钙增敏剂MCI-154对内毒素休克大鼠心肌钙敏感性的影响
作者：梅建民 胡德耀 陈惠孙 刘良明 肖南 卢儒权
单位：梅建民(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；胡德耀(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；陈惠孙(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘良明(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；肖南(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；卢儒权(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)
关键词：内毒素休克；裸露乳头肌；钙增敏剂；MCI-154；大鼠
第三军医大学学报000410 提 要： 目的 研究钙增敏剂对内毒素休克大鼠心肌钙敏 感性的影响。方法 利用皂素溶液浸浴假休克或内毒素休克大鼠右心室 乳头肌，制备裸露心肌纤维标本，用不同pCa(-log[Ca2+])的含或不含强心药物的 激活液进行顺序激活，记录Ca2+激活张力。结果 同假休克组相 比，内毒素休克大鼠裸露乳头肌钙最大激活张力(Tmax)明显降低，张力-pCa曲线向 右移位，曲线中位值pCa50(产生50%Tmax所对应的pCa)降低。甲腈吡酮对上述 异常无明显的纠正作用。内毒素休克大鼠裸露乳头肌经含1×10-5 mol/L的MCI-154 的激活液处理后，Tmax明显增加，张力-pCa曲线向左移位，pCa50值增加，明 显高于内毒素休克组和Milrinone组值，接近假休克组值。MCI-154的上述作用还具有 剂量依赖性。结论 大鼠内毒素休克后，心肌收缩蛋白对钙的敏感 性降低，MCI-154可明显增加内毒素休克大鼠心肌收缩蛋白对钙的敏感性，增加心肌钙最大 激活张力。
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中图法分类号： R631.405.3 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0334-04
Effects of calcium sensitizer on myocardial calcium sensitivity during endotoxic shock in rats
MEI Jian-ming, HU De-yao, CHEN Hui-sun, LIU Liang-ming, XIAO Nan, L U Ru-quan
(Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Thi rd Military Medical University, Chongqing 400042,China)
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Abstract： Objective To study the effects of calcium sensit izer MCI-154 on myocardial sensitivity to calcium during endotoxic shock in rat s. Methods Papillary muscle of the right venticle of rats with s ham shock or endotoxic shock was incubated in saponin solution to prepare the sp ecimen of naked myocardial fibers. The tension of naked myocardial fibers was re corded after they were activated sequentially with different pCa(-log [Ca2+ ]) activating solutions with or without cardiotonic agents. Results The maximal activated tension (Tmax) of the naked fibers of papill ary muscle was significantly lower in the rats with endotoxic shock than in those wi th sham shock. The curve of Tmax-pCa relationship was shifted rightward. pCa50 of the curve (the value of pCa to produce 50% Tmax) was reduce d in the endotoxic group. Milrinone was unable to correct the above abnormalitie s. When the naked fibers of the papillary muscle of the rats with endotoxic shoc k were treated with the activating solution containing 10-5 mol/L NCI-154 , the Tmax was significantly increased and the Tmax-pCa relationshi p curve was shifted leftward. And the value of pCa50 was increased corresp ondingly approaching to that of the sham shock group. Such effect of MCI-154 wa s concentration-dependent. Conclusion The sensitivity o myocar dial contractile protein to calcium is decreased in the rats with endotoxic rats . MCI-154, a calcium sensitizer, is able to reverse the decreased sensitivity s ignificantly and increase the Tmax of the myocardium.
