质粒载体pUC19在头孢哌酮抗性基因(CPZr)克隆中的应用探讨
作者：梁润琴 范昕建 雷秉均
单位：梁润琴(川北医学院附属医院传染科，四川南充 637000)；范昕建 雷秉均(华西医科大学附一院传 染科，成都 610041)
关键词：pUC19；耐药性；β-内酰胺酶；CPZr
川北医学院学报000401 摘要：目的：研究质粒pUC19是否为头孢哌酮抗性基因(CPZr)分子 克隆的理想载体。方法：氯化钙法将质粒pUC19转化至工程菌E.coliDH5获得pUC19转化菌 ；采用试管二倍液体稀释法进行pUC19转化菌对25种抗生素的敏感性测定；鸟枪法克隆耐药 质粒p FC片段到载体pUC19获得含有CPZr的重组质粒。结果：pUC19转化菌对氨苄青霉素高度耐药 (MIC>256μg/ml)，对第一代头孢菌素中度耐药，对第二代头孢菌素中的头孢孟多耐药，而 对头孢呋新敏感，在第三代头孢菌素中只对头孢哌酮耐药(MIC，64μg/ml)，对其他第三代 头孢菌素及β-内酰胺酶抑制剂均高度敏感，同时敏感性测定结果还发现pUC19转化菌对氟 喹诺 酮类和氨基糖甙类抗性素均敏感。pUC19作为载体克隆到含有头孢哌酮抗性基 因(CPZr)的重组 质粒少，克隆效率低，未能达到预期的目标。结论：pUC19不适合作为CPZr的克隆载体。
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中图分类号：R965.2 文献标识 码：A
文章编号：1005-3697(2000)04-0001-03
Application of vector plasmid pUC19 to cloning of cefoperazone resistan ce gene carried on pFC
LIANG Run_qin FAN Xin_jian LEI Bin_jun
(Department of Infectious Disease, Affiliated Hospital of North Sic huan Medical College, Nangchong, Sichuan, 637000, China)
Abstract: E.coliHX88108 strain which demonstrated high level resista nce to cefoperazon (CPZ) was isolated from a severely infected patient in 1988. Five plasmids coexisting in the strain were designated pFC, pFT1, pFT2, pFT3 and pFX, respectively. Four plasmids except pFX conferred CPZ resistance. In order to search an ideal plasmid as the vector in cloning of cefoperazone resistance g ene (CPZr) from resistance plasmid pFC, we studied plasmid pUC19 which is used widely in molecular cloning. pUC19 was transformed into E.coliDH5 prepared usin g calcium chloride. MICs of 25 antibiotics against E.coli pUC19 transformant wer e determined by the broth dilution method with Mueller-Hintion broth, the resul ts showed that pUC19 transformant is resistant to ampicillin, staphcillin, amoxy cillin, cefradine, cefomandole, cefazolin and cefoperazone (MIC, 64μg/ml), but is susceptible to cefuroxime, ceftazidine, ceftriaxone, nofloxacin and aminoglyc osides. This suggests that pUC19 could encode CPZ resistance. Cloning of CPZr from pFC with pUC19 as the vector was performed. The fragments of pFC generated by the partial digestion with Sau3AI were inserted into BamHI site of pUC19 and transformed into E.coliDH5. Seven clones containing CPZr (PFL11, PFL25……) from the transformants selected on SOB agar plates containing 75 μg of ampicill in per ml and 40μg of CPZ per ml. Meanwhile, the results revealed that self-cy cling recombinant DNA pUC19 transformants could grow on the selecting SOB agar p lates. This led to low efficiency of CPZr cloning and trouble in research work . According to pUC19 encoding resistance to CPZ and low efficiency of CPZr clo ning in which pUC19 was selected as the cloning vector, pUC19 is unsuitable for the ideal vector of CPZr cloning.
