重组人巨噬细胞集落刺激因子受体胞外区蛋白的纯化及单抗的制备
作者：杨学辉 刘彦信 陈永春 李恩
单位：(河北医科大学基础医学院生物化学教研室(石家庄 050017))
关键词：受体，巨噬细胞集落刺激因子/分离和提纯；细胞融合；单克隆抗体；免疫学
河北医科大学学报000402
摘 要 目的 重组人巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CSFR)胞外区蛋白的分离纯化及单抗的制备。方法 用pET28(+)a构建的c-fms重组体转化大肠杆菌，IPTG诱导其表达，采用亲和层析进行复性纯化目的蛋白，利用细胞融合技术制备并筛选M-CSFR胞外区蛋白的单克隆抗体。结果 经转化的大肠杆菌IPTG诱导后可大量表达目的蛋白，但形成不溶性的包涵体，亲和层析柱上复性可获得可溶性较纯的目的蛋白，经细胞融合技术筛选出1株M-CSFR的单抗细胞。结论 柱上复性可获得可溶性复性蛋白。
, 百拇医药
中图号 R371.6
PURIFICATION OF HUMAN MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR RECEPTOR EXOCELLULAR PROTEIN AND
PREPARATION OF ITS MONOCLONAL ANTIBODY
Yang Xuehui Liu Yanxin Chen Yongchun Li En
Department of Biochemistry，the School of Basic
Medical Sciences，Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050017)
, 百拇医药
ABSTRACT Objective To purify the human macrophage colony-stimulating factor receptor (h-M-CSFR) exocellular protein and prepare its monoclonal antibody.Methods The recombinat pET28(+)a-fms was transformed into E coli. By affinity chromatography, the target protein was purified and renatured ,and its monoclonal antibody was prepared by cell hybridization technology.Results The transformed E coli expressed M-CSFR exocellular protein, however, it produced issoluable inclusion bodies when induced by IPTG. After being lysised by denaturants such as 6 mol/L guanidine HCl and refolded on the column of affinity chromatography, purified and renatured target protein was obtained. By cell hybridization technology,the monoclonal antibody of target protein was available.Conclusion Refolding on the column obtained soluable renatured protein.
, http://www.100md.com
MeSH receptors,macrophage colony-stimulating factor/isol;cell fusion;monoclonal antibody/immunol
巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CSFR)是由原癌基因c-fms编码的跨膜糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体。胞外区约有513个氨基酸，形成3个Ig功能域，可与配体结合[1]。正常情况下M-CSFR主要分布于单核巨噬细胞、破骨细胞、胎盘滋养层细胞，细胞恶性转化后可表达于绒毛癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞[2～4]。c-fms的表达与细胞恶性转化相关，但其机制尚不清楚。本文利用分子克隆技术用pET28(+)a-fms转化大肠杆菌，并进行诱导表达产生M-CSFR胞外区蛋白，经亲和层析分离纯化，细胞融合技术制备筛选抗M-CSFR胞外区的单抗，以便进一步研究M-CSFR的生物学作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料：pET28(+)a-fms由中国医学科学院协和基础医学研究所刘彦信教授提供，骨髓瘤细胞SP2/0由河北医科大学实验动物中心吕占军教授提供，Babl/c小鼠购自河北医科大学实验动物中心。Ni-NTA凝胶购自BIO-TECH公司，IPTG、卡那霉素、盐酸胍及其他试剂购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌的转化及阳性克隆的鉴定：常规方法制备感受态细菌HB 101及转化，用含1 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基筛选转化细菌，挑取单菌落进行小量诱导表达，细菌裂解液经SDS-PAGE分析目的蛋白。
1.2.2 M-CSFR胞外区的诱导表达及分离纯化：挑取已鉴定的阳性菌落，接种于5 ml含1 μg/ml卡那霉素的LB培养基中振荡培养3 h，转接于600 ml同样培养基中，振荡培养至OD260为 0.6～1.0，加入IPTG(终浓度为2 mmol/L)诱导表达3 h。离心收集细菌，用超声缓冲液(pH 7.8，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L磷酸缓冲液)洗涤1次，将细菌悬于50 ml预冷超声缓冲液中超声破壁，4 ℃，16 000 r/min离心15 min，收集包涵体，用超声缓冲液洗涤2次，加入裂解缓冲液(pH 7.8，6 mol/L盐酸胍，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/LTris-Cl)裂解包涵体，4 ℃，28 000 r/min离心25 min，收集上清于变性条件下上Ni-NTA亲和层析柱，洗涤缓冲液(pH 7.8，50 mmol/L咪唑，6 mol/L盐酸胍，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl)洗涤未结合杂蛋白，逐步降低洗涤缓冲液中盐酸胍的浓度分布进行复性，用含500 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱收集蛋白，电泳分析。
