甲氨蝶呤人血白蛋白微球制备工艺的优化
作者：刘会波 鲍辛南 李焕秋
单位：刘会波(深圳南方制药厂，深圳市518029)；鲍辛南(中山医科大学肿瘤医院，广州市510060)；李焕秋(沈阳药科大学，沈阳市110015)
关键词：计算机优化；微球；均匀设计；多元线性回归
中国药房000406
摘要：目的：采用计算机优化技术优化甲氨蝶呤人血白蛋白微球的制备工艺。方法：以均匀设计方法考察不同因素在3个水平下对微球平均粒径的影响。实验结果以多元线性回归法处理。结果：白蛋白浓度和乳化搅拌速度对微球大小影响显著。乳化时间和乳化剂用量对微球大小没有显著影响。结论：计算机优化技术可以有效优化微球制备工艺，值得推广应用到其它剂型。
中图分类号：R943 文献标识码：B 文章编号：1001-0408(2000)04-0155-02
, http://www.100md.com
Optimization of Preparation Technique of Methotrexate Human Serum Albumin Microspheres
LIU Huibo
(Shenzhen Nanfang Pharmaceutical Factory,Shenzhen 518029)
BAO Xinna
(Cancer Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060)
LI Huangqiu
(Shenyang University of Pharmacy,Shenyang 110015)
, 百拇医药
ABSTRACT： OBJECTIVE： A computer optimization technique was applied to the design of preparation technique of methotreate human serum albumin microspheres.METHODS： The effects of different factors on mean diameter of microsphere was studied at three levels accoring to uniform design of experiment.Multivariable linear regression was used to determine the relationship between the factors applied with the effects responsed.RESULTS： Albumin concentration and stirring rate during emulsification had significant effect on mean diameter of microspheres and emulsification time and the amount of albumin had no significant effect.CONCLUSION： Computer optimization technique can optimize preparation technique of microspheres effectively.The method has potentiality to be use in other dosage forms.
, 百拇医药
KEY WORDS： computer optimization;microsphere;uniform design;multivariable linear regression
靶向给药系统如脂质体、微球、毫微囊等微粒载体在制备时，工艺中很多因素可影响其平均粒径、粒度分布、包封率等实验结果。定量地确定工艺中的因素与实验结果之间的关系，存在一定困难。近来，计算机技术已成功地用于药物制剂工艺的优化，使得工艺参数与制剂性质之间的关系得以准确定量，并能优化工艺参数[1，2]。本文采用均匀设计[3]方法设计甲氨喋呤(Methotrexate,MTX)人血白蛋白(HAS)微球的制备工艺，以多元线性回归法处理实验结果，从而优化了微球制备工艺。
1材料与仪器
甲氨蝶呤(上海第十二制药厂)；人血白蛋白(卫生部上海生物制品研究所)。Gs12-2电子恒速搅拌器(上海医械专机厂)；202-1型电热恒温干燥箱(余姚市恒温箱厂)；XSB-502型生物显微镜(吉林省红光器材厂)。
, 百拇医药
2MTXHAS微球的制备
按Longo等[4]的方法，并加以改进：25%HSA等渗磷酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH8.0)1ml滴加至30ml氯仿-甲苯(1∶1)中，有机相含0.2mlSpan80,混合液于100ml圆底烧瓶中，快速搅拌乳化。然后滴加戊二醛饱和的氯仿溶液2ml，缓慢搅拌下交联4h(交联剂：25%戊二醛2ml与氯仿2ml振荡混合，待相分离后取氯仿层用于交联)。加入10%乙胺醇溶液0.5ml淬灭微球表面的活性醛基，搅拌30min。以丙酮、异丙醇清洗微球，收集微球，于120℃干热灭菌4h。
3工艺条件的优化
3.1拟水平均匀设计