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Key words： endotoxic shock; naked fiber; papillary m uscle; calcium sensitizer; MCI-154;rat▲
研究显示，内毒素休克后，心肌细胞对钙敏感性降低是心肌收缩功能降低的原因之一 [1]。钙增敏剂可通过与心肌肌钙蛋白钙结合亚单位(TnC)Ca2+结合位点相互 作用，增加TnC对钙的亲和力，增强心肌收缩 力，改善心功能[2～4]。但有关钙增敏剂对内毒素休克心肌钙敏感性的作用效果如 何尚未见报道。我们先前的研究发现，钙增敏剂MCI-154用于内毒素休克家兔 的治疗时，能明显改善心功能，对内毒素休克所引起的循环紊乱有一定的纠正作用[5 ，6]。为进一步探讨钙增敏剂改善内毒素休克机体心功能的机制，本试验研究了M CI-154对内毒素休克心肌钙敏感性的影响。
1 材料与方法
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1.1 大鼠内毒素休克模型
Wistar大鼠，体重120～150 g，雌雄不拘，试验前随机分组，内毒素休克模型按本实验 室常用方法完成，即10 mg/kg大肠杆菌内毒素(Endotoxin,O111:B4， Sigma)腹腔内注射， 8 h后进行实验。假休克组腹腔内注射同10 mg/kg内毒素等容量的生理盐水。
1.2 大鼠裸露乳头肌的制备
参照黄焰等[7]的方法进行。断头活杀大鼠，迅速开胸取心脏置于连续通气(95 %O2和5%CO2)的25°C生理盐水溶液中，成份(mmol/L)：NaCl 130,KC l 4, CaCl2 2.5 ,Glucose 10, Tris 10，pH 7.0。剪开右心室，用小剪刀游离一束直径小于1 mm的乳头肌， 结扎腱端，游离后放入高精度离体乳头肌灌流槽，肌端固定于肌槽不锈钢拉钩上，腱端与高 精度等长张力换能器(Stathan UC2, Gould,USA)连接，肌肉收缩的张力信号经载波放大器(A P-600 G)输入四道记录仪(RM6200型，日本光电公司)进行描记记录。肌肉在25°C生理盐液 中平衡15 min后，先用25°C含皂素(Saponin)的蜕膜液(Skinned solution)作30 min浸浴处 理，再用25°C无钙松驰液(Relaxing solution)洗去蜕膜液，逐步调节肌肉长度至130%自然 长度，稳定10 min后，进行下一步实验。
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1.3 大鼠裸露乳头肌钙敏感性的测定
动物分为4组，每组8只，分别为：①假休克组(Ⅰ组)；②内毒素休克组(Ⅱ组)；③甲脯 吡酮组(Ⅲ组)，动物处理同②组，灌流裸露乳头肌的激活液(Activating solution)含5×1 0-5mol/L的甲腈吡酮；④MCI-154组(Ⅳ组)，动物处理同②组，灌流裸露乳头肌的激 活液中含1×10-5mol/L的MCI-154(本实验室结果：MCI-154增加正常大鼠乳头肌收 缩力的效价约为甲腈吡酮的5倍)。依次用pCa(-log[Ca2+])为7.0、6.5、6.0、5.5 、5.0、4.5、4.0 的含或不含强心药物的激活液(25°C)灌流裸露乳头肌，每一个pCa点 大约作用5 min后，再开始下一个pCa液。实验结束后，用滤纸吸干乳头肌表面液体并称重(mg)，测量乳 头肌长度(mm)，按肌肉比重1.0计算出乳头肌横截面积(CSA)，乳头肌产生的张力经CSA校正 后获得张力数据(mN/mm2)。以每条乳头肌在pCa 4.0时的张力为最大收缩力(Tmax)， 其它pCa点张力值除以Tmax算出pC点的相对张力(%)，然后以相对张力为纵轴，pCa为 横轴，按Hill方程：T=[Ca2+]n/(Kn+[Ca2+]n)，进行回归可得张力 -pCa曲线。方程中T为相对张力，即不同pCa的张力与Tmax的百分比，n为回 归斜 率，K为待求的Hill系数，为产生50%Tmax的Ca2+浓度，其负对数(-lo gK)即为pCa50。pCa50值是衡量TnC钙敏感性的定量指标[7]。
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1.4 不同浓度的MCI-154对内毒素休克大鼠裸露乳头肌钙敏感性的影响
动物分成3组，每组8只：①10-6mol/L MCI-154组(a组)；②：10-5mol/L MCI-154组(b组)，同1.3中的Ⅳ组；③10-4mol/L MCI-154组(c组)。①组每个pCa 点含10-6mol/L的MCI-154；②组每个pCa点含10-5mol/L的MCI-154；③组每 个pCa点含10-4mol/L的MCI-154。实验操作步骤及数据处理1.3。
1.5 液体配制
松驰液：成份(mmol/L) KCl 140,MgCl2 5,EGTA 10，咪唑25，Na2ATP 5，磷酸肌酸 (CP)10，磷酸肌酸激酶(CPK)0.1 mg/ml，pH 7.2；蜕膜液：在松驰液中加入500 μg/ml的皂 素；激活液：在松驰液中加入不同浓度的CaCl2，根据确定的pCa值计算出溶液中所需的Ca Cl2量，计算过程采用Fabiato“computer programs for calculating total”计算程序( 湖南医科大学心血管生理学研究室提供)完成。实验用溶液均用双蒸水当日配制，4°C冰箱 保存，其中Na2ATP、CP、CPK在临用前加入，溶液pH用1 mol/L KOH调至7.2，药品用1/10万 电子天秤称量。皂素、CP、CPK、CaCl2、EGTA、Na2ATP均为Sigma公 司产品，MCI-154由第二军医大学药学院提供，Milrinone购自重庆医学工业公司，其它试 剂均为分析纯。
