碘对自身免疫性甲状腺疾病外周血单个核细胞HLA-DR表达的影响
作者：王秀娟 王建春 秦文浩 朱俊
单位：王秀娟 秦文浩(南通医学院附属医院内分泌科，南通226001)；王建春(河北省沧州市中心医院同位素科)；朱俊(南通医学院微生物学教研室)
关键词：外周血单个核细胞；自身免疫性甲状腺疾病；细胞培养；碘；HLA-DR；免疫印迹
南通医学院学院000413 [摘 要] 目的：探讨碘在自身免疫性甲状腺疾病(AITD)发病中的作用及机制。方法：选择具有遗传倾向疾病Graves病一级亲属的外周血单个核细胞(PBMNC)，采用细胞培养和免疫印迹技术，检测NaI对 PBMNC HLA-DR表达的影响。结果：Graves病一级亲属：PBMNC HLA-DR表达量随培养液NaI浓度增加而递增；而对正常无遗传倾向者PBMNC HLA-DR表达量无影响。结论：过多的碘可以上调有遗传倾向者PBMNC HLA-DR表达。
, 百拇医药
[中图分类号] R581.1 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)04-0356-02
THE EFFECT OF IODINE ON AUTOIMMUNE THYROID DISEASE
WANG Xiujuan,1WANG Jianchun，QIN Wenhao,et al
(Department of Endocrinol, Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001;1Division of Isotope Hebei,Cangzhou Central Hospital;2Department of Microbiology,Nantong Medical College)
, 百拇医药
[Abstract] Objective：To investigate the effects and mechanism of iodine on the development of autoimmune thyroid disease.Methods：The peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of the most closed relatives of the patients with Greases’diseases were chosen and cultured respectively in vitro treated with NaI. The HLA-DR expression of PBMNC was detected with Western Blot. Results：The amount of HLA-DR expressive increased with the gradual increase in the concentrations of NaI in the culture medium,while NaI had no effect on HLA-DR expression in subjects without hereditary trend.Conclusion:The excessive iodine may up-regulate HLA-DR expression of PBMNC .
, 百拇医药
[Key words] AITD;PBMNC;culture;iodine;HLA-DR;Western Blot
碘摄入量增加对甲状腺疾病的影响主要表现在自身免疫性甲状腺疾病(AITD)和碘致甲状腺机能亢进(IIT)。 Laurberg早已观察到高碘地区Graves病(GD)的发生率比低碘地区高[1]。Lim,Many等动物实验发现高碘饲养的BB/W鼠甲状腺内网状细胞 MHC-Ⅱ类抗原的表达率明显增加[2，3]。碘不仅抑制cAMP依赖性甲状腺细胞功能，而且刺激甲状腺内免疫成分细胞的活化，使免疫细胞产生细胞因子增加。碘对外周血免疫细胞的影响尚未见到报道。本文在国外学者动物试验的基础上, 选择具有遗传倾向疾病GD患者一级亲属PBMNC,观察NaI对PBMNC HLA-DR表达的影响，试从分子水平揭示过多的碘对甲状腺的免疫损伤及其机制，提供碘诱发AITD的理论依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 病例的选择 选GD患者一级亲属5例(男2例、女3例；年龄25～42岁)做为实验组,健康志愿者5例(男2例、女3例；年龄28～55岁；无遗传性疾病家族史)做为对照组。
1.2 培养方法 取静脉血，肝素抗凝，用D-Hank’s按1∶1比例稀释后缓慢注入盛有淋巴细胞分离液的离心管中，离心(2000r/min)20min，吸出单核细胞层，RPMI-1640洗涤2遍，台盼蓝染色计数，证明活细胞数>95%，用含青、链霉素(各100u/ml)、10%小牛血清的RPMI-1640培养基调细胞浓度为5×106/ml，接种于24孔培养板。培养板置37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度培养箱培养。本实验依NaI浓度分5组：(1)无碘组、(2)NaI 5μg%、(3)NaI 10μg%、(4)NaI 50μg%、(5)NaI 100μg%。PBMNC离体培养48h后吸弃上清液，加入含不同浓度NaI的培养液或单纯培养液继续培养5天,收集各组细胞待做免疫印迹。