影响微球平均粒径(Y)的主要因素有：白蛋白水溶液百分浓度X1(%)，乳化搅拌速度X2(rpm)，乳化时间X3(min)，乳化剂用量X4(ml)。选用U9(96)表，进行拟水平试验，见表1。
, http://www.100md.com
表1均匀设计
考察因素的各个水平分别是：
X1：20(1～3)，30(4～6)，40(7～9)
A1A2A3
X2：250(1～3)，350(4～5)，450(7～9)
B1B2B3
X3：2(1～3)，4(4～6)，6(7～9)
, http://www.100md.com
C1C2C3
X4：0.2(1～3)，0.4(4～6)，0.6(7～9)
D1D2D3
试验设计及结果见表2。
表2实验设计和结果
编号
X1(%)
X2(rpm)
X3(min)
X4(ml)
, 百拇医药
平均粒径(um)
1
20
250
4
0.6
8.58
2
20
350
6
0.4
4.43
, http://www.100md.com 3
20
350
2
0.2
5.66
4
30
450
6
.02
3.38
5
30
, http://www.100md.com
250
2
0.6
8.76
6
30
250
4
0.4
9.55
7
40
350
2
, 百拇医药
0.4
8.15
8
40
450
4
0.2
6.76
9
40
450
6
0.6
6.89
, 百拇医药
3.2数据统计处理方法
采用多元线性回归方法[5]，在计算机上作数据统计处理。
4结果
4.1微球的制备
本文制备微球的工艺与前人[4，6]相比较，具有以下特点：采用有机溶剂代替传统方法所用的植物油和矿物油，以少量乳化剂代替高分子材料聚甲基丙烯酸甲酯，无需高温交联，微球的清洗方便且完全，工艺简单、稳定。制备过程中，微球损失量少，收率达95%以上。搅拌浆为自制的半月形聚四氟乙烯，与体系中的各种试剂均不反应，搅拌效果好。
4.2工艺条件的优化
微球平均粒径(Y)用光学显微镜测定，每个样品测定粒子数为400个，计算微球的平均粒径，结果见表2。计算机处理实验数据，结果如下：
, 百拇医药
Y=9.5217X1—0.1613X2—0.1100X3+1.5667X4
方差分析见表3。
表3方差分析表
平方和
自由度
方差
F检验值
回归
30.9502
4
7.7375
, http://www.100md.com
残差
3.9650
5
0.9913
7.806
离差
34.9152
8
复相关系数R=0.9415，剩余标准差Sy=0.9956，回归方程与剩余方差之比F=7.8058。对于4个变量9个样品而言，F=6.39，F=7.81>6.39。说明回归方程是可信的。
将回归方程的可信性及各因素对平均粒径影响的显著性进行相关统计学分析，可得如下结果：(1)白蛋白水溶液百分浓度(X1)对粒子大小影响显著。此外，X1系数为正数，可见白蛋白水溶液浓度增加，粒子大小亦增加。文献[7，8]也获得了类似结果，白蛋白水溶液的这种作用可能与其具有较高的相对粘度有关[9]。(2)乳化搅拌速度(X2)对粒子大小影响显著。X2系数为负数，说明乳化搅拌速度越大，粒子越小。与Burger等[8]的结果基本一致。(3)乳化时间(X3)对粒子大小没有显著影响。X3系数为负数，说明乳化时间越长，微球粒子越小。Arai等[9]的实验结果与此一致。(4)乳化剂用量(X4)对粒子大小没有显著影响。X4系数为正数，说明乳化剂用量增加，粒子大小亦增加。这与Ishizaka[10]等的结果不一致，但他们采用植物油作为乳剂(w/o)外相，外相本身粘度较大，加入5%乳化剂时，对油相粘度产生的影响不大，乳化剂仅对乳剂乳滴大小有显著影响，故有乳化剂用量增加，微球粒子变小的现象。但本实验乳剂外相采用氯仿-甲苯溶液，粘度较小，加入乳化剂后，可能会导致外相粘度增大，乳剂中白蛋白液滴的界面张力变小，产生凝聚作用，结果粒子反而增大。(5)预报与参数优化：为验证回归方程的可靠性，选定两组参数制备微球，见表4。
, 百拇医药
表4选定两组参数制备微球
编号
X1
X2
X3
X4
微球平均粒径预报值
1
25
300
4
0.2
, 百拇医药
6.88μm
2
25
350
6
0.2
5.79μm
微球平均粒径的实测值是6.36μm和5.38μm，预报与实测值基本一致，说明回归方程可靠。
本研究制备的微球为静脉注射用，微球粒径要求尽量小。由回归方程可知，X1优化值以越小越好，但考虑到微球制备量不宜太小，最后选定X1值为25%；X2和X3值越大越好，分别选定450rpm和6min；X4值越小越好，选定0.2ml。按上述优化值制备微球，结果预报值=3.39μm，实测值=3.37μm，两者基本一致。
, 百拇医药
均匀设计优化制备工艺，优点在于用比较少的实验即能达到定量描述制备过程之目的，本研究采用的方法也可以推广到其它剂型的制备工艺优化。
参考文献：
[1]Abu-Izza KA.Preparation and evaluation of sustained release AZT-loded microspheres.2.Optimization of multiple response variable[J].J.Pharm Sci,1996,85:572.
