中药水蛭对缺血/再灌注后脑细胞的抗凋亡作用
作者：曹翠丽 马常升 马文领 杨天祝
单位：(河北医科大学基础医学研究所神经生物学研究室(石家庄 050017))
关键词：水蛭；药理学；再灌注损伤；代谢；脑；细胞死亡；生理；流式细胞术；方法
河北医科大学学报000401
摘 要 目的 观察水蛭水煎醇提取液对大鼠缺血/再灌注后脑细胞凋亡的保护作用。方法 将雄性SD大鼠60只，随机分为单纯缺血/再灌注组(A组)和缺血/再灌注+水蛭治疗组(B组)。插线法制备大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注模型，用流式细胞仪检测两组的脑细胞凋亡率。结果 B组脑细胞凋亡率明显低于A组(P<0.05) ，且脑细胞凋亡的发生推迟。结论 水蛭水煎醇提取液可降低缺血/再灌注后脑细胞凋亡率，对缺血脑细胞起保护作用。
中图号 R338.2
, 百拇医药
ANTI-APOPTOTIC EFFECT OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE HIRUDO ON CEREBRAL CELLS AFTER OCCLUSION/REPERFUSION
Cao Cuili Ma Changsheng Ma Wenling Yang Tianzhu
Department of Neurobiological Laboratory,Institute of Basic Medicine,Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050017)
ABSTRACT Objective To investigate the anti-apoptotic effect of hirudo on cerebral cells after middle cerebral artery (MCA) ischemia/reperfusion in rats. Methods Male SD rats (n=60) randomly divided into ischemia/reperfusion group (group A) and ischemia/reperfusion + treatment with hirudo group (group B).The MCA of SD rats was occluded for 2 h by inserting an intraluminal monofilament, and reperfusion was instituted for 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h (n=5 group B) respectively.Apoptotic rates of both groups were measured by flow cytometry.Results Apoptotic rate of cerebral cells of group B significantly lowered than group A (P<0.05), and the peak of apoptotic rate was postponed. Conclusion Hirudo can significantly reduce the apoptotic rate of cerebral cells after ischemia/reperfusion, thereby protect cerebral cells from apoptosis.
, http://www.100md.com
MeSH hirudo/pharmacol;reperfusioninjury/metab;brain;apoptosis/physiol;flow cytometry/methods
水蛭(hirudo)为传统中药，有活血化瘀之功效，临床上已用于治疗缺血性脑血管病[1]。在作者以往的研究中发现，水蛭水煎醇提取液能明显降低大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)的术后死亡率，并能减轻术后蛛网膜下腔出血的症状，对局灶性脑缺血的预后有积极作用[2]。本研究试图探讨水蛭水煎醇提取液对缺血/再灌注后脑细胞凋亡率的影响，为临床用药提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物选择与分组：雄性SD大鼠，体质量210～270 g，共60只，由本校动物中心提供。随机分为单纯缺血/再灌注组(A组)和缺血/再灌注+水蛭治疗组(B组)各30只，按MCAO 2 h再灌注6，12，24，48，72，96 h分为6组，每组各5只。
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1.2 水蛭水煎醇提取液制备：取水蛭100 g，加入300 ml蒸馏水煎至100 ml；向煎液中加入95%乙醇300 ml，放置48 h后取上清液；加热使乙醇挥发后剩余100 ml 。煮沸消毒30 min，即制成水蛭水煎醇提取液(1 g/ml)。
1.3 动物模型制备及评分标准[3]：A组以6 %水合氯醛(0.005 ml/g)腹腔注射麻醉后，经右侧颈外动脉向颈内动脉插入自行烧制的圆头尼龙线至大脑中动脉起始部，梗塞大脑中动脉。2 h后，于动物清醒状态下，由助手固定，分2次向外拔插线，中间间隔5～10 min，使插线头退回颈外动脉根部，保证再通完全。给药组为术前3 d开始给予水蛭水煎醇提取液腹腔注射0.015ml/(g.d)，MCAO后即刻按上述剂量给药1次，此后每24 h追加1次。