, 百拇医药
1.2.3 M-CSFR胞外区单抗的制备：用100 μg纯化蛋白加弗氏完全佐剂混合免疫 Babl/c小鼠，4周后加强免疫，3～4 d后，无菌条件下剖取脾脏过200目细胞筛，收集脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养基筛选，分离人单核细胞包板制备细胞抗原，ELISA法筛选阳性细胞株，再经3次亚克隆进一步筛选获得抗M-CSFR胞外区单克隆抗体细胞株LY12，扩增LY12，用LY12腹腔接种Babl/c小鼠，0.2 ml/只(细胞浓度为5×106个/ml，接种前1周腹腔注射弗氏不完全佐剂 0.5 ml/只)，10 d后收集腹水，正辛酸-硫酸铵沉淀纯化抗体，透析除盐，用细胞抗原包板ELISA法检测抗体效价。
2 结 果
2.1 转化细菌诱导表达蛋白的鉴定：转化细菌经IPTG诱导后，去细菌裂解液上样进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色显示在约34 ku处与未诱导细菌比较有1条明显蛋白带。表明pET28(+)a-fms已转化大肠杆菌，并能诱导表达。
, 百拇医药
2.2 M-CSFR胞外区蛋白的分离纯化及复性：大肠杆菌经IPTG诱导表达后，采用亲和层析，凝胶柱上分步复性得到可溶性的蛋白质，经SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色，只在相对分子质量34 ku处有1条蛋白带(图1)。
图1 SDS-PAGE鉴定纯化后蛋白
Figure 1 SDS-PAGE shows the purified protein
M:molecular mass marker
A,B:inclusion boby lysis solution
C:wash solution after affinity chromatography
, 百拇医药
D,E,F:elute solution
2.3 M-CSFR胞外区单克隆抗体的筛选制备：利用细胞融合技术，ELISA法检测筛选产生抗体的细胞株，获得阳性细胞株LY12。用LY12腹腔接种Babl/c小鼠后，获得含大量抗体的腹水，盐析纯化后，用ELISA法检测抗体效价为1∶1 600。
3 讨 论
原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达后，往往形成不溶性的包涵体，变性条件下裂解后，复性成了一大难题，由于不同的蛋白质分子组成和结构不同，目前尚未有共同有效的复性方法。作者采用亲和层析将目的蛋白结合于凝胶柱上，分子之间被凝胶相隔，再缓慢去除变性剂后有利于分子内折叠的形成，洗脱后获得了可溶性的复性蛋白,为原核表达产物的复性提供了1种新方法。
M-CSF受体作为酪氨酸激酶型受体，与配体M-CSF结合后可传导细胞信号，调节细胞的增殖与分化[5，6]，但国内尚未有M-CSF制品，进口制品价格昂贵。抗M-CSF受体抗体具有与M-CSF受体结合并诱导细胞内信号传递的特性，本实验采用细胞融合技术获得了抗M-CSF受体胞外区的抗体，对进一步研究M-CSF受体表达，以及与细胞增殖分化的关系和M-CSF受体参与的细胞内信号传递途径的研究具有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1.Feihua Q, Prabir R, Karen B. Primary structure of c-kit: relationship with the CSF-1/PDGF receptor kinase family-oncogenic activation of v-kit involves deletion of extracellular domain and C terminus. EMBO J，1988,7(5):1003
2.Hofstetter W, Wetterwald MG, Cecchini R, et al. Detection of transcripts for the receptor for macrophage colony stimulating factor, c-fms,in murine osteoclasts. Proc Natl Acad Sci USA，1992,85(20):9637
, 百拇医药
3.Hofstetler W,Wetterwals A, Cecchini MG, et al. Detection of transcripts and binding sites for colony stimulating factor-1 during bone development. Bone， 1995,17(2):145
4.Zhang ZY, Muhllaner R, Felix R. Phorbol myristate acetate downregulates the binding sites for colony stimulating factor-1 on osteoclasts isolated from rats.Calcif Tissue Int，1998,62(2):148
5.Odgren PR,Popoff SN, Safadi FF, et al.The toothless osteopetrotic rat has a normal vitamin D binding protein-macrophage activating factor cascade and chondrodysplasia resistant to treatment with colony stimulating factor-1 and /or DBF-MAF. Bone，1999,25(2):175
6.Ahamed S, Surenduer K, Zhi-Min Y. Monocyte colony-stimulating factor stimulates binding of phosphatidylinositol 3-kinase to Grb2 sos complexes in human monocytes. J Biol Chem,1995, 270(18):10380