[2]Takayama K.Formulation design oindomethacin gel ointment containing d-limonene using computeroptimization methodology[J].Int.J.Pharm,1990,61:225.
, 百拇医药
[3]王鹏.均匀设计及其在药学中的应用[J].沈阳药学院学报，1989，6：297.
[4]Longo WE.Preparation of hydropholic albumin microspheres using polymeric dispersing agents[J].J.Pharm.Sci,1982,12:1 323.
[5]罗积玉.微机用多元统计分析软件[M].成都：四川科学技术出版社，1986，9：36.
[6]王皓.制备工艺对卡铂白蛋白微球性质的影响[J].中国药学杂志，1998，3(3)：151.
[7]NakagawaY.Preparation of bovine serum nanospheres as drug targeting carriers[J].Drug Desing ＆ Delivery,1987,2:99.
, 百拇医药
[8]BurgerJ J.Albumin microspheres for intra-arterial tumor targeting.I.pharmaceutical aspects[J].Drug Design ＆ Delivery,1985,23:333.
[9]Arai.Preparation of polylactic acid polylipoic acid nanospheres as drug tageting carriers[J].Drug Desing ＆ Delivery,1987,2:109.
[10]IshizakaT.Preparation of egg albumin microcapsules ＆ microsphers[J].J.Pharm.Sci,1981,70:358.
(收稿日期：2000-01-31 修回日期：2000-05-02), 百拇医药
单位：刘会波(深圳南方制药厂，深圳市518029)；鲍辛南(中山医科大学肿瘤医院，广州市510060)；李焕秋(沈阳药科大学，沈阳市110015)
关键词：计算机优化；微球；均匀设计；多元线性回归
中国药房000406
摘要：目的：采用计算机优化技术优化甲氨蝶呤人血白蛋白微球的制备工艺。方法：以均匀设计方法考察不同因素在3个水平下对微球平均粒径的影响。实验结果以多元线性回归法处理。结果：白蛋白浓度和乳化搅拌速度对微球大小影响显著。乳化时间和乳化剂用量对微球大小没有显著影响。结论：计算机优化技术可以有效优化微球制备工艺，值得推广应用到其它剂型。
中图分类号：R943 文献标识码：B 文章编号：1001-0408(2000)04-0155-02
, http://www.100md.com
Optimization of Preparation Technique of Methotrexate Human Serum Albumin Microspheres
LIU Huibo
(Shenzhen Nanfang Pharmaceutical Factory,Shenzhen 518029)
BAO Xinna
(Cancer Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060)
LI Huangqiu
(Shenyang University of Pharmacy,Shenyang 110015)
, 百拇医药
ABSTRACT： OBJECTIVE： A computer optimization technique was applied to the design of preparation technique of methotreate human serum albumin microspheres.METHODS： The effects of different factors on mean diameter of microsphere was studied at three levels accoring to uniform design of experiment.Multivariable linear regression was used to determine the relationship between the factors applied with the effects responsed.RESULTS： Albumin concentration and stirring rate during emulsification had significant effect on mean diameter of microspheres and emulsification time and the amount of albumin had no significant effect.CONCLUSION： Computer optimization technique can optimize preparation technique of microspheres effectively.The method has potentiality to be use in other dosage forms.