注意动物保暖，清醒前体温保持在30 ℃以上，记录动物存活情况。参考Longa法进行神经病学评分：0分，无神经缺损体征；1分，不能充分伸展对侧前爪；2分，向对侧旋转；3分，向对侧倾倒；4分，不能自主行走，意识丧失。于MCAO 2 h观察动物体征，一般状况良好，Longa法评分为2分。再灌注后即刻，观察动物体征， Longa法评分为2～3分。符合上述标准的选为合格模型。
, 百拇医药
1.4 流式细胞仪检测[4]：将制备成功的模型动物断头处死，迅速取脑，在冰上切割脑块(在视交叉前2 mm和乳头体后缘做两道平行冠状切口，然后将其从正中矢状切开)，将缺血侧脑块(视交叉乳头体)切碎后置于预冷的70 %乙醇中，4 ℃保存。用200目尼龙网研磨脑组织块，生理盐水冲洗，将冲洗液收集后离心，1 000 r/min，5 min，弃去上清，向沉淀物中加入0.5 %胃蛋白酶2 ml，37 ℃消化30 min后，加入生理盐水稀释至5 ml，用100目尼龙网过滤，将滤液离心，1 000 r/min，3 min，弃去上清。向沉淀物中加入细胞核DNA荧光素溴化乙啶(EB,10 μg/ml, Sigma)，4 ℃染色30 min后，用流式细胞仪(FACS 420)分析。测量数据和图像输入BDIS CONSORT30 计算机，应用相应的程序软件进行资料处理。每个样品分析105个细胞，计算凋亡率。
1.5 统计学处理：结果用
±s表示。用成组设计的两样本均数比较的t检验。P<0.05视为有意义。
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2 结 果
2.1 动物一般状况：A组动物一般状况较术前差，不思饮食，毛发光泽减退，体质量下降。B组动物术后一般状况良好，思饮食，毛发有光泽，体质量下降不明显。
2.2 凋亡率的改变：见表1。
表1 两组脑细胞凋亡率比较
Table 1 Comparison of apoptotic rates of cerebral cells between group A and group B
(n=5，±s,%) Groups
MCAO/R
, 百拇医药
6 h
12 h
24 h
48 h
72 h
96 h
A
3.38±0.76
6.98±1.63
11.68±1.44*
13.10±1.37**
10.20±2.30
, 百拇医药
8.97±1.52
B
2.68±1.23
5.36±1.47
8.82±2.46
9.75±0.87
10.30±1.89
8.20±1.58
*P<0.05 **P<0.01 vs B group by t test MCAO/R:middle cerebral artery occlusion/reperfusion
由表1可以看出，B组MCAO/R后凋亡高峰期的出现晚于A组；给水蛭治疗后，早期(48 h内)凋亡率降低明显，后期变化微弱。
, 百拇医药
3 讨 论
在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA含量随着细胞增殖周期各时相而发生变化。荧光染料与细胞DNA具有特异性结合，且有一定的量效关系，因此流式细胞术可进行DNA定量分析。凋亡的显著生化特征是DNA在Ca2+依赖性内切酶等的作用下，发生核小体间断裂。此时尽管有Ⅱ型谷胺酰胺转移酶活性增高，引起胞浆蛋白交联，可防止胞浆外溢,但胞膜通透性增强，小DNA片段丢失，因此凋亡细胞的DNA数量减少。用流式细胞仪检测DNA含量，可在G0/G1峰前出现1个小于二倍体含量峰，即亚二倍体峰，又称凋亡细胞峰，亚G1峰。根据该峰所占比例，可进行凋亡的定量分析[4]。
水蛭为1种传统的活血化瘀类中药，国内研究报道[1,5]水蛭有显著降低血清胆固醇作用，能非常显著地降低血粘稠度，有很强的抑制血小板聚集和抗血栓形成作用。水蛭对组织缺氧、缺血有保护作用。水蛭水煎醇提取液能促进家兔脑血肿的吸收，保护脑组织免遭坏死，并有利于神经功能的恢复。水蛭改善微循环的作用与肝素相仿，但无肝素过量引起出血的副作用。基于上述功效，作者在以往实验中尝试给大鼠腹腔注射水蛭水煎醇提取液，可以降低MCAO/R术后死亡率，并能减轻术后蛛网膜下腔出血的症状，对局灶性脑缺血的预后有积极作用[2]。本研究观察了A组和B组MCAO/R情况下凋亡率的变化，发现B组脑细胞凋亡率在再灌注24～48 h(凋亡高峰期)明显低于A组(P<0.05)，提示水蛭可以通过降低缺血再灌注后脑细胞凋亡率，从而对缺血/再灌注性脑损伤起到保护作用。
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另外，Li等[6，7]用TUNEL方法对缺血区的凋亡细胞进行了定位定量研究，报道MCAO 2 h再灌注 0.5 h即可检测到凋亡，再灌注24～48 h为凋亡出现的高峰，凋亡现象可持续到再灌注后28 d。作者以往用流式细胞仪定量检测缺血/再灌注后脑细胞凋亡率的时程变化，发现MCAO 2 h再灌注6 h凋亡率显著升高，于再灌注24～48 h达高峰，72 h已出现下降[8]，与Li等[6,7]的报道相符。进一步提示MCAO/R情况下，凋亡的出现是1个动态过程。如果能在早期终止或逆转凋亡的发生，将有利于疾病的恢复。本研究结果提示，水蛭水煎醇提取液可显著降低脑细胞凋亡高峰期凋亡率，并推迟凋亡高峰期的出现，提示在缺血/再灌注早期应用水蛭可降低脑细胞凋亡的发生率，更有利于疾病的恢复。