, http://www.100md.com
1.3 免疫印迹(Western杂交)检测HLA-DR表达 收集各组细胞，0.01mol/L PBS洗涤细胞3次，估计细胞数量，按107/ml比例加入全细胞裂解液，旋涡混匀后冰浴30min，4℃离心(12500r/min)20min，取上清液，紫外分光光度法测总蛋白浓度。取各组总蛋白及蛋白质分子量标准，加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃煮沸3min，离心(12000r/min)1min，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，在考马斯亮蓝染液中观察蛋白转移情况并标出蛋白质分子量标准，用5%的脱脂牛奶室温包被2h，洗膜后加入鼠抗人HLA-DR单克隆抗体(工作浓度1∶100)，置4℃杂交24h。在度洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(工作浓度1∶100)，室温2h。洗膜后放入现配的DAB显色剂中至出现阳性条带终止反应，所得杂交信号在Image System SX-100图象分析系统进行灰度扫描。
1.4 统计学处理 采用Stata软件对实验结果进行配伍组方差分析。
, 百拇医药
2 结 果
HLA-DR在含有5%β-巯基乙醇的SDS-PAGE中可分解为α、β两条链，分子量分别为34kDa和29kDa。PBMNC经Western杂交后发现在29kDa位置出现阳性条带。采用Image System SX-100图象分析系统对杂交条带进行灰度扫描及方差分析，结果表明：1、2、3、4组表达量随NaI浓度增加而递增，当NaI浓度>50μg%时HLA-DR表达量不再增加。正常对照1～5组表达量无差别。见表1。 表1 Graves病一级亲属PBMNC HLA-DR表达与NaI浓度的关系
分组
NaⅠ浓度
(μg%)
例数
HLA-DR(
±s)
, 百拇医药
GD一级亲属
正常对照
1
2
3
4
5
0
5
10
50
100
5
5
, 百拇医药
5
5
5
1.000±0.000
1.804±0.862
3.396±0.676
6.930±1.735
6.424±1.354
1.000±0.000
1.745±0.648
1.709±0.035
1.281±0.179
, http://www.100md.com
1.186±0.218
注：1与3两两比较差异有显著性(P<0.05)；1、2、3与4、5差别有显著性(P<0.01)。
3 讨 论
AITD的发病机制至今尚未完全明了，近年来的研究发现，本病家族成员患病率明显高于普通人群，同卵双胞胎患病一致率高达20%～50%。AITD的遗传易感性与HLA-Ⅱ基因相关，特别是HLA基因产物HLA-DP、DQ、DR能递呈抗原[4]。其中以HLA-DR研究较多，因其与免疫应答密切相关又称Ia抗原(Immune associated antigen)[5]。HLA-Ⅱ类抗原主要表达在免疫细胞表面，如树突状细胞(Dendritic cell,DC)、单核/巨噬细胞(MO/Mφ)、B淋巴细胞、激活的T淋巴细胞等。
碘是AITD发病的主要环境因素，在AITD发病中的作用越来越受到广大学者的关注。主要的实验工作集中在具有明确AITD遗传倾向的OS鸡、CS鸡、BB/W鼠和Buffalo鼠，碘可以诱发和加重这些动物的实验性甲状腺炎[6] 。BB/W鼠和Buffalo鼠具有RT1b/b基因，存在于主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)，是实验性甲状腺炎的高度敏感基因。高碘饲养的BB/W鼠甲状腺内可见广泛的、局灶性淋巴细胞浸润，它们不同程度地表达MHC-DR抗原。但是同样碘摄入量给予无AITD遗传倾向的Wistar鼠却无甲状腺炎的发生[7]。 Lim[2]等发现碘处理组BB/W鼠甲状腺内网状细胞 MHC-Ⅱ类抗原的表达率明显增加，没有发现MHC-Ⅰ类抗原的表达。Many[3]对具有自身免疫倾向的非肥胖糖尿病鼠进行了研究，发现给予NaI 96天后甲状腺内有弥漫性炎症反应与甲状腺细胞坏死，炎症细胞由MHC-Ⅱ类抗原递呈细胞组成，而给予正常膳食组没有上述改变。国内尚未见到这方面的报道。
, http://www.100md.com
鉴于以上观点，我们试图观察碘对人外周血免疫细胞功能的影响，结果显示在体外培养条件下，NaI可以刺激具有AITD遗传倾向者PBMNC HLA-DR的表达，其表达量与NaI浓度在5～50μg%范围内呈正相关，超过50μg%表达量不再增加。而对无AITD遗传倾向者HLA-DR的表达影响不大，尽管加碘组HLA-DR表达量均高于无碘组，但这种差别无显著性(P>0.05)。HLA-DR表达的增加反应了免疫细胞功能的亢进。这可能是补充碘剂后AITD发病率增加的原因之一。
尽管AITD的发病机制复杂，但确有遗传倾向，本实验提示改变传统的补碘观点，限定补碘人群，在Graves病和其它甲状腺机能亢进症的治疗中严格限制碘盐摄入，可提高该病缓解率，降低复发率。
[参考文献]
[1] Laurberg P. Iodine intake-what are we aiming at?[J]. Endocrinol Metab,1994,79∶17.