(1999-11-19 收稿), 百拇医药
单位：(河北医科大学基础医学院生物化学教研室(石家庄 050017))
关键词：受体，巨噬细胞集落刺激因子/分离和提纯；细胞融合；单克隆抗体；免疫学
河北医科大学学报000402
摘 要 目的 重组人巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CSFR)胞外区蛋白的分离纯化及单抗的制备。方法 用pET28(+)a构建的c-fms重组体转化大肠杆菌，IPTG诱导其表达，采用亲和层析进行复性纯化目的蛋白，利用细胞融合技术制备并筛选M-CSFR胞外区蛋白的单克隆抗体。结果 经转化的大肠杆菌IPTG诱导后可大量表达目的蛋白，但形成不溶性的包涵体，亲和层析柱上复性可获得可溶性较纯的目的蛋白，经细胞融合技术筛选出1株M-CSFR的单抗细胞。结论 柱上复性可获得可溶性复性蛋白。
, 百拇医药
中图号 R371.6
PURIFICATION OF HUMAN MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR RECEPTOR EXOCELLULAR PROTEIN AND
PREPARATION OF ITS MONOCLONAL ANTIBODY
Yang Xuehui Liu Yanxin Chen Yongchun Li En
Department of Biochemistry，the School of Basic
Medical Sciences，Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050017)
, 百拇医药
ABSTRACT Objective To purify the human macrophage colony-stimulating factor receptor (h-M-CSFR) exocellular protein and prepare its monoclonal antibody.Methods The recombinat pET28(+)a-fms was transformed into E coli. By affinity chromatography, the target protein was purified and renatured ,and its monoclonal antibody was prepared by cell hybridization technology.Results The transformed E coli expressed M-CSFR exocellular protein, however, it produced issoluable inclusion bodies when induced by IPTG. After being lysised by denaturants such as 6 mol/L guanidine HCl and refolded on the column of affinity chromatography, purified and renatured target protein was obtained. By cell hybridization technology,the monoclonal antibody of target protein was available.Conclusion Refolding on the column obtained soluable renatured protein.
, http://www.100md.com
MeSH receptors,macrophage colony-stimulating factor/isol;cell fusion;monoclonal antibody/immunol
巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CSFR)是由原癌基因c-fms编码的跨膜糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体。胞外区约有513个氨基酸，形成3个Ig功能域，可与配体结合[1]。正常情况下M-CSFR主要分布于单核巨噬细胞、破骨细胞、胎盘滋养层细胞，细胞恶性转化后可表达于绒毛癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞[2～4]。c-fms的表达与细胞恶性转化相关，但其机制尚不清楚。本文利用分子克隆技术用pET28(+)a-fms转化大肠杆菌，并进行诱导表达产生M-CSFR胞外区蛋白，经亲和层析分离纯化，细胞融合技术制备筛选抗M-CSFR胞外区的单抗，以便进一步研究M-CSFR的生物学作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料：pET28(+)a-fms由中国医学科学院协和基础医学研究所刘彦信教授提供，骨髓瘤细胞SP2/0由河北医科大学实验动物中心吕占军教授提供，Babl/c小鼠购自河北医科大学实验动物中心。Ni-NTA凝胶购自BIO-TECH公司，IPTG、卡那霉素、盐酸胍及其他试剂购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌的转化及阳性克隆的鉴定：常规方法制备感受态细菌HB 101及转化，用含1 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基筛选转化细菌，挑取单菌落进行小量诱导表达，细菌裂解液经SDS-PAGE分析目的蛋白。
1.2.2 M-CSFR胞外区的诱导表达及分离纯化：挑取已鉴定的阳性菌落，接种于5 ml含1 μg/ml卡那霉素的LB培养基中振荡培养3 h，转接于600 ml同样培养基中，振荡培养至OD260为 0.6～1.0，加入IPTG(终浓度为2 mmol/L)诱导表达3 h。离心收集细菌，用超声缓冲液(pH 7.8，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L磷酸缓冲液)洗涤1次，将细菌悬于50 ml预冷超声缓冲液中超声破壁，4 ℃，16 000 r/min离心15 min，收集包涵体，用超声缓冲液洗涤2次，加入裂解缓冲液(pH 7.8，6 mol/L盐酸胍，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/LTris-Cl)裂解包涵体，4 ℃，28 000 r/min离心25 min，收集上清于变性条件下上Ni-NTA亲和层析柱，洗涤缓冲液(pH 7.8，50 mmol/L咪唑，6 mol/L盐酸胍，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl)洗涤未结合杂蛋白，逐步降低洗涤缓冲液中盐酸胍的浓度分布进行复性，用含500 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱收集蛋白，电泳分析。
