：目的 探讨立体定向适形放疗对原发性肝癌的生物学效应。方法 对16例原发性肝癌病人中6例术前先行立体定向适形放射治疗，1月后再行手术切除，与同期仅行手术切除的另外10例病人进行对比分析，对手术标本进行细胞端粒酶活性检测及DNA电泳分析。结果 立体定向适形放射治疗对原发性肝癌组织有确实的杀伤效应，肿瘤细胞内已无端粒酶活性，DNA电泳显示肿瘤细胞的DNA链呈片状断裂的阶梯状图象。而未行立体定向放疗的10例病人肝癌组织中的端粒酶活性全部阳性，DNA电泳显示其连续完整。结论 立体定向适形放疗对原发性肝癌有强烈的杀伤效应，其机制为射线对肿瘤细胞的DNA造成损伤，并与其对端粒酶活性的抑制有关。
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中图分类号：R735.7; R815.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0310-03
Inhibition of stereotactic ally-guided conformal radiotherapy on the telomerase activity in hepatocellular carcinoma
FANG Xue-jun,LI Chao-long，LI Xiao-ping
(Department of Hepatobiliary-vascullar Surgery First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
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WANG Jiang-yun
(Rontgenology, Nanfang Hospital First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
HU Qing-liu
(Department of Protective Medicine against Nuclear Weapon, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To study the biological effect of the stereotactic ally-guided conformal radiotherapy (SCRT) on hepatocellular carcinoma. Methods Sixteen patients with hepatocellular carcinoma underwent surgical resection, and 6 of them received SCRT before the resection and the others were operated on directly. The telomerase activity assay and the DNA electrophoresis of the tumor cells were performed in the 2 groups. Results The tumor cells were killed by SCRT and the telomerse activity tests were negative in the treated tumor cells, however, the untreated tumor cells were positive. The DNA electrophoresis showed that the DNA of the treated tumor cells was displayed in ladder shape while that of the untreated tumor cells was DNA displayed in comet-tail shape. Conclusion SCRT can induce apoptosis of the hepatocellular carcinoma by inhibiting the activities of telomerase.
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Key words：liver neoplasms; stereotactic conformal radiotherapy; telomerase; apoptosis
立体定向适形放疗(Stereotactic ally-guided conformal radiotherapy, SCRT)是近几年兴起的肿瘤治疗方法，尤其是对原发性肝癌的治疗，可根据肝肿瘤形状设计照射范围，具有损伤小、治疗效果好、放射性肝炎发生率低的优点。但其对肝癌组织的生物学效应如何目前还不清楚，本文对我科1998年6月～1998年12月间收治的16例原发性肝癌病人中6例经SCRT的手术标本，进行端粒酶活性测定以及DAN电泳分析，以揭示其治疗效果与组织生物学效应之间可能存在的联系。
1 病人与方法
1.1 病人
原发性肝癌病人16例，全部男性，年龄30～47岁，平均39岁。其中6例术前用德国Varian 600C/D直线加速器行SCRT一疗程。根据肿瘤大小，放疗总剂量为36 Gy/6次、42 Gy/7次、48 Gy/8次、54 Gy/9次，每次6 Gy，隔日1次照射。根据肝功能情况及正常肝组织的受照体积估算肝脏放射耐受剂量，以尽量给予肿瘤最大剂量为原则，1月后再行手术切除。手术发现放疗后肿瘤组织均有广泛的坏死，部分区域有出血坏死灶存在，病灶外围肝组织有血肿及网膜粘连包裹。其余10例不行SCRT，直接手术切除。2组手术切除的肿瘤标本送检。
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1.2 生物学测定