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Key words: pUC19; resistance; β-lactamase; CPZr
pUC19作为分子克隆中质粒载体的主力军，具有比其他质粒载体如pPBR 322等更完善、有效的优越性[1](分子量小约2.69kb，遗传学图谱上具有ampr 、polylinker及lacz)故应用非常广泛。质粒pUC19缺乏rop基因(与控制拷贝数有关)，其 结果是这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或ColE1)复制起点的质粒高得多，pUC19载体表 达lacz基因产物(β-半乳糖苷酶)的氨基酸片段在相应宿主中可出现α互补，因此可用组 织化学筛选鉴定重组体，同时pUC19遗传基图谱上具有ampr，选择克隆菌落还可用氨苄青 霉素抗性平板作为选择培养基筛选重组质粒。E*coliHX88108系华西医科大学附一院传染科 从 临床上分离到的一株多重耐药大肠杆菌。前期实验表明该菌对头孢哌酮(cefoperazone,CPZ) 等多种抗生素耐药，该菌至少含有5个以上的耐药质粒，其中包括耐药质粒pFC[2] 。本文进行了pUC19转化菌对25种抗生素的敏感性测定，同时以pUC19作为克隆载体进行了质 粒pFC上的头孢哌酮抗性基因(CPZr)的克隆。从分子生物学和抗生素敏感性试验两方面探 讨pUC19是否能在第三代头孢菌素抗性基因克隆中广泛使用。
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1 材料
1.1 抗生素：氨苄青霉素(ampicillin, AMP)，北京中国药品生物制品检定所 ，羟氨苄青霉素(amoxycillin,AMO)，哈尔滨制药二厂；甲氧西林(staphcillin,SPC)，日本 万有制药株式会社；四环素(tetracyclin,TC)；华美生物工程公司；头孢唑啉(cefazlolin ，CEZ)；海口市制药厂；头孢孟多(cefamandole,CMXD)：上海第三制药厂；头孢呋新(cefur oxime，CEX)；英国Glazo公司；头孢哌酮(cefoperazone,CPZ);美国辉瑞公司；头孢噻肟(ce ftaxime,CTX)；德国Hoechesy厂；头孢唑肟(ceftizoxime，CZX)；日本Futismwa pharmaceu tical 公司；头孢曲松(ceftriaxone,CRO);瑞士Roche药平厂；头孢他啶(ceftazidime,CTZ) ；美国Elililly公司；头孢西丁(cefoxitin,CXT);美国Merck SharpsDohme 公司；舒巴坦(s ulbactam,SBT)；哈尔滨制药一厂；优力新(unasyn, sulbactam/ampicillin)；美国辉瑞公 司；奥格门丁(Augmentin, AUG,clavulanic acid/amoxycillin)；华北制药厂；氯霉素(chl oramphenicol ,CM)；江苏金湖制药厂；红霉素(erythromycin,EM);重庆制药六厂；庆大霉 素(gentamicin,GM)；四川长征制药厂；阿米卡星(amikacin,AMK)；齐鲁制药厂；诺氟沙星( nofloxacin，NFLX)；西南制药一厂；环丙沙星(ciprofloxacin,CPLX)及氧氟沙星(ofproflo xacin;OFLX)；均为湖北宜昌制药厂产品。
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1.2 菌株：pFC转化菌和标准质控菌E.coliATCC25922均由华西医科大学感染性疾病实验室 提供；E.coliDH5：四川省肿瘤研究所分子药理室赠送。
1.3 质粒：pFC系E,coliHX88108菌中抽提获得的耐药质粒，由华西医科大学感染性疾病实 验室提供；pUC19；购自华美生物工程公司。
1.4 酶类：限制性内切酶。T4DNA连接酶、溶菌酶和修饰酶等分别购自华美生物工程公 司和美国Promega公司。
1.5 生化试剂：低熔点琼脂糖，十二烷基磺酸钠(SDS)均为美国BRL公司超级纯产品；电泳 琼脂糖(agarose)Promega公司产品。
2 方法
2.1 质粒pUC19的转化：用常规氯化钙转化法将质粒pUC19转化到工程受体菌E .c oliDH5中，转化过程按文献[3]进行操作，在含有AMP75μg/ml的SOB琼脂平皿 上筛选pUC19转化菌，并连续多次传化。
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2.2 25种抗生素对受体菌E.coliDH5、pUC19转化菌的MI C值测定：采 用试管二倍稀释法检测25种抗生素对E.coliDH5、pUC19转化菌的MIC值，以E.coliATCC29 522 作为质控菌，最终接种量为105CFU/ml，按文献[4]进行。判断以1994年NCCLS颁 布的判断标准药物敏感结果。
2.3 鸟枪法克隆头孢哌酮抗性基因(CPZr)：选用具有氨苄青霉素抗性(ampr)的质粒pU C19为克隆载体。在pUC19的polylinker中切开BamHI位点，将耐药质粒pFC用四核苷酸内切酶 Sau3AI(它们都切开GATC)部分消化成1—2kb左右的片断，与pUC19BamHI片段重组， 就可能在含有CPZ的培养平皿上筛选出克隆了CPZr的重组质粒。
, http://www.100md.com 2.3.1 质粒pFC的提取、纯化：参照文献[5]用碱裂解法大量制备pFC，经Sepho rose 4B柱层析纯化。
2.3.2 酶切片断回收、连接、转化：按文献[5]的方法进行，以1.5uSau3AI部 分消化1μg耐药质粒pFC DNA，以1uBamHI消化1μg pUC19DNA，37℃，反应2h，1.2%agarose电泳，EB染色，观察结果，应用低熔点琼脂糖凝胶电泳方法回收 所需片断，pFCSau3AI片断与pUC19BamHI片断重组，两者的摩尔比1∶1；16℃，反应16h ， 以常规氯化钙法将重组DNA转化至工程菌株 E.coliDH5中，在含有AMP(75μg/ml)及CPZ(4 0μg/ml)的SOB培养基琼脂平皿上筛选CPZ抗性转化菌株。
2.3.3 分子量测定：按Meyers 文献[6]方法进行，以λ DNA/PstI作为分子量M arker.
