mdm2在骨巨细胞瘤中表达的研究
作者：田英 廖瑛 乔新惠 吴颜辉 周秀田 宋岚
单位：田英 衡阳医学院生化教研室(湖南省衡阳市 421001)；廖瑛 衡阳医学院附属第一医院骨科；乔新惠 衡阳医学院生化教研室(湖南省衡阳市 421001)；吴颜辉 衡阳医学院生化教研室(湖南省衡阳市 421001)；周秀田 衡阳医学院肿瘤研究所；宋岚衡阳医学院生化教研室(湖南省衡阳市 421001)
关键词：mdm2；免疫组织化学；骨巨细胞瘤
中国肿瘤临床000406
摘要 目的：探讨mdm2癌基因蛋白在骨巨细胞瘤(GCT)的表达及与GCT病理分级和临床良恶 性的关系。方法：应用SP免疫组织化学方法检测mdm2在52例GCT(GCT按Jaffe分级：Ⅰ级15例、Ⅱ级25例、Ⅲ级12例)中的表达。结果：18例mdm2表达呈阳性，占34.6%，在Ⅰ～Ⅲ级中 的阳性表达率分别为40.0%、32.0%、33.3%，mdm2阳性表达率在骨巨细胞瘤Ⅰ～Ⅲ级中的 差异无显著性意义(χ2=0.28，P>0.05)。在良性、可疑恶性和恶性中的阳性表达分别为15.0 %、35.3%、60.0%，mdm2阳性表达率在骨巨细胞瘤良恶性中的差异有显著性意义(χ2=7.6 7，P<0.05).结论：mdm2在GCT中的表达与病理分级无关而与其临床良恶性程度有关。
, http://www.100md.com
Expression of mdm2 Protein in Human Giant Cell Tumor of Bone
Tian Ying Liao Ying Qiao Xinhui et al
(Department of Biochemistry, Hengyang Medical College, Hengyang)
Abstract Objective: To investigate the relationship of mdm2 protein overexpression with pathological types and prognosis of human giant cell tumor of bone. Methods: Monoclonal antibodies directed against mdm2 proteins were used to measure the expression of these proteins in the nuclear of cells from the sections of giant cell tumor of bone. Results: Eighteen of 52 tumors expressed mdm2 protein. According to Jaffe's grading the positive percentages of grade Ⅰ , grade Ⅱ and grade Ⅲ giant cell tumors of bone were 40% , 32% and 33.3% respectively. A positive correlation existed between the prognosis and mdm2 protein positivity. However, there was no relationship between mdm2-positive cases and pathological types of the tumor. Conclusion: There was a statistically significant correlation between the expression of mdm2 protein and the prognosis of giant cell tumor of bone (χ2=7.67,P〈0.05). However,there was no statistically significant correlation between the expresion of mdm2 and the pathological types of giant cell tumor of bone(χ2=0.28,,P>0.05)
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Key Words mdm2 Immunohistochemistry Giant cell tumor of bone
1992年Oliner等[1]用小鼠mdm2cDNA为探针，从人的基因文库中筛选到了一个同源基因 ，即人的mdm2基因。在骨肉瘤和软组织肉瘤中mdm2基因扩增已有报道[2,3]，而在骨巨细 胞瘤(GCT)中的表达尚未见报道，我们采用抗mdm2抗体，研究mdm2在GCT中的表达及其与病理 分级和临床良恶性程度的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
52例自1994年3月～1998年10月住院的骨巨细胞瘤患者，年龄18～55岁，平均33.5岁。男 28例，女24例。病理学分级Ⅰ级15例，Ⅱ级25例，Ⅲ级12例。参照谢志光[1]，刘尚礼等[2]的标准，X线表现Ⅰ度19例，Ⅱ度13例，Ⅲ度20例。临床表现轻度24例，中度12例，重度16例。按“三结合分类原则”分为良性20例，可疑恶性17例，恶性15例。
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1.2 试剂