MCAO后，梗塞区主要位于视交叉平面前后，本实验取材范围有些偏大，可能使测得的凋亡率低于实际值。另外，对脑细胞凋亡率未进行分类检测，还有待进一步补充。但是本研究仍然可以提示，水蛭水煎醇提取液可明显改善MCAO/R时大鼠的一般状况，降低脑细胞的凋亡率，从而减少神经元因为凋亡性死亡而造成的不可逆损伤，有利于神经功能的恢复，为临床用药提供实验依据。
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参考文献
1.吕文海，王琦.中药水蛭现代研究进展.中国中药杂志，1994，19(12)：755
2.马文领，马常升，戴维国，等.活血与补气中药对脑缺血再灌注脑组织的超微结构影响.解剖学杂志，1998，21(增刊)：157
3.马常升，马文领，戴维国,等.插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究.解剖学杂志,1999，22(3)：209
4.左连富,主编.流式细胞术与生物医学.沈阳：辽宁科学技术出版社，1996.68～73
5.秦百宣，许素贞，钱彦丛，等.水蛭对血清胆固醇、血液粘度及血栓形成的影响.中药材，1994，17(10)：33
6.Li Y，Chopp M，Jiang N，et al.Induction of DNA fragmentation after 10-120 minutes of focal cerebral ischemia in rats.Stroke，1995，26(7)：1252
7.Li Y，Chopp M，Jiang N，et al.Temporal profile of in situ DNA fragmentation after transient middle cerebral artery occlusion in the rat.J Cereb Blood Flow Metab，1995，15(3)：389
8.曹翠丽，马常升，杨天祝，等.缺血再灌注后脑细胞凋亡率的测定.河北医学，2000，6(3)：193
(2000-01-17 收稿), 百拇医药
单位：(河北医科大学基础医学研究所神经生物学研究室(石家庄 050017))
关键词：水蛭；药理学；再灌注损伤；代谢；脑；细胞死亡；生理；流式细胞术；方法
河北医科大学学报000401
摘 要 目的 观察水蛭水煎醇提取液对大鼠缺血/再灌注后脑细胞凋亡的保护作用。方法 将雄性SD大鼠60只，随机分为单纯缺血/再灌注组(A组)和缺血/再灌注+水蛭治疗组(B组)。插线法制备大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注模型，用流式细胞仪检测两组的脑细胞凋亡率。结果 B组脑细胞凋亡率明显低于A组(P<0.05) ，且脑细胞凋亡的发生推迟。结论 水蛭水煎醇提取液可降低缺血/再灌注后脑细胞凋亡率，对缺血脑细胞起保护作用。
中图号 R338.2
, 百拇医药
ANTI-APOPTOTIC EFFECT OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE HIRUDO ON CEREBRAL CELLS AFTER OCCLUSION/REPERFUSION
Cao Cuili Ma Changsheng Ma Wenling Yang Tianzhu
Department of Neurobiological Laboratory,Institute of Basic Medicine,Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050017)
ABSTRACT Objective To investigate the anti-apoptotic effect of hirudo on cerebral cells after middle cerebral artery (MCA) ischemia/reperfusion in rats. Methods Male SD rats (n=60) randomly divided into ischemia/reperfusion group (group A) and ischemia/reperfusion + treatment with hirudo group (group B).The MCA of SD rats was occluded for 2 h by inserting an intraluminal monofilament, and reperfusion was instituted for 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h (n=5 group B) respectively.Apoptotic rates of both groups were measured by flow cytometry.Results Apoptotic rate of cerebral cells of group B significantly lowered than group A (P<0.05), and the peak of apoptotic rate was postponed. Conclusion Hirudo can significantly reduce the apoptotic rate of cerebral cells after ischemia/reperfusion, thereby protect cerebral cells from apoptosis.