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2.4 含重组质粒的细菌克隆株的鉴定：采用小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析。按文 献[5]碱裂解法抽提质粒。酚：氯仿抽提法纯化质粒。EcoRI、Sall单双酶切重组 质粒HindIII、PvuII双酶消化重组质粒。1.2%agarose电泳，电压2v/cm，4h，EB染色 ，部分照相。
3 结果
3.1 MIC值测定结果：25种抗生素对受体菌E.coliDH5、载体质粒pUC19转 化菌、耐药质粒pFC转化菌MIC值见表1。
从表1结果看出，pUC19转化菌对氨苄青霉素高度耐药，同时对甲氧西林、阿莫 西林、第一代、第二 代头孢菌素(除头孢呋新外)及第三代头孢菌素中的头孢哌酮等均呈现明显耐药，但对其他第 三代头孢菌素敏感，对氨基糖甙类和氟喹诺酮类药物高度敏感；红霉素、四环素对pUC19转 化菌均有良好的抗菌作用。
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3.2 CPZr的克隆结果：鸟枪法克隆PFC片断到pUC19载体在含有CPZ的抗性平板上共得到 约1000个菌落， 随机挑选出300个菌落，提取质粒分析。用EcoRI、Sall 、HindIII、 PvUII单双酶切质粒结 果发现：大多数质粒为pFC质粒和pUC19自身环化质粒或者是含有多个pFC片断的重组质粒， 在3 00个菌落只有7个重组质粒片断为单片断，其编号分别为pFL11、pFL25、pFL33、pFL82、pFL 86、pFL99、pFL102、pFL121，片断分子量大小不一，菌及pFC转化菌的MIC值
表1 25种抗生素对受体菌E.coliDH5、pUC19转化表1 25种抗生素对受体菌E.coliDH5、pUC19转化菌及pFC转化菌的MIC值
Table the MICs of antibiotics For E.coliDH5,E.coliPUC19and E. coli pFC Drugs
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MIC(μg/ml)
E.coliDH5
pUC19
pFC
Cefradine
2
64
64
Cefazolin
1
16
32
Cefmandole
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1
64
32
Cefuroxime
1
4
4
Ceftazidine
0.125
0.25
1
Ceftizoxime
<0.125
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<0.125
<0.125
Cefriaxone
<0.125
<0.125
<0.125
Cefotaxime
0.125
0.25
4
Cefoperazone
0.125
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64
64
Cefoxitin
1
1
2
Norfloxacin
<0.125
<0.125
2
Ofloxacin
<0.125
<0.125
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<0.125
Ciprofloxacin
<0.125
<0.125
<0.125
Ampicillin
1
>256
>256
Staphcillin
2
128
, 百拇医药 512
Amoxycillin
2
64
256
Streptomycin
2
2
52
Gentamicin
<0.125
<0.125
4
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Amikacin
<0.125
<0.125
<0.125
Chloramphenicol
<0.125
<0.125
32
Tetracycline
1
<0.125
8
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Erythromycin
8
1
256
Sulbactam
1
1
256
Unasyn
1
1
8
Augmentin
, 百拇医药
2
8
64
最小片断为1.6kb，最大片断为2.6kb，获得的含有CPZr的重组子为CPZ r定位分析和CPZr性质研究使用。双酶切重组质粒结果见图1、图2。
图1 EcoRI、Sall双酶切重组质粒电泳图
Fig1. Agarose gel eletrophoresis of EcoRI-Sall_digested plasmid DNAs(1. 2%agarose,1×TBE Buffer pH8.5)
1.pFL25 2.pFL33 3.λ DNA/PstI(Marker) 4.pFL82 5.pFL86 6.λ DNA/PstI(Marker) 7.pFL99 8.pFL102 9.pFL121
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图2 HindIII、PvuII双酶切重组质粒电泳图
Fig2. Agarose gel eletrophoresis of HindⅢ__PvuⅡ_digested plasmid DNAs
(1.2%agarose,1×TBE Buffer pH8.5)
1.pFL25 2.pFL33 3.λ DNA/PstI 4.pFL82 5.pFL86 6.λDNA/PstI(Marker) 7.pFL99 8.pFL102 9.pFL121
4 讨论