, 百拇医药
KEY WORDS： computer optimization;microsphere;uniform design;multivariable linear regression
靶向给药系统如脂质体、微球、毫微囊等微粒载体在制备时，工艺中很多因素可影响其平均粒径、粒度分布、包封率等实验结果。定量地确定工艺中的因素与实验结果之间的关系，存在一定困难。近来，计算机技术已成功地用于药物制剂工艺的优化，使得工艺参数与制剂性质之间的关系得以准确定量，并能优化工艺参数[1，2]。本文采用均匀设计[3]方法设计甲氨喋呤(Methotrexate,MTX)人血白蛋白(HAS)微球的制备工艺，以多元线性回归法处理实验结果，从而优化了微球制备工艺。
1材料与仪器
甲氨蝶呤(上海第十二制药厂)；人血白蛋白(卫生部上海生物制品研究所)。Gs12-2电子恒速搅拌器(上海医械专机厂)；202-1型电热恒温干燥箱(余姚市恒温箱厂)；XSB-502型生物显微镜(吉林省红光器材厂)。
, 百拇医药
2MTXHAS微球的制备
按Longo等[4]的方法，并加以改进：25%HSA等渗磷酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH8.0)1ml滴加至30ml氯仿-甲苯(1∶1)中，有机相含0.2mlSpan80,混合液于100ml圆底烧瓶中，快速搅拌乳化。然后滴加戊二醛饱和的氯仿溶液2ml，缓慢搅拌下交联4h(交联剂：25%戊二醛2ml与氯仿2ml振荡混合，待相分离后取氯仿层用于交联)。加入10%乙胺醇溶液0.5ml淬灭微球表面的活性醛基，搅拌30min。以丙酮、异丙醇清洗微球，收集微球，于120℃干热灭菌4h。
3工艺条件的优化
3.1拟水平均匀设计
影响微球平均粒径(Y)的主要因素有：白蛋白水溶液百分浓度X1(%)，乳化搅拌速度X2(rpm)，乳化时间X3(min)，乳化剂用量X4(ml)。选用U9(96)表，进行拟水平试验，见表1。
, http://www.100md.com
表1均匀设计
考察因素的各个水平分别是：
X1：20(1～3)，30(4～6)，40(7～9)
A1A2A3
X2：250(1～3)，350(4～5)，450(7～9)
B1B2B3
X3：2(1～3)，4(4～6)，6(7～9)
, http://www.100md.com
C1C2C3
X4：0.2(1～3)，0.4(4～6)，0.6(7～9)
D1D2D3
试验设计及结果见表2。
表2实验设计和结果
编号
X1(%)
X2(rpm)
X3(min)
X4(ml)
, 百拇医药
平均粒径(um)
1
20
250
4
0.6
8.58
2
20
350
6
0.4
4.43
, http://www.100md.com 3
20
350
2
0.2
5.66
4
30
450
6
.02
3.38
5
30
, http://www.100md.com
250
2
0.6
8.76
6
30
250
4
0.4
9.55
7
40
350
2
, 百拇医药
0.4
8.15
8
40
450
4
0.2
6.76
9
40
450
6
0.6
6.89
, 百拇医药
3.2数据统计处理方法
采用多元线性回归方法[5]，在计算机上作数据统计处理。
4结果
4.1微球的制备
本文制备微球的工艺与前人[4，6]相比较，具有以下特点：采用有机溶剂代替传统方法所用的植物油和矿物油，以少量乳化剂代替高分子材料聚甲基丙烯酸甲酯，无需高温交联，微球的清洗方便且完全，工艺简单、稳定。制备过程中，微球损失量少，收率达95%以上。搅拌浆为自制的半月形聚四氟乙烯，与体系中的各种试剂均不反应，搅拌效果好。
4.2工艺条件的优化
微球平均粒径(Y)用光学显微镜测定，每个样品测定粒子数为400个，计算微球的平均粒径，结果见表2。计算机处理实验数据，结果如下：
, 百拇医药
Y=9.5217X1—0.1613X2—0.1100X3+1.5667X4
方差分析见表3。
表3方差分析表
平方和
自由度
方差
F检验值
回归
30.9502
4
7.7375
, http://www.100md.com
残差
3.9650
5
0.9913
7.806
离差
34.9152
8
复相关系数R=0.9415，剩余标准差Sy=0.9956，回归方程与剩余方差之比F=7.8058。对于4个变量9个样品而言，F=6.39，F=7.81>6.39。说明回归方程是可信的。