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1.6 统计学处理
实验结果经统计学处理后以
±s表示，用t检验分析不同组间的差异性。
2 结果
2.1 MCI-154对内毒素休克大鼠裸露乳头肌钙反应性的影响
各组大鼠乳头肌重量、长度、CSA均无明显差别(P> 0.05)，各组 Tmax见表1。 Ⅱ和Ⅲ组Tmax均低于Ⅰ组(P< 0.05)，Ⅳ组Tmax明显高于Ⅱ 和Ⅲ组(P< 0. 05)，与Ⅰ组Tmax无明显差别(P >0.05)。各组张力-pCa曲线均呈S 形，见图1，Ⅱ 组pCa 6.5～4.5点上的相对张力明显低于Ⅰ组(P< 0.05,0.01)，曲线向右 移位；Ⅲ组p Ca 6.5～4.5点上的相对张力亦明显低于Ⅰ组(P< 0.05)，且与Ⅱ组无明显 差别(P >0 .05)，曲线亦向右移位；Ⅳ组pCa 6.5～4.5点上的相对张力上升的幅度明显增加，显著高于 Ⅱ和Ⅲ组值(P< 0.05,0.01)，接近假休克组。各组pCa50值见表1， Ⅱ、Ⅲ组pCa 50值明显低于Ⅰ组(P< 0.05)，Ⅳ组pCa50明显高于Ⅱ及Ⅲ组( P< 0.05)，与Ⅰ组无明显差别(P >0.05)。
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2.2 MCI-154的剂量依赖效应
3组Tmax分别为(mN/mm2)：a组：19.63±1.71；b组：21.30±1.77;c组：21.78 ±19.91。b和c组Tmax明显高于a组(P< 0.05)。各组张力-pCa 曲线呈S形，见 图2，b组pCa 6.5、6.0、5.5、5.0点上的相对张力高于a组(P< 0.05) ；c组pCa 6.5 ～4.5点上的相对张力明显高于a组(P< 0.05、P< 0.01) ，且pCa 6.5、6.0、5.5点 上的相对张力高于b组(P< 0.05)。3组的pCa50值分别为：a组：5.7 2±0.28;b组： 5.84±0.19;c组：6.15±0.22。c组pCa50值高于a及b组(P< 0.05) ，b组pCa50值亦高于a组(P< 0.05)。
表1 甲腈吡酮和MCI-154对内毒素休克大鼠
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裸露心肌Tmax、pCa50值的影响
Tab 1 Effects of milrinone and MCI-154 on maximal activated
tension(Tmax)，Ca2+ sensitivity (pCa50) of naked right
ventricular papillary muscles in endotoxic shock rats
Group
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
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Ⅳ
Tmax(mN/mm2)
22.12±1.62
18.47±1.70#
19.01±2.18#
21.30±1.77*
pCa50
5.82±0.18
5.47±0.16#
5.49±0.21#
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5.84±0.19 *
Ⅰ:Sham shock group;Ⅱ:Endotoxic shock group;
Ⅲ:Milrino ne group;Ⅳ:MCI-154 group;
#:P< 0.05 vs Ⅰ;*：P< 0.05 vs Ⅱ and Ⅲ
图1 MCI-154和Milrinone对内毒素休克大鼠 裸露乳头肌张力-pCa曲线的影响
Fig 1 Changes of relative tension(%) of naked papillary muscles from e ndotoxic shock rats following administration of milrinone or MCI-154
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#:P< 0.05,# #：P < 0.01 vs Ⅰ;
*:P< 0.05 vs Ⅱ and Ⅲ
图2 不同浓度的MCI-154对内毒素休克大鼠 裸露乳头肌张力-pCa曲线的影响
Fig 2 Effect of MCI-154 of different concentration on relative tension( %) of naked papillary muscles from endotoxic shock rats
a:1×10-6 mol/L MCI-154 group; b: 1×10-5 mol/L MCI-154 group; c:1 ×10-4 mol/L MCI-154 group; #：P< 0.05,# #： P< 0.01 vs a; *：P< 0.05 vs b
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3 讨论
利用皂素制备的心肌标本，心肌肌膜、肌浆网膜和线粒体膜上的胆固醇被溶解，膜上出 现小孔，Ca2+、ATP、EGTA等小分子可自由出入，而线粒体、肌浆网内的酶不能流出 [8]。这样就消除了灌流液与心肌细胞之间的离子屏障，细胞内也不具备调节钙离 子浓度的能力，灌流液中的钙浓度相当于完好肌纤维的细胞内浓度，灌流液中的钙能直接作 用于收缩蛋白成份，触发肌张力的变化。此方法既可确定钙敏感性指标pCa50，同时 又能进行肌肉收缩功能的研究[7]，因而，是目前研究强心药物钙增敏效果的常用 制备[8]。