随着第三代头孢菌素在临床上的广泛使用，感染性疾病病原菌对第三代头孢菌 素的耐药迅速增长，成为今天临床面临的严重治疗问题。其耐药性主要由临床上最重要的两 类β-内酰胺酶引起：一类是由高水平表达的染色体编码的AmpCβ-内酰胺酶、属BushJ-M1 群，分子量测定分类属C群，以在肠杆菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单菌等中存在的由染色体编 码 的组成性高水平表达的AmpCβ-内酰胺酶为代表；二类是质粒编码的TEM或SHV类β-内 酰胺酶，属Bush-J-M2b群，分子量测定分类属A群，主要以存在于大肠埃希氏菌、克雷伯氏 杆菌中的超广β-内酰胺酶(Extended__spectrum β—lactamase,ESBL)为代表 [7]。近年来出现了AmpCβ-内酰胺酶共同随质粒转移的迹象，可以预见在不远的将来 各种编码AmpCβ-内酰胺酶的质粒将在全球范围内流行[8]，因此 进行β-内酰胺酶的分子生物学和调控机理的研究，对于寻找和设计新型抗生素和酶抑制剂 ，以解决临床上细菌耐药性问题具有重要意义。
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头孢哌酮(CPZ)是半合成的第三代头孢菌素，用于治疗各种需氧菌和厌氧菌包括胆道感染具 有良好的疗效。但和其他第三代头孢菌素相比，CPZ对细菌产生的各种β-内酰胺酶不够稳 定。目前有关头孢哌酮抗性株的报道已不少见。为进行E、coliHX88108菌株对头孢哌酮耐 药性的分子机理研究，本实验以质粒pUC19为克隆载体，克隆到存在于耐药质粒pFC上的CPZ 抗性基因(CPZr)，可利用CPZr进行抗性基因转移的分子模式和宿主范围的研究以 及CPZ抗性的分子流行病学调查。
pUC19是目前广泛使用的克隆载体，以氯化钙法进行质粒转化获得pUC19转化菌，MIC 值测定 结果表明pUC19具有对头孢哌酮耐药性，而对其它第三代头孢菌素如：头孢噻肟、头孢曲松 等敏 感。通过文献复习可发现pUC19质粒上的ampr能编码产生一种广谱β-内酰胺酶即TEM-1型 ，[9]TEM-1型酶对头孢噻啶的相对水解率为76，头孢噻啶的相对水解率为20， 而 对头孢噻肟的水解率仅为0.07，头孢他啶水解率为0.01，亚胺配南的水解率更小为<0.0 1，对头孢哌酮的水解率未见 报道。依据抗生素敏感性实验结果及文献资料可以看出，pUC19不适合作为头孢哌酮抗性基 因的克隆载体，因在克隆重组子的筛选过程中，自动环化的pUC19转化菌也可在含CPZ的抗性 平板上生长，获得有效的重组子数量少，克隆效率低，未能达到预期目标，为实验带来不便 。因此，pUC19不适合作为CPZr的克隆载体。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目批准号(39470039)
作者简介：梁润琴(1966-)，女，四川威远县人，主治医师，硕士，主 要从事抗生素耐药菌的分子机理研究。
参考文献：
[1] Yanisch__Perron C, Vieira J, MessingJ. Improved M13 phage cloning vectors and host strains:nucleotide sequences of M13mp18and pUC19 vecto rs. Gene ,1985;33:103.
[2] 刘必刚，包定元，舒熙，等.对一株耐头孢哌酮的大肠杆菌质粒的研究[J ].中国药理学通报，1994，10(3)：184.
[3] Sambrook J, Fritch EF, Maniatis T, et al. Molecular Cloning: a la boratory mannal. 2nd ed. NEW YORK:Cold Spring Habor Laboratory Press ,1989:1.82 ～1.84.
, 百拇医药
[4] Nation Committee for Clincal Laboratory Standards. Methods for dil ution antimicrobial susceptibity tests for bacteria that grow aerobically, 2nd e d. Approved Standard. NCCLS document M7_A3. Nation Committee for Clinical Labora tory Standards. 1994,Villanova ,Pa
[5] Sambrook J, Fritch EF, ManiatisT, et al. Molecular Cloning: a labo ratory mannual, 2nd ed . NEW YORK: Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989:1.38 ～1. 85
[6] Meyers JA, Sanchez D, Elwell LP, et al. Simple agarose gel electrp horetic method for the identification and Characterization of plasmid deoxyribon ucleic acid.J bacteriol, 1976;127(3):1529.
, 百拇医药
[7] Coultons, Francois. Targets for drug design.Prog Med Chem, 1994;31 (2):297
[8] Bauerfeind A, Chong Y.Plasmid__encoded Ampc beta-lactamases: how far have we gone 10 years after the discovery? Yonsei Med J, 1998;39(6):520
[9] Lenfant F, Labia R, Mlasson Mprobing the active site of β__Lactam ase R-TEM1 by informational suppression. Biochem,1990,71(5):495.
