含活血化瘀中药血清对血管平滑肌细胞迁移相关基因表达的影响
作者：周秀霞 温进坤 韩梅
单位：(河北医科大学基础医学研究所生物化学研究室(石家庄 050017))
关键词：中草药；药理学；肌,平滑,血管；病理生理学；基因表达；大鼠
河北医科大学学报000409
中图号 R865.4;R322.1+2
将中药煎剂给动物灌服一定时间后，取其血清进行药理学实验是近年建立的研究中药作用机制的新方法，即中药血清药理学研究方法。该方法不仅可反映中药有效成分及其代谢产物的药理作用，而且还能显示药物刺激机体所产生的内源性活性成分的作用。作者曾用主动脉内皮剥脱动物模型证实，中药活血化瘀方可有效抑制血管内皮损伤所诱发的新生内膜过度增生，起到防治血管再狭窄的作用。基于血管中膜平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖及向内膜下迁移是血管再狭窄的主要病理特征，本文用中药血清药理学实验方法，观察活血化瘀中药对VSMC迁移相关基因骨桥蛋白和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)基因表达的影响，以揭示活血化瘀防治血管再狭窄的分子机制。
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1 材料和方法
1.1 含中药鼠血清的制备：常规制备活血化瘀方药(含当归、丹参、黄芪、徐长卿、生蒲黄)煎剂，大鼠按4.4 g/(kg*d)生药量灌胃，1次/d，连续10 d，最后1次给药后2 h取血，分离血清即为含中药血清。将含中药血清的一部分用冷乙醇沉淀蛋白制成无蛋白中药血清。
1.2 VSMC培养及实验分组：按常规方法分离、培养大鼠VSMC。待VSMC生长至80 %融合时，饥饿培养24 h，然后分别换成含20 %正常鼠血清和bFGF 4 U/ml的培养液(对照组)，含20 %中药鼠血清和bFGF 4 U/ml的培养液(中药血清组)，或含20 %无蛋白中药血清和bFGF 4 U/ml的培养液(无蛋白中药血清组)，继续培养24 h。
1.3 RNA提取及Northern 印迹分析：用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从各组VSMC提取RNA，按标准方法进行电泳、转膜及与骨桥蛋白或MMP-2探针进行杂交。
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1.4 MMP-2酶图分析：采用含明胶SDS-PAGE方法。
2 结 果
2.1 中药血清抑制bFGF对骨桥蛋白及MMP-2基因表达的诱导作用:bFGF可显著诱导骨桥蛋白和MMP-2在VSMC中进行表达，与对照组相比，中药血清明显抑制bFGF对两种基因表达的诱导作用，其抑制率分别为23 %和18 %左右，中药血清去蛋白后对两种基因表达的抑制作用与去蛋白前没有明显差别。
2.2 中药血清抑制bFGF诱生的MMP-2活性:bFGF作用于VSMC 24 h后，细胞培养液中MMP-2活性显著增加，加入中药血清后，被bFGF诱导产生的MMP-2活性明显降低，中药血清去蛋白后仍保持其原有的作用。
3 讨 论
已经证明，VSMC从血管中膜向内膜下迁移除需要对细胞外基质进行降解外，还需要骨桥蛋白的介导，因此有人将骨桥蛋白及MMP基因称为细胞迁移相关基因。虽然曾有报道指出，抑制细胞迁移相关基因表达可预防血管内皮损伤所诱发的新生内膜过度增殖，但至今尚未找到预防血管再狭窄的有效药物。本文在过去研究的基础上，进一步探讨活血化瘀中药抑制血管新生内膜形成与骨桥蛋白和MMP-2基因表达之间的关系。实验结果表明，含活血化瘀中药的血清可明显抑制体外培养的VSMC表达骨桥蛋白和MMP-2，推测这可能是该方药防治血管再狭窄的分子机制之一。本文还发现，含中药血清经乙醇沉淀除去蛋白后，对骨桥蛋白和MMP-2表达的影响不发生明显变化，由此得出该方药中影响上述两种基因表达的成分不是机体产生的内源性多肽类物质，而是被机体吸收的中药有效成分或其代谢产物的结论。
基金项目：国家自然科学基金(No.39770312)及河北省自然科学基金(No.398284)资助项目
(2000-04-07 收稿)