本实验利用裸露乳头肌制备，研究了大鼠内毒素休克后心肌收缩蛋白钙敏感性的变化， 结果显示：内毒素休克后，大鼠裸露乳头肌钙最大激活张力降低，张力-pCa曲线向右 移位 ，曲线的pCa50值明显低于假休克组。这些结果表明内毒素休克后，心肌收缩蛋白对 钙的敏感性降低。这与很多利用离体心肌条和心肌细胞进行的实验结果一致。有关脓毒症 /感染性休克时心肌收缩蛋白对钙敏感性降低的机制目前尚不清楚，可能与 下列因素有关：①脓毒症/感染性休克时心肌缺血缺氧[9]，心肌能量供应和利用 障碍可能是原因之一。心肌缺血缺氧后，肌酸激酶活性降低，激活肌酸激酶的底物ADP受限 ，导致横桥(Cross bridge)周围无机磷的积聚，使横桥循环从强结全状态变为弱结合状态， 钙激活引起的心肌收缩力降低[3]。②可能与脓毒症/感染性休克时发生的机体内酸 中毒，特别是心肌细胞内酸中毒有关，心肌细胞内酸中毒后，H+与Ca2+ 竞争TnC上的钙结合位点，引起TnC对钙的亲和力降低[3]。③可能与钙超载有关 。脓毒症/感染性休克后，心肌细胞内发生钙超载[10]，心肌细胞钙超载后，心肌 收缩和舒张期钙波动的正常生理变化发生异常，心肌收缩蛋白激活呈现不一致性，外钙激 活引起的整体收缩力降低。可见，脓毒症/感染性休克时，很多因素可导致心肌收缩蛋白对 钙敏感性的降低，因此，提高心肌收缩蛋白对钙的敏感性，同时避免进一步加重心肌细胞 内钙超载，对增加心肌收缩力，改善脓毒症/感染性休克机体的心功能是很有意义的。但目 前临床上使用的强心药都不具备此功能[4]。本实验亦显示磷酸二酯酶抑制剂类强 心药甲腈吡酮作用于内毒素休克大鼠裸露乳头肌后，不能提高裸露乳头肌在pCa 7.0～4.5 点上的相对张力，不能纠正pCa-张力曲线向右移位，曲线的pCa50值明显低于假休克 组，与不加药物的内毒素休克组无明显区别。与甲腈吡酮相反，MCI-154却可使内毒素休克 大鼠裸露乳头肌Tmax及pCa 7.0～4.5浓度点上的相对张力增加，曲线向左移位， pCa 50值明显升高。MCI-154的上述作用还具有剂量依赖效应。上述结果表明：同作用于 正常心肌一样，MCI-154用于内毒素休克心肌后，亦能提高TnC对钙的亲和力，纠正心肌收 缩蛋白对钙敏感性的降低。这可能是MCI-154用于内毒素休克治疗后，增加心肌收缩力，改 善心功能的最主要机制。本研究提示，在治疗脓毒症/感染性休克时，钙增敏剂可能较目前 临床上应用的传统强心药更具优越性，更符合治疗逻辑。
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(致谢：感谢湖南医科大学心血管生理学研究室黄焰博士的大力支持!)
基金项目：全军“九五”攻关项目(96L041)
作者简介：梅建民(1966-)，男，湖北省麻城市人，博士， 主治医师，主要从事休克的病理生理及防治方面的研究，发表论文17篇，现在北京军区总医 院肝胆外科工作，北京 100700。电话：(010)66721629-8090
参考文献：
[1] Hung J, Lew W Y W. Cellular mechanisms of endotoxin-induce d myocardial depression in rabbits[J]. Circ Res,1993,73(1):125-134.
[2] Kitada Y, Kobayashi M, Narimatsu A, et al. Potent stimula tion of my ofilament force and adenosine triphosphatase activity of canine cardiac muscle t hrough a direct enhancement of troponin C Ca2+ binding by MCI-154, a nove l cardiotonic agent[J]. J Pharmacol Exp Ther,1989,250(1):272-277.
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[3] Kitada Y. MCI-154, a cardiac Ca2+ sensitizer, reverses the d epression in maximal Ca2+-activated force by inorganic phosphate and acid ic pH in skinned fibers of guinea pig heart[J]. Cardiovasc Drugs Ther,1997,11( 5):611-618.
[4] Mathew L, Kats S D. Calcium sensitising agents in heart failure[J ]. Drugs Aging,1998,12(3):191-204.
[5] 梅建民，胡德耀，陈惠孙，等.钙增敏剂MCI-154对内毒素休克家兔心功能的 影响[J].第三军医大学学报，1998，20(3)：194-196.
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[6] 梅建民，胡德耀，陈惠孙，等.钙增敏剂MCI-154对内毒素休克家兔治疗作用 的实验研究[J].第三军医大学学报，1998，20(6)：492-495.
[7] 黄 焰，贺振翻，李云霞.大鼠皂素蜕膜心肌肌钙蛋白Ca2+敏感性的实 验研究[J].中国应用生理杂志，1996，12(1)：1-5.
[8] Miller D J, Steele D S. The ‘calcium sensitising’ effects of ORG 3009 in saponin or Triton-skinned rat cardiac muscles[J]. Br J Pharmacol,1990 ,100:843-849.
[9] Groeneveld A B, van Lambalgen A A, van-den Bos G C, et al. Ma ldistribution of heterogeneous coronary blood flow during canine endotoxic shock [J]. Cardiovasc Res,1991,25(1):80-88.
[10] 董林旺，佟利家，张 力，等.败血症休克时心肌和心肌线粒体钙 转运的变化[J].生理学报，1993，45(2)：158-163.