(收稿日期： 2000-09-22), 百拇医药
单位：梁润琴(川北医学院附属医院传染科，四川南充 637000)；范昕建 雷秉均(华西医科大学附一院传 染科，成都 610041)
关键词：pUC19；耐药性；β-内酰胺酶；CPZr
川北医学院学报000401 摘要：目的：研究质粒pUC19是否为头孢哌酮抗性基因(CPZr)分子 克隆的理想载体。方法：氯化钙法将质粒pUC19转化至工程菌E.coliDH5获得pUC19转化菌 ；采用试管二倍液体稀释法进行pUC19转化菌对25种抗生素的敏感性测定；鸟枪法克隆耐药 质粒p FC片段到载体pUC19获得含有CPZr的重组质粒。结果：pUC19转化菌对氨苄青霉素高度耐药 (MIC>256μg/ml)，对第一代头孢菌素中度耐药，对第二代头孢菌素中的头孢孟多耐药，而 对头孢呋新敏感，在第三代头孢菌素中只对头孢哌酮耐药(MIC，64μg/ml)，对其他第三代 头孢菌素及β-内酰胺酶抑制剂均高度敏感，同时敏感性测定结果还发现pUC19转化菌对氟 喹诺 酮类和氨基糖甙类抗性素均敏感。pUC19作为载体克隆到含有头孢哌酮抗性基 因(CPZr)的重组 质粒少，克隆效率低，未能达到预期的目标。结论：pUC19不适合作为CPZr的克隆载体。
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中图分类号：R965.2 文献标识 码：A
文章编号：1005-3697(2000)04-0001-03
Application of vector plasmid pUC19 to cloning of cefoperazone resistan ce gene carried on pFC
LIANG Run_qin FAN Xin_jian LEI Bin_jun
(Department of Infectious Disease, Affiliated Hospital of North Sic huan Medical College, Nangchong, Sichuan, 637000, China)
Abstract: E.coliHX88108 strain which demonstrated high level resista nce to cefoperazon (CPZ) was isolated from a severely infected patient in 1988. Five plasmids coexisting in the strain were designated pFC, pFT1, pFT2, pFT3 and pFX, respectively. Four plasmids except pFX conferred CPZ resistance. In order to search an ideal plasmid as the vector in cloning of cefoperazone resistance g ene (CPZr) from resistance plasmid pFC, we studied plasmid pUC19 which is used widely in molecular cloning. pUC19 was transformed into E.coliDH5 prepared usin g calcium chloride. MICs of 25 antibiotics against E.coli pUC19 transformant wer e determined by the broth dilution method with Mueller-Hintion broth, the resul ts showed that pUC19 transformant is resistant to ampicillin, staphcillin, amoxy cillin, cefradine, cefomandole, cefazolin and cefoperazone (MIC, 64μg/ml), but is susceptible to cefuroxime, ceftazidine, ceftriaxone, nofloxacin and aminoglyc osides. This suggests that pUC19 could encode CPZ resistance. Cloning of CPZr from pFC with pUC19 as the vector was performed. The fragments of pFC generated by the partial digestion with Sau3AI were inserted into BamHI site of pUC19 and transformed into E.coliDH5. Seven clones containing CPZr (PFL11, PFL25……) from the transformants selected on SOB agar plates containing 75 μg of ampicill in per ml and 40μg of CPZ per ml. Meanwhile, the results revealed that self-cy cling recombinant DNA pUC19 transformants could grow on the selecting SOB agar p lates. This led to low efficiency of CPZr cloning and trouble in research work . According to pUC19 encoding resistance to CPZ and low efficiency of CPZr clo ning in which pUC19 was selected as the cloning vector, pUC19 is unsuitable for the ideal vector of CPZr cloning.