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MeSH hirudo/pharmacol;reperfusioninjury/metab;brain;apoptosis/physiol;flow cytometry/methods
水蛭(hirudo)为传统中药，有活血化瘀之功效，临床上已用于治疗缺血性脑血管病[1]。在作者以往的研究中发现，水蛭水煎醇提取液能明显降低大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)的术后死亡率，并能减轻术后蛛网膜下腔出血的症状，对局灶性脑缺血的预后有积极作用[2]。本研究试图探讨水蛭水煎醇提取液对缺血/再灌注后脑细胞凋亡率的影响，为临床用药提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物选择与分组：雄性SD大鼠，体质量210～270 g，共60只，由本校动物中心提供。随机分为单纯缺血/再灌注组(A组)和缺血/再灌注+水蛭治疗组(B组)各30只，按MCAO 2 h再灌注6，12，24，48，72，96 h分为6组，每组各5只。
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1.2 水蛭水煎醇提取液制备：取水蛭100 g，加入300 ml蒸馏水煎至100 ml；向煎液中加入95%乙醇300 ml，放置48 h后取上清液；加热使乙醇挥发后剩余100 ml 。煮沸消毒30 min，即制成水蛭水煎醇提取液(1 g/ml)。
1.3 动物模型制备及评分标准[3]：A组以6 %水合氯醛(0.005 ml/g)腹腔注射麻醉后，经右侧颈外动脉向颈内动脉插入自行烧制的圆头尼龙线至大脑中动脉起始部，梗塞大脑中动脉。2 h后，于动物清醒状态下，由助手固定，分2次向外拔插线，中间间隔5～10 min，使插线头退回颈外动脉根部，保证再通完全。给药组为术前3 d开始给予水蛭水煎醇提取液腹腔注射0.015ml/(g.d)，MCAO后即刻按上述剂量给药1次，此后每24 h追加1次。
注意动物保暖，清醒前体温保持在30 ℃以上，记录动物存活情况。参考Longa法进行神经病学评分：0分，无神经缺损体征；1分，不能充分伸展对侧前爪；2分，向对侧旋转；3分，向对侧倾倒；4分，不能自主行走，意识丧失。于MCAO 2 h观察动物体征，一般状况良好，Longa法评分为2分。再灌注后即刻，观察动物体征， Longa法评分为2～3分。符合上述标准的选为合格模型。
, 百拇医药
1.4 流式细胞仪检测[4]：将制备成功的模型动物断头处死，迅速取脑，在冰上切割脑块(在视交叉前2 mm和乳头体后缘做两道平行冠状切口，然后将其从正中矢状切开)，将缺血侧脑块(视交叉乳头体)切碎后置于预冷的70 %乙醇中，4 ℃保存。用200目尼龙网研磨脑组织块，生理盐水冲洗，将冲洗液收集后离心，1 000 r/min，5 min，弃去上清，向沉淀物中加入0.5 %胃蛋白酶2 ml，37 ℃消化30 min后，加入生理盐水稀释至5 ml，用100目尼龙网过滤，将滤液离心，1 000 r/min，3 min，弃去上清。向沉淀物中加入细胞核DNA荧光素溴化乙啶(EB,10 μg/ml, Sigma)，4 ℃染色30 min后，用流式细胞仪(FACS 420)分析。测量数据和图像输入BDIS CONSORT30 计算机，应用相应的程序软件进行资料处理。每个样品分析105个细胞，计算凋亡率。
1.5 统计学处理：结果用
±s表示。用成组设计的两样本均数比较的t检验。P<0.05视为有意义。, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 动物一般状况：A组动物一般状况较术前差，不思饮食，毛发光泽减退，体质量下降。B组动物术后一般状况良好，思饮食，毛发有光泽，体质量下降不明显。
2.2 凋亡率的改变：见表1。
表1 两组脑细胞凋亡率比较
Table 1 Comparison of apoptotic rates of cerebral cells between group A and group B
(n=5，
±s,%) GroupsMCAO/R
, 百拇医药
6 h
12 h
24 h
48 h
72 h
96 h
A
3.38±0.76
6.98±1.63
11.68±1.44*
13.10±1.37**
10.20±2.30
, 百拇医药
8.97±1.52
B
2.68±1.23
5.36±1.47
8.82±2.46
9.75±0.87
10.30±1.89
8.20±1.58
*P<0.05 **P<0.01 vs B group by t test MCAO/R:middle cerebral artery occlusion/reperfusion