收稿日期：1999-09-25；修回日期：2000-01-14, 百拇医药
单位：梅建民(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；胡德耀(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；陈惠孙(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘良明(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；肖南(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；卢儒权(第三军医大 学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)
关键词：内毒素休克；裸露乳头肌；钙增敏剂；MCI-154；大鼠
第三军医大学学报000410 提 要： 目的 研究钙增敏剂对内毒素休克大鼠心肌钙敏 感性的影响。方法 利用皂素溶液浸浴假休克或内毒素休克大鼠右心室 乳头肌，制备裸露心肌纤维标本，用不同pCa(-log[Ca2+])的含或不含强心药物的 激活液进行顺序激活，记录Ca2+激活张力。结果 同假休克组相 比，内毒素休克大鼠裸露乳头肌钙最大激活张力(Tmax)明显降低，张力-pCa曲线向 右移位，曲线中位值pCa50(产生50%Tmax所对应的pCa)降低。甲腈吡酮对上述 异常无明显的纠正作用。内毒素休克大鼠裸露乳头肌经含1×10-5 mol/L的MCI-154 的激活液处理后，Tmax明显增加，张力-pCa曲线向左移位，pCa50值增加，明 显高于内毒素休克组和Milrinone组值，接近假休克组值。MCI-154的上述作用还具有 剂量依赖性。结论 大鼠内毒素休克后，心肌收缩蛋白对钙的敏感 性降低，MCI-154可明显增加内毒素休克大鼠心肌收缩蛋白对钙的敏感性，增加心肌钙最大 激活张力。
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中图法分类号： R631.405.3 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0334-04
Effects of calcium sensitizer on myocardial calcium sensitivity during endotoxic shock in rats
MEI Jian-ming, HU De-yao, CHEN Hui-sun, LIU Liang-ming, XIAO Nan, L U Ru-quan
(Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Thi rd Military Medical University, Chongqing 400042,China)
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Abstract： Objective To study the effects of calcium sensit izer MCI-154 on myocardial sensitivity to calcium during endotoxic shock in rat s. Methods Papillary muscle of the right venticle of rats with s ham shock or endotoxic shock was incubated in saponin solution to prepare the sp ecimen of naked myocardial fibers. The tension of naked myocardial fibers was re corded after they were activated sequentially with different pCa(-log [Ca2+ ]) activating solutions with or without cardiotonic agents. Results The maximal activated tension (Tmax) of the naked fibers of papill ary muscle was significantly lower in the rats with endotoxic shock than in those wi th sham shock. The curve of Tmax-pCa relationship was shifted rightward. pCa50 of the curve (the value of pCa to produce 50% Tmax) was reduce d in the endotoxic group. Milrinone was unable to correct the above abnormalitie s. When the naked fibers of the papillary muscle of the rats with endotoxic shoc k were treated with the activating solution containing 10-5 mol/L NCI-154 , the Tmax was significantly increased and the Tmax-pCa relationshi p curve was shifted leftward. And the value of pCa50 was increased corresp ondingly approaching to that of the sham shock group. Such effect of MCI-154 wa s concentration-dependent. Conclusion The sensitivity o myocar dial contractile protein to calcium is decreased in the rats with endotoxic rats . MCI-154, a calcium sensitizer, is able to reverse the decreased sensitivity s ignificantly and increase the Tmax of the myocardium.