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Key words: pUC19; resistance; β-lactamase; CPZr
pUC19作为分子克隆中质粒载体的主力军，具有比其他质粒载体如pPBR 322等更完善、有效的优越性[1](分子量小约2.69kb，遗传学图谱上具有ampr 、polylinker及lacz)故应用非常广泛。质粒pUC19缺乏rop基因(与控制拷贝数有关)，其 结果是这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或ColE1)复制起点的质粒高得多，pUC19载体表 达lacz基因产物(β-半乳糖苷酶)的氨基酸片段在相应宿主中可出现α互补，因此可用组 织化学筛选鉴定重组体，同时pUC19遗传基图谱上具有ampr，选择克隆菌落还可用氨苄青 霉素抗性平板作为选择培养基筛选重组质粒。E*coliHX88108系华西医科大学附一院传染科 从 临床上分离到的一株多重耐药大肠杆菌。前期实验表明该菌对头孢哌酮(cefoperazone,CPZ) 等多种抗生素耐药，该菌至少含有5个以上的耐药质粒，其中包括耐药质粒pFC[2] 。本文进行了pUC19转化菌对25种抗生素的敏感性测定，同时以pUC19作为克隆载体进行了质 粒pFC上的头孢哌酮抗性基因(CPZr)的克隆。从分子生物学和抗生素敏感性试验两方面探 讨pUC19是否能在第三代头孢菌素抗性基因克隆中广泛使用。
, http://www.100md.com
1 材料
1.1 抗生素：氨苄青霉素(ampicillin, AMP)，北京中国药品生物制品检定所 ，羟氨苄青霉素(amoxycillin,AMO)，哈尔滨制药二厂；甲氧西林(staphcillin,SPC)，日本 万有制药株式会社；四环素(tetracyclin,TC)；华美生物工程公司；头孢唑啉(cefazlolin ，CEZ)；海口市制药厂；头孢孟多(cefamandole,CMXD)：上海第三制药厂；头孢呋新(cefur oxime，CEX)；英国Glazo公司；头孢哌酮(cefoperazone,CPZ);美国辉瑞公司；头孢噻肟(ce ftaxime,CTX)；德国Hoechesy厂；头孢唑肟(ceftizoxime，CZX)；日本Futismwa pharmaceu tical 公司；头孢曲松(ceftriaxone,CRO);瑞士Roche药平厂；头孢他啶(ceftazidime,CTZ) ；美国Elililly公司；头孢西丁(cefoxitin,CXT);美国Merck SharpsDohme 公司；舒巴坦(s ulbactam,SBT)；哈尔滨制药一厂；优力新(unasyn, sulbactam/ampicillin)；美国辉瑞公 司；奥格门丁(Augmentin, AUG,clavulanic acid/amoxycillin)；华北制药厂；氯霉素(chl oramphenicol ,CM)；江苏金湖制药厂；红霉素(erythromycin,EM);重庆制药六厂；庆大霉 素(gentamicin,GM)；四川长征制药厂；阿米卡星(amikacin,AMK)；齐鲁制药厂；诺氟沙星( nofloxacin，NFLX)；西南制药一厂；环丙沙星(ciprofloxacin,CPLX)及氧氟沙星(ofproflo xacin;OFLX)；均为湖北宜昌制药厂产品。
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1.2 菌株：pFC转化菌和标准质控菌E.coliATCC25922均由华西医科大学感染性疾病实验室 提供；E.coliDH5：四川省肿瘤研究所分子药理室赠送。
1.3 质粒：pFC系E,coliHX88108菌中抽提获得的耐药质粒，由华西医科大学感染性疾病实 验室提供；pUC19；购自华美生物工程公司。
1.4 酶类：限制性内切酶。T4DNA连接酶、溶菌酶和修饰酶等分别购自华美生物工程公 司和美国Promega公司。
1.5 生化试剂：低熔点琼脂糖，十二烷基磺酸钠(SDS)均为美国BRL公司超级纯产品；电泳 琼脂糖(agarose)Promega公司产品。
2 方法
2.1 质粒pUC19的转化：用常规氯化钙转化法将质粒pUC19转化到工程受体菌E .c oliDH5中，转化过程按文献[3]进行操作，在含有AMP75μg/ml的SOB琼脂平皿 上筛选pUC19转化菌，并连续多次传化。
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2.2 25种抗生素对受体菌E.coliDH5、pUC19转化菌的MI C值测定：采 用试管二倍稀释法检测25种抗生素对E.coliDH5、pUC19转化菌的MIC值，以E.coliATCC29 522 作为质控菌，最终接种量为105CFU/ml，按文献[4]进行。判断以1994年NCCLS颁 布的判断标准药物敏感结果。
2.3 鸟枪法克隆头孢哌酮抗性基因(CPZr)：选用具有氨苄青霉素抗性(ampr)的质粒pU C19为克隆载体。在pUC19的polylinker中切开BamHI位点，将耐药质粒pFC用四核苷酸内切酶 Sau3AI(它们都切开GATC)部分消化成1—2kb左右的片断，与pUC19BamHI片段重组， 就可能在含有CPZ的培养平皿上筛选出克隆了CPZr的重组质粒。
, http://www.100md.com 2.3.1 质粒pFC的提取、纯化：参照文献[5]用碱裂解法大量制备pFC，经Sepho rose 4B柱层析纯化。
2.3.2 酶切片断回收、连接、转化：按文献[5]的方法进行，以1.5uSau3AI部 分消化1μg耐药质粒pFC DNA，以1uBamHI消化1μg pUC19DNA，37℃，反应2h，1.2%agarose电泳，EB染色，观察结果，应用低熔点琼脂糖凝胶电泳方法回收 所需片断，pFCSau3AI片断与pUC19BamHI片断重组，两者的摩尔比1∶1；16℃，反应16h ， 以常规氯化钙法将重组DNA转化至工程菌株 E.coliDH5中，在含有AMP(75μg/ml)及CPZ(4 0μg/ml)的SOB培养基琼脂平皿上筛选CPZ抗性转化菌株。
2.3.3 分子量测定：按Meyers 文献[6]方法进行，以λ DNA/PstI作为分子量M arker.