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单位：(河北医科大学基础医学研究所生物化学研究室(石家庄 050017))
关键词：中草药；药理学；肌,平滑,血管；病理生理学；基因表达；大鼠
河北医科大学学报000409
中图号 R865.4;R322.1+2
将中药煎剂给动物灌服一定时间后，取其血清进行药理学实验是近年建立的研究中药作用机制的新方法，即中药血清药理学研究方法。该方法不仅可反映中药有效成分及其代谢产物的药理作用，而且还能显示药物刺激机体所产生的内源性活性成分的作用。作者曾用主动脉内皮剥脱动物模型证实，中药活血化瘀方可有效抑制血管内皮损伤所诱发的新生内膜过度增生，起到防治血管再狭窄的作用。基于血管中膜平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖及向内膜下迁移是血管再狭窄的主要病理特征，本文用中药血清药理学实验方法，观察活血化瘀中药对VSMC迁移相关基因骨桥蛋白和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)基因表达的影响，以揭示活血化瘀防治血管再狭窄的分子机制。
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1 材料和方法
1.1 含中药鼠血清的制备：常规制备活血化瘀方药(含当归、丹参、黄芪、徐长卿、生蒲黄)煎剂，大鼠按4.4 g/(kg*d)生药量灌胃，1次/d，连续10 d，最后1次给药后2 h取血，分离血清即为含中药血清。将含中药血清的一部分用冷乙醇沉淀蛋白制成无蛋白中药血清。
1.2 VSMC培养及实验分组：按常规方法分离、培养大鼠VSMC。待VSMC生长至80 %融合时，饥饿培养24 h，然后分别换成含20 %正常鼠血清和bFGF 4 U/ml的培养液(对照组)，含20 %中药鼠血清和bFGF 4 U/ml的培养液(中药血清组)，或含20 %无蛋白中药血清和bFGF 4 U/ml的培养液(无蛋白中药血清组)，继续培养24 h。
1.3 RNA提取及Northern 印迹分析：用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从各组VSMC提取RNA，按标准方法进行电泳、转膜及与骨桥蛋白或MMP-2探针进行杂交。
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1.4 MMP-2酶图分析：采用含明胶SDS-PAGE方法。
2 结 果
2.1 中药血清抑制bFGF对骨桥蛋白及MMP-2基因表达的诱导作用:bFGF可显著诱导骨桥蛋白和MMP-2在VSMC中进行表达，与对照组相比，中药血清明显抑制bFGF对两种基因表达的诱导作用，其抑制率分别为23 %和18 %左右，中药血清去蛋白后对两种基因表达的抑制作用与去蛋白前没有明显差别。
2.2 中药血清抑制bFGF诱生的MMP-2活性:bFGF作用于VSMC 24 h后，细胞培养液中MMP-2活性显著增加，加入中药血清后，被bFGF诱导产生的MMP-2活性明显降低，中药血清去蛋白后仍保持其原有的作用。
3 讨 论
已经证明，VSMC从血管中膜向内膜下迁移除需要对细胞外基质进行降解外，还需要骨桥蛋白的介导，因此有人将骨桥蛋白及MMP基因称为细胞迁移相关基因。虽然曾有报道指出，抑制细胞迁移相关基因表达可预防血管内皮损伤所诱发的新生内膜过度增殖，但至今尚未找到预防血管再狭窄的有效药物。本文在过去研究的基础上，进一步探讨活血化瘀中药抑制血管新生内膜形成与骨桥蛋白和MMP-2基因表达之间的关系。实验结果表明，含活血化瘀中药的血清可明显抑制体外培养的VSMC表达骨桥蛋白和MMP-2，推测这可能是该方药防治血管再狭窄的分子机制之一。本文还发现，含中药血清经乙醇沉淀除去蛋白后，对骨桥蛋白和MMP-2表达的影响不发生明显变化，由此得出该方药中影响上述两种基因表达的成分不是机体产生的内源性多肽类物质，而是被机体吸收的中药有效成分或其代谢产物的结论。
基金项目：国家自然科学基金(No.39770312)及河北省自然科学基金(No.398284)资助项目
(2000-04-07 收稿)
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