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Key words： endotoxic shock; naked fiber; papillary m uscle; calcium sensitizer; MCI-154;rat▲
研究显示，内毒素休克后，心肌细胞对钙敏感性降低是心肌收缩功能降低的原因之一 [1]。钙增敏剂可通过与心肌肌钙蛋白钙结合亚单位(TnC)Ca2+结合位点相互 作用，增加TnC对钙的亲和力，增强心肌收缩 力，改善心功能[2～4]。但有关钙增敏剂对内毒素休克心肌钙敏感性的作用效果如 何尚未见报道。我们先前的研究发现，钙增敏剂MCI-154用于内毒素休克家兔 的治疗时，能明显改善心功能，对内毒素休克所引起的循环紊乱有一定的纠正作用[5 ，6]。为进一步探讨钙增敏剂改善内毒素休克机体心功能的机制，本试验研究了M CI-154对内毒素休克心肌钙敏感性的影响。
1 材料与方法
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1.1 大鼠内毒素休克模型
Wistar大鼠，体重120～150 g，雌雄不拘，试验前随机分组，内毒素休克模型按本实验 室常用方法完成，即10 mg/kg大肠杆菌内毒素(Endotoxin,O111:B4， Sigma)腹腔内注射， 8 h后进行实验。假休克组腹腔内注射同10 mg/kg内毒素等容量的生理盐水。
1.2 大鼠裸露乳头肌的制备
参照黄焰等[7]的方法进行。断头活杀大鼠，迅速开胸取心脏置于连续通气(95 %O2和5%CO2)的25°C生理盐水溶液中，成份(mmol/L)：NaCl 130,KC l 4, CaCl2 2.5 ,Glucose 10, Tris 10，pH 7.0。剪开右心室，用小剪刀游离一束直径小于1 mm的乳头肌， 结扎腱端，游离后放入高精度离体乳头肌灌流槽，肌端固定于肌槽不锈钢拉钩上，腱端与高 精度等长张力换能器(Stathan UC2, Gould,USA)连接，肌肉收缩的张力信号经载波放大器(A P-600 G)输入四道记录仪(RM6200型，日本光电公司)进行描记记录。肌肉在25°C生理盐液 中平衡15 min后，先用25°C含皂素(Saponin)的蜕膜液(Skinned solution)作30 min浸浴处 理，再用25°C无钙松驰液(Relaxing solution)洗去蜕膜液，逐步调节肌肉长度至130%自然 长度，稳定10 min后，进行下一步实验。
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1.3 大鼠裸露乳头肌钙敏感性的测定
动物分为4组，每组8只，分别为：①假休克组(Ⅰ组)；②内毒素休克组(Ⅱ组)；③甲脯 吡酮组(Ⅲ组)，动物处理同②组，灌流裸露乳头肌的激活液(Activating solution)含5×1 0-5mol/L的甲腈吡酮；④MCI-154组(Ⅳ组)，动物处理同②组，灌流裸露乳头肌的激 活液中含1×10-5mol/L的MCI-154(本实验室结果：MCI-154增加正常大鼠乳头肌收 缩力的效价约为甲腈吡酮的5倍)。依次用pCa(-log[Ca2+])为7.0、6.5、6.0、5.5 、5.0、4.5、4.0 的含或不含强心药物的激活液(25°C)灌流裸露乳头肌，每一个pCa点 大约作用5 min后，再开始下一个pCa液。实验结束后，用滤纸吸干乳头肌表面液体并称重(mg)，测量乳 头肌长度(mm)，按肌肉比重1.0计算出乳头肌横截面积(CSA)，乳头肌产生的张力经CSA校正 后获得张力数据(mN/mm2)。以每条乳头肌在pCa 4.0时的张力为最大收缩力(Tmax)， 其它pCa点张力值除以Tmax算出pC点的相对张力(%)，然后以相对张力为纵轴，pCa为 横轴，按Hill方程：T=[Ca2+]n/(Kn+[Ca2+]n)，进行回归可得张力 -pCa曲线。方程中T为相对张力，即不同pCa的张力与Tmax的百分比，n为回 归斜 率，K为待求的Hill系数，为产生50%Tmax的Ca2+浓度，其负对数(-lo gK)即为pCa50。pCa50值是衡量TnC钙敏感性的定量指标[7]。
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1.4 不同浓度的MCI-154对内毒素休克大鼠裸露乳头肌钙敏感性的影响
动物分成3组，每组8只：①10-6mol/L MCI-154组(a组)；②：10-5mol/L MCI-154组(b组)，同1.3中的Ⅳ组；③10-4mol/L MCI-154组(c组)。①组每个pCa 点含10-6mol/L的MCI-154；②组每个pCa点含10-5mol/L的MCI-154；③组每 个pCa点含10-4mol/L的MCI-154。实验操作步骤及数据处理1.3。
1.5 液体配制
松驰液：成份(mmol/L) KCl 140,MgCl2 5,EGTA 10，咪唑25，Na2ATP 5，磷酸肌酸 (CP)10，磷酸肌酸激酶(CPK)0.1 mg/ml，pH 7.2；蜕膜液：在松驰液中加入500 μg/ml的皂 素；激活液：在松驰液中加入不同浓度的CaCl2，根据确定的pCa值计算出溶液中所需的Ca Cl2量，计算过程采用Fabiato“computer programs for calculating total”计算程序( 湖南医科大学心血管生理学研究室提供)完成。实验用溶液均用双蒸水当日配制，4°C冰箱 保存，其中Na2ATP、CP、CPK在临用前加入，溶液pH用1 mol/L KOH调至7.2，药品用1/10万 电子天秤称量。皂素、CP、CPK、CaCl2、EGTA、Na2ATP均为Sigma公 司产品，MCI-154由第二军医大学药学院提供，Milrinone购自重庆医学工业公司，其它试 剂均为分析纯。