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2.4 含重组质粒的细菌克隆株的鉴定：采用小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析。按文 献[5]碱裂解法抽提质粒。酚：氯仿抽提法纯化质粒。EcoRI、Sall单双酶切重组 质粒HindIII、PvuII双酶消化重组质粒。1.2%agarose电泳，电压2v/cm，4h，EB染色 ，部分照相。
3 结果
3.1 MIC值测定结果：25种抗生素对受体菌E.coliDH5、载体质粒pUC19转 化菌、耐药质粒pFC转化菌MIC值见表1。
从表1结果看出，pUC19转化菌对氨苄青霉素高度耐药，同时对甲氧西林、阿莫 西林、第一代、第二 代头孢菌素(除头孢呋新外)及第三代头孢菌素中的头孢哌酮等均呈现明显耐药，但对其他第 三代头孢菌素敏感，对氨基糖甙类和氟喹诺酮类药物高度敏感；红霉素、四环素对pUC19转 化菌均有良好的抗菌作用。
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3.2 CPZr的克隆结果：鸟枪法克隆PFC片断到pUC19载体在含有CPZ的抗性平板上共得到 约1000个菌落， 随机挑选出300个菌落，提取质粒分析。用EcoRI、Sall 、HindIII、 PvUII单双酶切质粒结 果发现：大多数质粒为pFC质粒和pUC19自身环化质粒或者是含有多个pFC片断的重组质粒， 在3 00个菌落只有7个重组质粒片断为单片断，其编号分别为pFL11、pFL25、pFL33、pFL82、pFL 86、pFL99、pFL102、pFL121，片断分子量大小不一，菌及pFC转化菌的MIC值
表1 25种抗生素对受体菌E.coliDH5、pUC19转化表1 25种抗生素对受体菌E.coliDH5、pUC19转化菌及pFC转化菌的MIC值
Table the MICs of antibiotics For E.coliDH5,E.coliPUC19and E. coli pFC Drugs
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MIC(μg/ml)
E.coliDH5
pUC19
pFC
Cefradine
2
64
64
Cefazolin
1
16
32
Cefmandole
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1
64
32
Cefuroxime
1
4
4
Ceftazidine
0.125
0.25
1
Ceftizoxime
<0.125
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<0.125
<0.125
Cefriaxone
<0.125
<0.125
<0.125
Cefotaxime
0.125
0.25
4
Cefoperazone
0.125
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64
64
Cefoxitin
1
1
2
Norfloxacin
<0.125
<0.125
2
Ofloxacin
<0.125
<0.125
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<0.125
Ciprofloxacin
<0.125
<0.125
<0.125
Ampicillin
1
>256
>256
Staphcillin
2
128
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Amoxycillin
2
64
256
Streptomycin
2
2
52
Gentamicin
<0.125
<0.125
4
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Amikacin
<0.125
<0.125
<0.125
Chloramphenicol
<0.125
<0.125
32
Tetracycline
1
<0.125
8
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Erythromycin
8
1
256
Sulbactam
1
1
256
Unasyn
1
1
8
Augmentin
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2
8
64
最小片断为1.6kb，最大片断为2.6kb，获得的含有CPZr的重组子为CPZ r定位分析和CPZr性质研究使用。双酶切重组质粒结果见图1、图2。
图1 EcoRI、Sall双酶切重组质粒电泳图
Fig1. Agarose gel eletrophoresis of EcoRI-Sall_digested plasmid DNAs(1. 2%agarose,1×TBE Buffer pH8.5)
1.pFL25 2.pFL33 3.λ DNA/PstI(Marker) 4.pFL82 5.pFL86 6.λ DNA/PstI(Marker) 7.pFL99 8.pFL102 9.pFL121
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图2 HindIII、PvuII双酶切重组质粒电泳图
Fig2. Agarose gel eletrophoresis of HindⅢ__PvuⅡ_digested plasmid DNAs
(1.2%agarose,1×TBE Buffer pH8.5)
1.pFL25 2.pFL33 3.λ DNA/PstI 4.pFL82 5.pFL86 6.λDNA/PstI(Marker) 7.pFL99 8.pFL102 9.pFL121
4 讨论