, 百拇医药
[2] Li M, Eastman CJ, Boyages SC. Iodine induced lymphocytic thyroiditis in the BB/W rat: early and late immune phenomena[J]. Autoimmunity,1993,14∶181.
[3] Many MC. Two-step development of Hashimoto-like thyroiditis in genetically autoimmune prone non-obese diabetic mice: effects of iodine-induced cell necrosis[J]. J Endocrinol,1995,147∶311.
[4] 童竞亚.医学免疫学与微生物学[M].北京：人民卫生出版社，1994.29.
[5] 倪晓燕.HLA等位基因多态性与自身免疫性甲状腺疾病[J].国外医学内分泌分册，1998,18∶113.
, 百拇医药
[6] Weetman AP, Mcgregor AM. Autoimmune thyroid disease: further developments in our understanding[J]. Endocrine Review. 1994, 15∶788.
[7] Allen EM, Appel MC, Braverman LE. The effect of iodine ingestion on the development of spontaneous lymphocytic thyroditis in the diabetes-prone BB/W rat[J]. Endocrinology, 1986，118∶1977.
(收稿日期：2000-06-26), 百拇医药
单位：王秀娟 秦文浩(南通医学院附属医院内分泌科，南通226001)；王建春(河北省沧州市中心医院同位素科)；朱俊(南通医学院微生物学教研室)
关键词：外周血单个核细胞；自身免疫性甲状腺疾病；细胞培养；碘；HLA-DR；免疫印迹
南通医学院学院000413 [摘 要] 目的：探讨碘在自身免疫性甲状腺疾病(AITD)发病中的作用及机制。方法：选择具有遗传倾向疾病Graves病一级亲属的外周血单个核细胞(PBMNC)，采用细胞培养和免疫印迹技术，检测NaI对 PBMNC HLA-DR表达的影响。结果：Graves病一级亲属：PBMNC HLA-DR表达量随培养液NaI浓度增加而递增；而对正常无遗传倾向者PBMNC HLA-DR表达量无影响。结论：过多的碘可以上调有遗传倾向者PBMNC HLA-DR表达。
, 百拇医药
[中图分类号] R581.1 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)04-0356-02
THE EFFECT OF IODINE ON AUTOIMMUNE THYROID DISEASE
WANG Xiujuan,1WANG Jianchun，QIN Wenhao,et al
(Department of Endocrinol, Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001;1Division of Isotope Hebei,Cangzhou Central Hospital;2Department of Microbiology,Nantong Medical College)
, 百拇医药
[Abstract] Objective：To investigate the effects and mechanism of iodine on the development of autoimmune thyroid disease.Methods：The peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of the most closed relatives of the patients with Greases’diseases were chosen and cultured respectively in vitro treated with NaI. The HLA-DR expression of PBMNC was detected with Western Blot. Results：The amount of HLA-DR expressive increased with the gradual increase in the concentrations of NaI in the culture medium,while NaI had no effect on HLA-DR expression in subjects without hereditary trend.Conclusion:The excessive iodine may up-regulate HLA-DR expression of PBMNC .