, 百拇医药
1.2.3 M-CSFR胞外区单抗的制备：用100 μg纯化蛋白加弗氏完全佐剂混合免疫 Babl/c小鼠，4周后加强免疫，3～4 d后，无菌条件下剖取脾脏过200目细胞筛，收集脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养基筛选，分离人单核细胞包板制备细胞抗原，ELISA法筛选阳性细胞株，再经3次亚克隆进一步筛选获得抗M-CSFR胞外区单克隆抗体细胞株LY12，扩增LY12，用LY12腹腔接种Babl/c小鼠，0.2 ml/只(细胞浓度为5×106个/ml，接种前1周腹腔注射弗氏不完全佐剂 0.5 ml/只)，10 d后收集腹水，正辛酸-硫酸铵沉淀纯化抗体，透析除盐，用细胞抗原包板ELISA法检测抗体效价。
2 结 果
2.1 转化细菌诱导表达蛋白的鉴定：转化细菌经IPTG诱导后，去细菌裂解液上样进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色显示在约34 ku处与未诱导细菌比较有1条明显蛋白带。表明pET28(+)a-fms已转化大肠杆菌，并能诱导表达。
, 百拇医药
2.2 M-CSFR胞外区蛋白的分离纯化及复性：大肠杆菌经IPTG诱导表达后，采用亲和层析，凝胶柱上分步复性得到可溶性的蛋白质，经SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色，只在相对分子质量34 ku处有1条蛋白带(图1)。
图1 SDS-PAGE鉴定纯化后蛋白
Figure 1 SDS-PAGE shows the purified protein
M:molecular mass marker
A,B:inclusion boby lysis solution
C:wash solution after affinity chromatography
, 百拇医药
D,E,F:elute solution
2.3 M-CSFR胞外区单克隆抗体的筛选制备：利用细胞融合技术，ELISA法检测筛选产生抗体的细胞株，获得阳性细胞株LY12。用LY12腹腔接种Babl/c小鼠后，获得含大量抗体的腹水，盐析纯化后，用ELISA法检测抗体效价为1∶1 600。
3 讨 论
原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达后，往往形成不溶性的包涵体，变性条件下裂解后，复性成了一大难题，由于不同的蛋白质分子组成和结构不同，目前尚未有共同有效的复性方法。作者采用亲和层析将目的蛋白结合于凝胶柱上，分子之间被凝胶相隔，再缓慢去除变性剂后有利于分子内折叠的形成，洗脱后获得了可溶性的复性蛋白,为原核表达产物的复性提供了1种新方法。
M-CSF受体作为酪氨酸激酶型受体，与配体M-CSF结合后可传导细胞信号，调节细胞的增殖与分化[5，6]，但国内尚未有M-CSF制品，进口制品价格昂贵。抗M-CSF受体抗体具有与M-CSF受体结合并诱导细胞内信号传递的特性，本实验采用细胞融合技术获得了抗M-CSF受体胞外区的抗体，对进一步研究M-CSF受体表达，以及与细胞增殖分化的关系和M-CSF受体参与的细胞内信号传递途径的研究具有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1.Feihua Q, Prabir R, Karen B. Primary structure of c-kit: relationship with the CSF-1/PDGF receptor kinase family-oncogenic activation of v-kit involves deletion of extracellular domain and C terminus. EMBO J，1988,7(5):1003
2.Hofstetter W, Wetterwald MG, Cecchini R, et al. Detection of transcripts for the receptor for macrophage colony stimulating factor, c-fms,in murine osteoclasts. Proc Natl Acad Sci USA，1992,85(20):9637
, 百拇医药
3.Hofstetler W,Wetterwals A, Cecchini MG, et al. Detection of transcripts and binding sites for colony stimulating factor-1 during bone development. Bone， 1995,17(2):145
4.Zhang ZY, Muhllaner R, Felix R. Phorbol myristate acetate downregulates the binding sites for colony stimulating factor-1 on osteoclasts isolated from rats.Calcif Tissue Int，1998,62(2):148
5.Odgren PR,Popoff SN, Safadi FF, et al.The toothless osteopetrotic rat has a normal vitamin D binding protein-macrophage activating factor cascade and chondrodysplasia resistant to treatment with colony stimulating factor-1 and /or DBF-MAF. Bone，1999,25(2):175
6.Ahamed S, Surenduer K, Zhi-Min Y. Monocyte colony-stimulating factor stimulates binding of phosphatidylinositol 3-kinase to Grb2 sos complexes in human monocytes. J Biol Chem,1995, 270(18):10380
(1999-11-19 收稿), 百拇医药