随着第三代头孢菌素在临床上的广泛使用，感染性疾病病原菌对第三代头孢菌 素的耐药迅速增长，成为今天临床面临的严重治疗问题。其耐药性主要由临床上最重要的两 类β-内酰胺酶引起：一类是由高水平表达的染色体编码的AmpCβ-内酰胺酶、属BushJ-M1 群，分子量测定分类属C群，以在肠杆菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单菌等中存在的由染色体编 码 的组成性高水平表达的AmpCβ-内酰胺酶为代表；二类是质粒编码的TEM或SHV类β-内 酰胺酶，属Bush-J-M2b群，分子量测定分类属A群，主要以存在于大肠埃希氏菌、克雷伯氏 杆菌中的超广β-内酰胺酶(Extended__spectrum β—lactamase,ESBL)为代表 [7]。近年来出现了AmpCβ-内酰胺酶共同随质粒转移的迹象，可以预见在不远的将来 各种编码AmpCβ-内酰胺酶的质粒将在全球范围内流行[8]，因此 进行β-内酰胺酶的分子生物学和调控机理的研究，对于寻找和设计新型抗生素和酶抑制剂 ，以解决临床上细菌耐药性问题具有重要意义。
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头孢哌酮(CPZ)是半合成的第三代头孢菌素，用于治疗各种需氧菌和厌氧菌包括胆道感染具 有良好的疗效。但和其他第三代头孢菌素相比，CPZ对细菌产生的各种β-内酰胺酶不够稳 定。目前有关头孢哌酮抗性株的报道已不少见。为进行E、coliHX88108菌株对头孢哌酮耐 药性的分子机理研究，本实验以质粒pUC19为克隆载体，克隆到存在于耐药质粒pFC上的CPZ 抗性基因(CPZr)，可利用CPZr进行抗性基因转移的分子模式和宿主范围的研究以 及CPZ抗性的分子流行病学调查。
pUC19是目前广泛使用的克隆载体，以氯化钙法进行质粒转化获得pUC19转化菌，MIC 值测定 结果表明pUC19具有对头孢哌酮耐药性，而对其它第三代头孢菌素如：头孢噻肟、头孢曲松 等敏 感。通过文献复习可发现pUC19质粒上的ampr能编码产生一种广谱β-内酰胺酶即TEM-1型 ，[9]TEM-1型酶对头孢噻啶的相对水解率为76，头孢噻啶的相对水解率为20， 而 对头孢噻肟的水解率仅为0.07，头孢他啶水解率为0.01，亚胺配南的水解率更小为<0.0 1，对头孢哌酮的水解率未见 报道。依据抗生素敏感性实验结果及文献资料可以看出，pUC19不适合作为头孢哌酮抗性基 因的克隆载体，因在克隆重组子的筛选过程中，自动环化的pUC19转化菌也可在含CPZ的抗性 平板上生长，获得有效的重组子数量少，克隆效率低，未能达到预期目标，为实验带来不便 。因此，pUC19不适合作为CPZr的克隆载体。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目批准号(39470039)
作者简介：梁润琴(1966-)，女，四川威远县人，主治医师，硕士，主 要从事抗生素耐药菌的分子机理研究。
参考文献：
[1] Yanisch__Perron C, Vieira J, MessingJ. Improved M13 phage cloning vectors and host strains:nucleotide sequences of M13mp18and pUC19 vecto rs. Gene ,1985;33:103.
[2] 刘必刚，包定元，舒熙，等.对一株耐头孢哌酮的大肠杆菌质粒的研究[J ].中国药理学通报，1994，10(3)：184.
[3] Sambrook J, Fritch EF, Maniatis T, et al. Molecular Cloning: a la boratory mannal. 2nd ed. NEW YORK:Cold Spring Habor Laboratory Press ,1989:1.82 ～1.84.
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[4] Nation Committee for Clincal Laboratory Standards. Methods for dil ution antimicrobial susceptibity tests for bacteria that grow aerobically, 2nd e d. Approved Standard. NCCLS document M7_A3. Nation Committee for Clinical Labora tory Standards. 1994,Villanova ,Pa
[5] Sambrook J, Fritch EF, ManiatisT, et al. Molecular Cloning: a labo ratory mannual, 2nd ed . NEW YORK: Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989:1.38 ～1. 85
[6] Meyers JA, Sanchez D, Elwell LP, et al. Simple agarose gel electrp horetic method for the identification and Characterization of plasmid deoxyribon ucleic acid.J bacteriol, 1976;127(3):1529.
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[7] Coultons, Francois. Targets for drug design.Prog Med Chem, 1994;31 (2):297
[8] Bauerfeind A, Chong Y.Plasmid__encoded Ampc beta-lactamases: how far have we gone 10 years after the discovery? Yonsei Med J, 1998;39(6):520
[9] Lenfant F, Labia R, Mlasson Mprobing the active site of β__Lactam ase R-TEM1 by informational suppression. Biochem,1990,71(5):495.
(收稿日期： 2000-09-22), 百拇医药