, 百拇医药
[Key words] AITD;PBMNC;culture;iodine;HLA-DR;Western Blot
碘摄入量增加对甲状腺疾病的影响主要表现在自身免疫性甲状腺疾病(AITD)和碘致甲状腺机能亢进(IIT)。 Laurberg早已观察到高碘地区Graves病(GD)的发生率比低碘地区高[1]。Lim,Many等动物实验发现高碘饲养的BB/W鼠甲状腺内网状细胞 MHC-Ⅱ类抗原的表达率明显增加[2，3]。碘不仅抑制cAMP依赖性甲状腺细胞功能，而且刺激甲状腺内免疫成分细胞的活化，使免疫细胞产生细胞因子增加。碘对外周血免疫细胞的影响尚未见到报道。本文在国外学者动物试验的基础上, 选择具有遗传倾向疾病GD患者一级亲属PBMNC,观察NaI对PBMNC HLA-DR表达的影响，试从分子水平揭示过多的碘对甲状腺的免疫损伤及其机制，提供碘诱发AITD的理论依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 病例的选择 选GD患者一级亲属5例(男2例、女3例；年龄25～42岁)做为实验组,健康志愿者5例(男2例、女3例；年龄28～55岁；无遗传性疾病家族史)做为对照组。
1.2 培养方法 取静脉血，肝素抗凝，用D-Hank’s按1∶1比例稀释后缓慢注入盛有淋巴细胞分离液的离心管中，离心(2000r/min)20min，吸出单核细胞层，RPMI-1640洗涤2遍，台盼蓝染色计数，证明活细胞数>95%，用含青、链霉素(各100u/ml)、10%小牛血清的RPMI-1640培养基调细胞浓度为5×106/ml，接种于24孔培养板。培养板置37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度培养箱培养。本实验依NaI浓度分5组：(1)无碘组、(2)NaI 5μg%、(3)NaI 10μg%、(4)NaI 50μg%、(5)NaI 100μg%。PBMNC离体培养48h后吸弃上清液，加入含不同浓度NaI的培养液或单纯培养液继续培养5天,收集各组细胞待做免疫印迹。
, http://www.100md.com
1.3 免疫印迹(Western杂交)检测HLA-DR表达 收集各组细胞，0.01mol/L PBS洗涤细胞3次，估计细胞数量，按107/ml比例加入全细胞裂解液，旋涡混匀后冰浴30min，4℃离心(12500r/min)20min，取上清液，紫外分光光度法测总蛋白浓度。取各组总蛋白及蛋白质分子量标准，加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃煮沸3min，离心(12000r/min)1min，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，在考马斯亮蓝染液中观察蛋白转移情况并标出蛋白质分子量标准，用5%的脱脂牛奶室温包被2h，洗膜后加入鼠抗人HLA-DR单克隆抗体(工作浓度1∶100)，置4℃杂交24h。在度洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(工作浓度1∶100)，室温2h。洗膜后放入现配的DAB显色剂中至出现阳性条带终止反应，所得杂交信号在Image System SX-100图象分析系统进行灰度扫描。
1.4 统计学处理 采用Stata软件对实验结果进行配伍组方差分析。
, 百拇医药
2 结 果
HLA-DR在含有5%β-巯基乙醇的SDS-PAGE中可分解为α、β两条链，分子量分别为34kDa和29kDa。PBMNC经Western杂交后发现在29kDa位置出现阳性条带。采用Image System SX-100图象分析系统对杂交条带进行灰度扫描及方差分析，结果表明：1、2、3、4组表达量随NaI浓度增加而递增，当NaI浓度>50μg%时HLA-DR表达量不再增加。正常对照1～5组表达量无差别。见表1。 表1 Graves病一级亲属PBMNC HLA-DR表达与NaI浓度的关系
分组
NaⅠ浓度
(μg%)
例数
HLA-DR(
±s), 百拇医药
GD一级亲属
正常对照
1
2
3
4
5
0
5
10
50
100
5
5
, 百拇医药
5
5
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1.000±0.000
1.804±0.862
3.396±0.676
6.930±1.735
6.424±1.354
1.000±0.000
1.745±0.648
1.709±0.035
1.281±0.179
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1.186±0.218