由表1可以看出，B组MCAO/R后凋亡高峰期的出现晚于A组；给水蛭治疗后，早期(48 h内)凋亡率降低明显，后期变化微弱。
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3 讨 论
在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA含量随着细胞增殖周期各时相而发生变化。荧光染料与细胞DNA具有特异性结合，且有一定的量效关系，因此流式细胞术可进行DNA定量分析。凋亡的显著生化特征是DNA在Ca2+依赖性内切酶等的作用下，发生核小体间断裂。此时尽管有Ⅱ型谷胺酰胺转移酶活性增高，引起胞浆蛋白交联，可防止胞浆外溢,但胞膜通透性增强，小DNA片段丢失，因此凋亡细胞的DNA数量减少。用流式细胞仪检测DNA含量，可在G0/G1峰前出现1个小于二倍体含量峰，即亚二倍体峰，又称凋亡细胞峰，亚G1峰。根据该峰所占比例，可进行凋亡的定量分析[4]。
水蛭为1种传统的活血化瘀类中药，国内研究报道[1,5]水蛭有显著降低血清胆固醇作用，能非常显著地降低血粘稠度，有很强的抑制血小板聚集和抗血栓形成作用。水蛭对组织缺氧、缺血有保护作用。水蛭水煎醇提取液能促进家兔脑血肿的吸收，保护脑组织免遭坏死，并有利于神经功能的恢复。水蛭改善微循环的作用与肝素相仿，但无肝素过量引起出血的副作用。基于上述功效，作者在以往实验中尝试给大鼠腹腔注射水蛭水煎醇提取液，可以降低MCAO/R术后死亡率，并能减轻术后蛛网膜下腔出血的症状，对局灶性脑缺血的预后有积极作用[2]。本研究观察了A组和B组MCAO/R情况下凋亡率的变化，发现B组脑细胞凋亡率在再灌注24～48 h(凋亡高峰期)明显低于A组(P<0.05)，提示水蛭可以通过降低缺血再灌注后脑细胞凋亡率，从而对缺血/再灌注性脑损伤起到保护作用。
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另外，Li等[6，7]用TUNEL方法对缺血区的凋亡细胞进行了定位定量研究，报道MCAO 2 h再灌注 0.5 h即可检测到凋亡，再灌注24～48 h为凋亡出现的高峰，凋亡现象可持续到再灌注后28 d。作者以往用流式细胞仪定量检测缺血/再灌注后脑细胞凋亡率的时程变化，发现MCAO 2 h再灌注6 h凋亡率显著升高，于再灌注24～48 h达高峰，72 h已出现下降[8]，与Li等[6,7]的报道相符。进一步提示MCAO/R情况下，凋亡的出现是1个动态过程。如果能在早期终止或逆转凋亡的发生，将有利于疾病的恢复。本研究结果提示，水蛭水煎醇提取液可显著降低脑细胞凋亡高峰期凋亡率，并推迟凋亡高峰期的出现，提示在缺血/再灌注早期应用水蛭可降低脑细胞凋亡的发生率，更有利于疾病的恢复。
MCAO后，梗塞区主要位于视交叉平面前后，本实验取材范围有些偏大，可能使测得的凋亡率低于实际值。另外，对脑细胞凋亡率未进行分类检测，还有待进一步补充。但是本研究仍然可以提示，水蛭水煎醇提取液可明显改善MCAO/R时大鼠的一般状况，降低脑细胞的凋亡率，从而减少神经元因为凋亡性死亡而造成的不可逆损伤，有利于神经功能的恢复，为临床用药提供实验依据。
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参考文献
1.吕文海，王琦.中药水蛭现代研究进展.中国中药杂志，1994，19(12)：755
2.马文领，马常升，戴维国，等.活血与补气中药对脑缺血再灌注脑组织的超微结构影响.解剖学杂志，1998，21(增刊)：157
3.马常升，马文领，戴维国,等.插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究.解剖学杂志,1999，22(3)：209
4.左连富,主编.流式细胞术与生物医学.沈阳：辽宁科学技术出版社，1996.68～73
5.秦百宣，许素贞，钱彦丛，等.水蛭对血清胆固醇、血液粘度及血栓形成的影响.中药材，1994，17(10)：33
6.Li Y，Chopp M，Jiang N，et al.Induction of DNA fragmentation after 10-120 minutes of focal cerebral ischemia in rats.Stroke，1995，26(7)：1252
7.Li Y，Chopp M，Jiang N，et al.Temporal profile of in situ DNA fragmentation after transient middle cerebral artery occlusion in the rat.J Cereb Blood Flow Metab，1995，15(3)：389
8.曹翠丽，马常升，杨天祝，等.缺血再灌注后脑细胞凋亡率的测定.河北医学，2000，6(3)：193
(2000-01-17 收稿), 百拇医药