mdm2鼠抗人单克隆抗体，为DAKO公司产品。SP免疫组化试剂盒及DAB染色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。
1.3 免疫组化染色
手术切除肿瘤组织，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚连续切片。标本常规脱蜡至水，PBS(pH=7.4)振洗，过氧化酶阻断剂，37℃，10分钟，PBS振洗，非免疫性动物血清，37℃，5分钟，PBS振洗，加mdm2抗体(1:40)，37℃孵育1小时，PBS振洗后加生物素标记的二抗，37℃，10分钟，PBS振洗，加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液，37℃，10分钟，PBS振洗，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片。
结果判断：根据显色情况分为三级，阴性为无显色和<25%细胞核显色；阳性为26%～50%细胞核显色；强阳性为50%以上的细胞核显色。本组设阳性对照和以PBS代替一抗的阴性对照。
, 百拇医药
1.4 统计学分析
各组间差异进行χ2检验。
2 结果
SP免疫组化结果显示，mdm2蛋白在GCT的单核基质细胞和多核巨细胞中均有阳性表达(附图)，52例GCT标本中，阳性16例，强阳性2例，总阳性率34.6%(18/52)。在GCTⅠ～Ⅲ级中的阳性表达率分别为40.0%、32.0%、33.3%。χ2检验表明，mdm2阳性表达在GCTⅠ～Ⅲ级中的差异无显著性意义(χ2=0.28，P>0.05)。在良性、可疑恶性、恶性中的阳性表达率分别为15.0%、35.3%、60.0%，其阳性表达有显著性意义(χ2=7.67，P<0.05)。
附图 骨巨细胞恶性标本，mdm2在GCT的单核基质细胞
, 百拇医药
和多核巨细胞中均呈阳性表达，呈深棕黄色SP×400
3 讨论
人的mdm2基因定位于染色体12q13-14，编码产物为95KD。mdm2蛋白是一种锌蛋白，正常组织中mdm2蛋白水平很低，在大多数细胞中其半衰期很短(20分钟)[4]，mdm2基因在多种组织类型的肉瘤中有扩增现象。骨巨细胞瘤是一种生长活跃和易复发的潜在恶性肿瘤，其细胞成分复杂，生物学特性多变，Jaffe的三级病理分级方法，在临床上有时与GCT的侵袭性不相一致。mdm2在GCT中的表达尚不清楚，我们运用免疫组化发现，在52例GCT中有18例mdm2蛋白表达呈阳性，在临床恶性程度高的GCT病例中，mdm2的阳性表达率明显增高(χ2=7.67，P<0.05)。mdm2蛋白的表达与GCT病理分级无关而与其临床良恶性程度有相关性。
Carlos报道，在73例成人软组织肉瘤中有11例mdm2基因扩增，在这11例中只有6例mdm2蛋白过表达[5]，表明mdm2蛋白表达的复杂性。mdm2基因在骨肉瘤组织中的扩增常与p53基因失活同时存在[6]或见于转移和复发的骨肉瘤中。据朱全胜等[7]发现，GCT中17号染色体丢失率为60.0%。而抑癌基因p53位于17p13区，我们发现GCT中有mdm2过表达，可能与抑癌基因的丢失或失活有关。
, 百拇医药
已有研究证实，GCT中存在p53[7]和C-myc、C-fos[8]蛋白的过表达，表明GCT的发生可能与多基因的联合改变有关。我们的观察结果表明，癌基因mdm2参与了GCT的发生、发展，并与GCT的临床良恶性程度密切相关，可能在GCT的发展中起重要作用。但mdm2蛋白的过表达对GCT的预后判断是否具有重大的临床意义，有进一步研究的必要。
本文课题受湖南省科委科研基金资助
参考文献
[1]Oliner JD,Kinzler KW,Meltzer PS,et al. Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas. Nature,1992;358:80～3
[2]Leach FS,Tokino T,Meltzer P,et al. p53 mutation and mdm2 amplification in human soft tissue sarcomas. Cancer Res,1993;53:2231～ 4
, 百拇医药
[3]Ladanyi M,Cha C,Lewis R,et al. mdm2 gene amplification in metastatic osteosarcoma. Cancer Res,1993;53:16～8
[4]Olson D,Marechal V,Momand J,et al. Identification and characterization of multiple mdm2 proteins and mdm2 p53 protein complexes. Oncoegne,1993;8:2353～60
[5]Carlos CC,Esther L,Marija D,et al. Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res,1994;54:794～ 9
, 百拇医药
[6]Chen J,Lin J,Levine AJ. Regulation of transcription functions of the p53 tumor suppressor by the mdm2 oncogene. Mol Med,1995;1:142～52