将回归方程的可信性及各因素对平均粒径影响的显著性进行相关统计学分析，可得如下结果：(1)白蛋白水溶液百分浓度(X1)对粒子大小影响显著。此外，X1系数为正数，可见白蛋白水溶液浓度增加，粒子大小亦增加。文献[7，8]也获得了类似结果，白蛋白水溶液的这种作用可能与其具有较高的相对粘度有关[9]。(2)乳化搅拌速度(X2)对粒子大小影响显著。X2系数为负数，说明乳化搅拌速度越大，粒子越小。与Burger等[8]的结果基本一致。(3)乳化时间(X3)对粒子大小没有显著影响。X3系数为负数，说明乳化时间越长，微球粒子越小。Arai等[9]的实验结果与此一致。(4)乳化剂用量(X4)对粒子大小没有显著影响。X4系数为正数，说明乳化剂用量增加，粒子大小亦增加。这与Ishizaka[10]等的结果不一致，但他们采用植物油作为乳剂(w/o)外相，外相本身粘度较大，加入5%乳化剂时，对油相粘度产生的影响不大，乳化剂仅对乳剂乳滴大小有显著影响，故有乳化剂用量增加，微球粒子变小的现象。但本实验乳剂外相采用氯仿-甲苯溶液，粘度较小，加入乳化剂后，可能会导致外相粘度增大，乳剂中白蛋白液滴的界面张力变小，产生凝聚作用，结果粒子反而增大。(5)预报与参数优化：为验证回归方程的可靠性，选定两组参数制备微球，见表4。
, 百拇医药
表4选定两组参数制备微球
编号
X1
X2
X3
X4
微球平均粒径预报值
1
25
300
4
0.2
, 百拇医药
6.88μm
2
25
350
6
0.2
5.79μm
微球平均粒径的实测值是6.36μm和5.38μm，预报与实测值基本一致，说明回归方程可靠。
本研究制备的微球为静脉注射用，微球粒径要求尽量小。由回归方程可知，X1优化值以越小越好，但考虑到微球制备量不宜太小，最后选定X1值为25%；X2和X3值越大越好，分别选定450rpm和6min；X4值越小越好，选定0.2ml。按上述优化值制备微球，结果预报值=3.39μm，实测值=3.37μm，两者基本一致。
, 百拇医药
均匀设计优化制备工艺，优点在于用比较少的实验即能达到定量描述制备过程之目的，本研究采用的方法也可以推广到其它剂型的制备工艺优化。
参考文献：
[1]Abu-Izza KA.Preparation and evaluation of sustained release AZT-loded microspheres.2.Optimization of multiple response variable[J].J.Pharm Sci,1996,85:572.
[2]Takayama K.Formulation design oindomethacin gel ointment containing d-limonene using computeroptimization methodology[J].Int.J.Pharm,1990,61:225.
, 百拇医药
[3]王鹏.均匀设计及其在药学中的应用[J].沈阳药学院学报，1989，6：297.
[4]Longo WE.Preparation of hydropholic albumin microspheres using polymeric dispersing agents[J].J.Pharm.Sci,1982,12:1 323.
[5]罗积玉.微机用多元统计分析软件[M].成都：四川科学技术出版社，1986，9：36.
[6]王皓.制备工艺对卡铂白蛋白微球性质的影响[J].中国药学杂志，1998，3(3)：151.
[7]NakagawaY.Preparation of bovine serum nanospheres as drug targeting carriers[J].Drug Desing ＆ Delivery,1987,2:99.
, 百拇医药
[8]BurgerJ J.Albumin microspheres for intra-arterial tumor targeting.I.pharmaceutical aspects[J].Drug Design ＆ Delivery,1985,23:333.
[9]Arai.Preparation of polylactic acid polylipoic acid nanospheres as drug tageting carriers[J].Drug Desing ＆ Delivery,1987,2:109.
[10]IshizakaT.Preparation of egg albumin microcapsules ＆ microsphers[J].J.Pharm.Sci,1981,70:358.
(收稿日期：2000-01-31 修回日期：2000-05-02), 百拇医药