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1.6 统计学处理
实验结果经统计学处理后以
±s表示，用t检验分析不同组间的差异性。2 结果
2.1 MCI-154对内毒素休克大鼠裸露乳头肌钙反应性的影响
各组大鼠乳头肌重量、长度、CSA均无明显差别(P> 0.05)，各组 Tmax见表1。 Ⅱ和Ⅲ组Tmax均低于Ⅰ组(P< 0.05)，Ⅳ组Tmax明显高于Ⅱ 和Ⅲ组(P< 0. 05)，与Ⅰ组Tmax无明显差别(P >0.05)。各组张力-pCa曲线均呈S 形，见图1，Ⅱ 组pCa 6.5～4.5点上的相对张力明显低于Ⅰ组(P< 0.05,0.01)，曲线向右 移位；Ⅲ组p Ca 6.5～4.5点上的相对张力亦明显低于Ⅰ组(P< 0.05)，且与Ⅱ组无明显 差别(P >0 .05)，曲线亦向右移位；Ⅳ组pCa 6.5～4.5点上的相对张力上升的幅度明显增加，显著高于 Ⅱ和Ⅲ组值(P< 0.05,0.01)，接近假休克组。各组pCa50值见表1， Ⅱ、Ⅲ组pCa 50值明显低于Ⅰ组(P< 0.05)，Ⅳ组pCa50明显高于Ⅱ及Ⅲ组( P< 0.05)，与Ⅰ组无明显差别(P >0.05)。
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2.2 MCI-154的剂量依赖效应
3组Tmax分别为(mN/mm2)：a组：19.63±1.71；b组：21.30±1.77;c组：21.78 ±19.91。b和c组Tmax明显高于a组(P< 0.05)。各组张力-pCa 曲线呈S形，见 图2，b组pCa 6.5、6.0、5.5、5.0点上的相对张力高于a组(P< 0.05) ；c组pCa 6.5 ～4.5点上的相对张力明显高于a组(P< 0.05、P< 0.01) ，且pCa 6.5、6.0、5.5点 上的相对张力高于b组(P< 0.05)。3组的pCa50值分别为：a组：5.7 2±0.28;b组： 5.84±0.19;c组：6.15±0.22。c组pCa50值高于a及b组(P< 0.05) ，b组pCa50值亦高于a组(P< 0.05)。
表1 甲腈吡酮和MCI-154对内毒素休克大鼠
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裸露心肌Tmax、pCa50值的影响
Tab 1 Effects of milrinone and MCI-154 on maximal activated
tension(Tmax)，Ca2+ sensitivity (pCa50) of naked right
ventricular papillary muscles in endotoxic shock rats
Group
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
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Ⅳ
Tmax(mN/mm2)
22.12±1.62
18.47±1.70#
19.01±2.18#
21.30±1.77*
pCa50
5.82±0.18
5.47±0.16#
5.49±0.21#
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5.84±0.19 *
Ⅰ:Sham shock group;Ⅱ:Endotoxic shock group;
Ⅲ:Milrino ne group;Ⅳ:MCI-154 group;
#:P< 0.05 vs Ⅰ;*：P< 0.05 vs Ⅱ and Ⅲ
图1 MCI-154和Milrinone对内毒素休克大鼠 裸露乳头肌张力-pCa曲线的影响
Fig 1 Changes of relative tension(%) of naked papillary muscles from e ndotoxic shock rats following administration of milrinone or MCI-154
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#:P< 0.05,# #：P < 0.01 vs Ⅰ;
*:P< 0.05 vs Ⅱ and Ⅲ
图2 不同浓度的MCI-154对内毒素休克大鼠 裸露乳头肌张力-pCa曲线的影响
Fig 2 Effect of MCI-154 of different concentration on relative tension( %) of naked papillary muscles from endotoxic shock rats
a:1×10-6 mol/L MCI-154 group; b: 1×10-5 mol/L MCI-154 group; c:1 ×10-4 mol/L MCI-154 group; #：P< 0.05,# #： P< 0.01 vs a; *：P< 0.05 vs b
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3 讨论
利用皂素制备的心肌标本，心肌肌膜、肌浆网膜和线粒体膜上的胆固醇被溶解，膜上出 现小孔，Ca2+、ATP、EGTA等小分子可自由出入，而线粒体、肌浆网内的酶不能流出 [8]。这样就消除了灌流液与心肌细胞之间的离子屏障，细胞内也不具备调节钙离 子浓度的能力，灌流液中的钙浓度相当于完好肌纤维的细胞内浓度，灌流液中的钙能直接作 用于收缩蛋白成份，触发肌张力的变化。此方法既可确定钙敏感性指标pCa50，同时 又能进行肌肉收缩功能的研究[7]，因而，是目前研究强心药物钙增敏效果的常用 制备[8]。