1.2.1 端粒酶活性检测 采用端粒重复序列扩增法(Telomeric repeat amplification protocol,TRAP)测定，参照Kim[1]方法并加以改进。TS引物：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3', CX引物：5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′⑴组织抽提：取2～10 mg待检组织，加入200 μl的预冷裂解液，匀浆器匀浆，冰浴30 min后10 000 r/min离心15 min，取上清100 μl，用1～3 μl(相当于1～50 μg蛋白)进行端粒酶延伸/PCR扩增。⑵扩增条件：92℃预变性5 min，变性92 ℃ 45 s, 退火50 ℃ 45 s，延伸70 ℃ 90 s，共30循环，最后70 ℃延伸5 min。⑶5 μl扩增产物加20 μl变性液变性10 min，加225 μl杂交缓冲液，混匀后取100 μl加入avidin包被的微孔板中37 ℃ 2 h。⑷ 甩去杂交液，洗涤液洗板3次，加抗DIG的酶标记物100μl /孔，37 ℃ 30 min后甩去酶标记物，洗板5次。⑸ 加TMB底物100μl /孔，蔽光显色20 min后测D(? )450值。⑹ 标本D(? )450≥0.2判为阳性，否则判为阴性。
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1.2.2 组织DNA抽提及电泳 ⑴ 取0.1～0.5 g组织与3 ml TE(pH7.5)匀浆，转入Ep管中加入SDS至终浓度0.5%，加EDTA至终浓度0.1 mol/L和适量RNase，37℃水浴30 min。⑵ 加入蛋白酶K至终浓度100 μg/ml，50℃水浴过夜。⑶ 用等体积的平衡酚抽提，离心取上层水相。⑷ 加三倍体积无水乙醇，离心取沉淀。⑸ 用75%乙醇洗数次，离心取沉淀。⑹ 50 μl无菌水溶解沉淀。⑺ 1.5%琼脂糖胶电泳。结果判断：呈慧尾的弥散性片状为坏死组织DNA，规则梯状条带为程序性死亡组织DNA，单一亮带为正常组织DNA。
2 结果
2.1 肿瘤、瘤旁组织端粒酶活性
16例原发性肝癌标本端粒酶的活性检测发现，6例SCRT后的肝癌组织端粒酶活性均为阴性，其瘤旁组织内有1例呈弱阳性反应，其余5例阴性。未行放疗的10例病人肝癌组织端粒酶活性为阳性，瘤旁组织有2例为弱阳性，其余8例均呈阴性。
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2.2 组织DNA电泳
SCRT后的肝癌组织DNA为规则梯状条带，说明肝癌组织出现了癌细胞程序性死亡； 而完全液化坏死的组织DNA 为慧尾状， 提示肝癌组织有程序性死亡与坏死并存的现象；未经放疗的肝癌组织为单一亮带，说明为正常组织DNA(图1)。
图1 立体定向适形放疗后肝癌组织DNA电泳图
Fig.1 DNA electrophoretogram of the hepatocellular carcinoma tissue after SCRT
3 讨论
, http://www.100md.com SCRT除能有效杀灭肝癌细胞、缩小肿瘤体积，为手术创造有利条件外，还能诱发肝癌细胞的程序性死亡。射线适形集中瘤体照射，能造成肿瘤细胞DNA断裂，引起细胞死亡。但如何引起肝癌细胞的程序性死亡，机制还不清楚。我们发现SCRT后，肝癌细胞的端粒酶活性明显降低，说明射线能抑制肝癌细胞的端粒酶活性，但是否与细胞程序性死亡有关还需进一步探讨。90年代通过对端粒酶与肿瘤细胞生长关系的研究发现了包括肝细胞癌在内的大多数恶性肿瘤细胞的端粒长度及端粒酶活性异常[1]，主要表现为端粒缩短及高端粒酶活性表达，而正常体细胞内不存在端粒酶活性或活性很低。因而提出了端粒假说：端粒的长度限制着细胞分裂的次数，而端粒酶的激活可维持端粒长度的相对稳定，使细胞得以永生化[2]。现已清楚，端粒是染色体末端的帽状结构，其实质是不含基因的DNA。在人类，其序列为5＇-TTAGGG-3＇的重复，长度为15 kb，随着细胞的每次分裂，DNA复制的末端难题会致端粒缩短50～200 bp，当其缩短到一定长度时，细胞就会进入危象期，分裂停止，衰老死亡。肝癌细胞由于p53和Rb等抑癌基因失活，细胞能越过危象期不断分裂，形成永生细胞系。肝癌细胞的连续分裂，导致端粒的异常缩短，最终会危及染色体的稳定性。在这种压力下，肝癌细胞端粒酶激活，不断地向染色体的3＇端添加TTAGGG重复片段，使端粒的长度维持在稳定的较短水平，以致肝癌细胞得以持续恶性生长。我们的实验发现肝癌病人经SCRT后，肝癌细胞的端粒酶活性明显降低，说明放疗射线能通过某种机制使端粒酶活性受抑，可能是肝癌细胞发生程序性死亡的一种机制[3]，但其作用部位是端粒酶RNA成分还是其蛋白成分，或二者兼而有之还不清楚，其详细的机制还有待进一步深入研究。
, http://www.100md.com
作者简介：方学军(1962-)，男，湖北当阳人，1995年毕业于第三军医大学，硕士，电话：85147148
参考文献：
[1] Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of telomeras activity with immortal cells and cancer[J]. Science, 1994, 266:2011.
[2] Kojima H, Yokosuka O, Imazeki F, et al. Telomerase activity and telomere length in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease[J]. Gastroenterology, 1997, 112(2):493-500.
[3] Autexier C, Greider CW. Telomerase and cancer: revisiting the telomere hypothesis[J]. Trends Biochem Sci, 1996, 21(10):387-91.
收稿日期：1999-09-21, 百拇医药