[7]董玉昌,左连富,丁文元,等.骨肉瘤、骨巨细胞瘤p53基因蛋白表达的定量研究.中华骨科 杂志,1996;16(5):324～6
[8]Gamberi G,Benassi MS,Bohling T,et al.Prognostic relevance of C-myc gene expression in giant-cell tumor of bone.J Orthop Res,1998;16(1):1～7
(1999-04-01收稿), 百拇医药
单位：田英 衡阳医学院生化教研室(湖南省衡阳市 421001)；廖瑛 衡阳医学院附属第一医院骨科；乔新惠 衡阳医学院生化教研室(湖南省衡阳市 421001)；吴颜辉 衡阳医学院生化教研室(湖南省衡阳市 421001)；周秀田 衡阳医学院肿瘤研究所；宋岚衡阳医学院生化教研室(湖南省衡阳市 421001)
关键词：mdm2；免疫组织化学；骨巨细胞瘤
中国肿瘤临床000406
摘要 目的：探讨mdm2癌基因蛋白在骨巨细胞瘤(GCT)的表达及与GCT病理分级和临床良恶 性的关系。方法：应用SP免疫组织化学方法检测mdm2在52例GCT(GCT按Jaffe分级：Ⅰ级15例、Ⅱ级25例、Ⅲ级12例)中的表达。结果：18例mdm2表达呈阳性，占34.6%，在Ⅰ～Ⅲ级中 的阳性表达率分别为40.0%、32.0%、33.3%，mdm2阳性表达率在骨巨细胞瘤Ⅰ～Ⅲ级中的 差异无显著性意义(χ2=0.28，P>0.05)。在良性、可疑恶性和恶性中的阳性表达分别为15.0 %、35.3%、60.0%，mdm2阳性表达率在骨巨细胞瘤良恶性中的差异有显著性意义(χ2=7.6 7，P<0.05).结论：mdm2在GCT中的表达与病理分级无关而与其临床良恶性程度有关。
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Expression of mdm2 Protein in Human Giant Cell Tumor of Bone
Tian Ying Liao Ying Qiao Xinhui et al
(Department of Biochemistry, Hengyang Medical College, Hengyang)
Abstract Objective: To investigate the relationship of mdm2 protein overexpression with pathological types and prognosis of human giant cell tumor of bone. Methods: Monoclonal antibodies directed against mdm2 proteins were used to measure the expression of these proteins in the nuclear of cells from the sections of giant cell tumor of bone. Results: Eighteen of 52 tumors expressed mdm2 protein. According to Jaffe's grading the positive percentages of grade Ⅰ , grade Ⅱ and grade Ⅲ giant cell tumors of bone were 40% , 32% and 33.3% respectively. A positive correlation existed between the prognosis and mdm2 protein positivity. However, there was no relationship between mdm2-positive cases and pathological types of the tumor. Conclusion: There was a statistically significant correlation between the expression of mdm2 protein and the prognosis of giant cell tumor of bone (χ2=7.67,P〈0.05). However,there was no statistically significant correlation between the expresion of mdm2 and the pathological types of giant cell tumor of bone(χ2=0.28,,P>0.05)
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Key Words mdm2 Immunohistochemistry Giant cell tumor of bone
1992年Oliner等[1]用小鼠mdm2cDNA为探针，从人的基因文库中筛选到了一个同源基因 ，即人的mdm2基因。在骨肉瘤和软组织肉瘤中mdm2基因扩增已有报道[2,3]，而在骨巨细 胞瘤(GCT)中的表达尚未见报道，我们采用抗mdm2抗体，研究mdm2在GCT中的表达及其与病理 分级和临床良恶性程度的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