注：1与3两两比较差异有显著性(P<0.05)；1、2、3与4、5差别有显著性(P<0.01)。
3 讨 论
AITD的发病机制至今尚未完全明了，近年来的研究发现，本病家族成员患病率明显高于普通人群，同卵双胞胎患病一致率高达20%～50%。AITD的遗传易感性与HLA-Ⅱ基因相关，特别是HLA基因产物HLA-DP、DQ、DR能递呈抗原[4]。其中以HLA-DR研究较多，因其与免疫应答密切相关又称Ia抗原(Immune associated antigen)[5]。HLA-Ⅱ类抗原主要表达在免疫细胞表面，如树突状细胞(Dendritic cell,DC)、单核/巨噬细胞(MO/Mφ)、B淋巴细胞、激活的T淋巴细胞等。
碘是AITD发病的主要环境因素，在AITD发病中的作用越来越受到广大学者的关注。主要的实验工作集中在具有明确AITD遗传倾向的OS鸡、CS鸡、BB/W鼠和Buffalo鼠，碘可以诱发和加重这些动物的实验性甲状腺炎[6] 。BB/W鼠和Buffalo鼠具有RT1b/b基因，存在于主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)，是实验性甲状腺炎的高度敏感基因。高碘饲养的BB/W鼠甲状腺内可见广泛的、局灶性淋巴细胞浸润，它们不同程度地表达MHC-DR抗原。但是同样碘摄入量给予无AITD遗传倾向的Wistar鼠却无甲状腺炎的发生[7]。 Lim[2]等发现碘处理组BB/W鼠甲状腺内网状细胞 MHC-Ⅱ类抗原的表达率明显增加，没有发现MHC-Ⅰ类抗原的表达。Many[3]对具有自身免疫倾向的非肥胖糖尿病鼠进行了研究，发现给予NaI 96天后甲状腺内有弥漫性炎症反应与甲状腺细胞坏死，炎症细胞由MHC-Ⅱ类抗原递呈细胞组成，而给予正常膳食组没有上述改变。国内尚未见到这方面的报道。
, http://www.100md.com
鉴于以上观点，我们试图观察碘对人外周血免疫细胞功能的影响，结果显示在体外培养条件下，NaI可以刺激具有AITD遗传倾向者PBMNC HLA-DR的表达，其表达量与NaI浓度在5～50μg%范围内呈正相关，超过50μg%表达量不再增加。而对无AITD遗传倾向者HLA-DR的表达影响不大，尽管加碘组HLA-DR表达量均高于无碘组，但这种差别无显著性(P>0.05)。HLA-DR表达的增加反应了免疫细胞功能的亢进。这可能是补充碘剂后AITD发病率增加的原因之一。
尽管AITD的发病机制复杂，但确有遗传倾向，本实验提示改变传统的补碘观点，限定补碘人群，在Graves病和其它甲状腺机能亢进症的治疗中严格限制碘盐摄入，可提高该病缓解率，降低复发率。
[参考文献]
[1] Laurberg P. Iodine intake-what are we aiming at?[J]. Endocrinol Metab,1994,79∶17.
, 百拇医药
[2] Li M, Eastman CJ, Boyages SC. Iodine induced lymphocytic thyroiditis in the BB/W rat: early and late immune phenomena[J]. Autoimmunity,1993,14∶181.
[3] Many MC. Two-step development of Hashimoto-like thyroiditis in genetically autoimmune prone non-obese diabetic mice: effects of iodine-induced cell necrosis[J]. J Endocrinol,1995,147∶311.
[4] 童竞亚.医学免疫学与微生物学[M].北京：人民卫生出版社，1994.29.
[5] 倪晓燕.HLA等位基因多态性与自身免疫性甲状腺疾病[J].国外医学内分泌分册，1998,18∶113.
, 百拇医药
[6] Weetman AP, Mcgregor AM. Autoimmune thyroid disease: further developments in our understanding[J]. Endocrine Review. 1994, 15∶788.
[7] Allen EM, Appel MC, Braverman LE. The effect of iodine ingestion on the development of spontaneous lymphocytic thyroditis in the diabetes-prone BB/W rat[J]. Endocrinology, 1986，118∶1977.
(收稿日期：2000-06-26), 百拇医药