本实验利用裸露乳头肌制备，研究了大鼠内毒素休克后心肌收缩蛋白钙敏感性的变化， 结果显示：内毒素休克后，大鼠裸露乳头肌钙最大激活张力降低，张力-pCa曲线向右 移位 ，曲线的pCa50值明显低于假休克组。这些结果表明内毒素休克后，心肌收缩蛋白对 钙的敏感性降低。这与很多利用离体心肌条和心肌细胞进行的实验结果一致。有关脓毒症 /感染性休克时心肌收缩蛋白对钙敏感性降低的机制目前尚不清楚，可能与 下列因素有关：①脓毒症/感染性休克时心肌缺血缺氧[9]，心肌能量供应和利用 障碍可能是原因之一。心肌缺血缺氧后，肌酸激酶活性降低，激活肌酸激酶的底物ADP受限 ，导致横桥(Cross bridge)周围无机磷的积聚，使横桥循环从强结全状态变为弱结合状态， 钙激活引起的心肌收缩力降低[3]。②可能与脓毒症/感染性休克时发生的机体内酸 中毒，特别是心肌细胞内酸中毒有关，心肌细胞内酸中毒后，H+与Ca2+ 竞争TnC上的钙结合位点，引起TnC对钙的亲和力降低[3]。③可能与钙超载有关 。脓毒症/感染性休克后，心肌细胞内发生钙超载[10]，心肌细胞钙超载后，心肌 收缩和舒张期钙波动的正常生理变化发生异常，心肌收缩蛋白激活呈现不一致性，外钙激 活引起的整体收缩力降低。可见，脓毒症/感染性休克时，很多因素可导致心肌收缩蛋白对 钙敏感性的降低，因此，提高心肌收缩蛋白对钙的敏感性，同时避免进一步加重心肌细胞 内钙超载，对增加心肌收缩力，改善脓毒症/感染性休克机体的心功能是很有意义的。但目 前临床上使用的强心药都不具备此功能[4]。本实验亦显示磷酸二酯酶抑制剂类强 心药甲腈吡酮作用于内毒素休克大鼠裸露乳头肌后，不能提高裸露乳头肌在pCa 7.0～4.5 点上的相对张力，不能纠正pCa-张力曲线向右移位，曲线的pCa50值明显低于假休克 组，与不加药物的内毒素休克组无明显区别。与甲腈吡酮相反，MCI-154却可使内毒素休克 大鼠裸露乳头肌Tmax及pCa 7.0～4.5浓度点上的相对张力增加，曲线向左移位， pCa 50值明显升高。MCI-154的上述作用还具有剂量依赖效应。上述结果表明：同作用于 正常心肌一样，MCI-154用于内毒素休克心肌后，亦能提高TnC对钙的亲和力，纠正心肌收 缩蛋白对钙敏感性的降低。这可能是MCI-154用于内毒素休克治疗后，增加心肌收缩力，改 善心功能的最主要机制。本研究提示，在治疗脓毒症/感染性休克时，钙增敏剂可能较目前 临床上应用的传统强心药更具优越性，更符合治疗逻辑。
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(致谢：感谢湖南医科大学心血管生理学研究室黄焰博士的大力支持!)
基金项目：全军“九五”攻关项目(96L041)
作者简介：梅建民(1966-)，男，湖北省麻城市人，博士， 主治医师，主要从事休克的病理生理及防治方面的研究，发表论文17篇，现在北京军区总医 院肝胆外科工作，北京 100700。电话：(010)66721629-8090
参考文献：
[1] Hung J, Lew W Y W. Cellular mechanisms of endotoxin-induce d myocardial depression in rabbits[J]. Circ Res,1993,73(1):125-134.
[2] Kitada Y, Kobayashi M, Narimatsu A, et al. Potent stimula tion of my ofilament force and adenosine triphosphatase activity of canine cardiac muscle t hrough a direct enhancement of troponin C Ca2+ binding by MCI-154, a nove l cardiotonic agent[J]. J Pharmacol Exp Ther,1989,250(1):272-277.
, http://www.100md.com
[3] Kitada Y. MCI-154, a cardiac Ca2+ sensitizer, reverses the d epression in maximal Ca2+-activated force by inorganic phosphate and acid ic pH in skinned fibers of guinea pig heart[J]. Cardiovasc Drugs Ther,1997,11( 5):611-618.
[4] Mathew L, Kats S D. Calcium sensitising agents in heart failure[J ]. Drugs Aging,1998,12(3):191-204.
[5] 梅建民，胡德耀，陈惠孙，等.钙增敏剂MCI-154对内毒素休克家兔心功能的 影响[J].第三军医大学学报，1998，20(3)：194-196.
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[6] 梅建民，胡德耀，陈惠孙，等.钙增敏剂MCI-154对内毒素休克家兔治疗作用 的实验研究[J].第三军医大学学报，1998，20(6)：492-495.
[7] 黄 焰，贺振翻，李云霞.大鼠皂素蜕膜心肌肌钙蛋白Ca2+敏感性的实 验研究[J].中国应用生理杂志，1996，12(1)：1-5.
[8] Miller D J, Steele D S. The ‘calcium sensitising’ effects of ORG 3009 in saponin or Triton-skinned rat cardiac muscles[J]. Br J Pharmacol,1990 ,100:843-849.
[9] Groeneveld A B, van Lambalgen A A, van-den Bos G C, et al. Ma ldistribution of heterogeneous coronary blood flow during canine endotoxic shock [J]. Cardiovasc Res,1991,25(1):80-88.
[10] 董林旺，佟利家，张 力，等.败血症休克时心肌和心肌线粒体钙 转运的变化[J].生理学报，1993，45(2)：158-163.
收稿日期：1999-09-25；修回日期：2000-01-14, 百拇医药