52例自1994年3月～1998年10月住院的骨巨细胞瘤患者，年龄18～55岁，平均33.5岁。男 28例，女24例。病理学分级Ⅰ级15例，Ⅱ级25例，Ⅲ级12例。参照谢志光[1]，刘尚礼等[2]的标准，X线表现Ⅰ度19例，Ⅱ度13例，Ⅲ度20例。临床表现轻度24例，中度12例，重度16例。按“三结合分类原则”分为良性20例，可疑恶性17例，恶性15例。
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1.2 试剂
mdm2鼠抗人单克隆抗体，为DAKO公司产品。SP免疫组化试剂盒及DAB染色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。
1.3 免疫组化染色
手术切除肿瘤组织，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚连续切片。标本常规脱蜡至水，PBS(pH=7.4)振洗，过氧化酶阻断剂，37℃，10分钟，PBS振洗，非免疫性动物血清，37℃，5分钟，PBS振洗，加mdm2抗体(1:40)，37℃孵育1小时，PBS振洗后加生物素标记的二抗，37℃，10分钟，PBS振洗，加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液，37℃，10分钟，PBS振洗，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片。
结果判断：根据显色情况分为三级，阴性为无显色和<25%细胞核显色；阳性为26%～50%细胞核显色；强阳性为50%以上的细胞核显色。本组设阳性对照和以PBS代替一抗的阴性对照。
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1.4 统计学分析
各组间差异进行χ2检验。
2 结果
SP免疫组化结果显示，mdm2蛋白在GCT的单核基质细胞和多核巨细胞中均有阳性表达(附图)，52例GCT标本中，阳性16例，强阳性2例，总阳性率34.6%(18/52)。在GCTⅠ～Ⅲ级中的阳性表达率分别为40.0%、32.0%、33.3%。χ2检验表明，mdm2阳性表达在GCTⅠ～Ⅲ级中的差异无显著性意义(χ2=0.28，P>0.05)。在良性、可疑恶性、恶性中的阳性表达率分别为15.0%、35.3%、60.0%，其阳性表达有显著性意义(χ2=7.67，P<0.05)。
附图 骨巨细胞恶性标本，mdm2在GCT的单核基质细胞
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和多核巨细胞中均呈阳性表达，呈深棕黄色SP×400
3 讨论
人的mdm2基因定位于染色体12q13-14，编码产物为95KD。mdm2蛋白是一种锌蛋白，正常组织中mdm2蛋白水平很低，在大多数细胞中其半衰期很短(20分钟)[4]，mdm2基因在多种组织类型的肉瘤中有扩增现象。骨巨细胞瘤是一种生长活跃和易复发的潜在恶性肿瘤，其细胞成分复杂，生物学特性多变，Jaffe的三级病理分级方法，在临床上有时与GCT的侵袭性不相一致。mdm2在GCT中的表达尚不清楚，我们运用免疫组化发现，在52例GCT中有18例mdm2蛋白表达呈阳性，在临床恶性程度高的GCT病例中，mdm2的阳性表达率明显增高(χ2=7.67，P<0.05)。mdm2蛋白的表达与GCT病理分级无关而与其临床良恶性程度有相关性。
Carlos报道，在73例成人软组织肉瘤中有11例mdm2基因扩增，在这11例中只有6例mdm2蛋白过表达[5]，表明mdm2蛋白表达的复杂性。mdm2基因在骨肉瘤组织中的扩增常与p53基因失活同时存在[6]或见于转移和复发的骨肉瘤中。据朱全胜等[7]发现，GCT中17号染色体丢失率为60.0%。而抑癌基因p53位于17p13区，我们发现GCT中有mdm2过表达，可能与抑癌基因的丢失或失活有关。
, 百拇医药
已有研究证实，GCT中存在p53[7]和C-myc、C-fos[8]蛋白的过表达，表明GCT的发生可能与多基因的联合改变有关。我们的观察结果表明，癌基因mdm2参与了GCT的发生、发展，并与GCT的临床良恶性程度密切相关，可能在GCT的发展中起重要作用。但mdm2蛋白的过表达对GCT的预后判断是否具有重大的临床意义，有进一步研究的必要。
本文课题受湖南省科委科研基金资助
参考文献
[1]Oliner JD,Kinzler KW,Meltzer PS,et al. Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas. Nature,1992;358:80～3
[2]Leach FS,Tokino T,Meltzer P,et al. p53 mutation and mdm2 amplification in human soft tissue sarcomas. Cancer Res,1993;53:2231～ 4
, 百拇医药
[3]Ladanyi M,Cha C,Lewis R,et al. mdm2 gene amplification in metastatic osteosarcoma. Cancer Res,1993;53:16～8
[4]Olson D,Marechal V,Momand J,et al. Identification and characterization of multiple mdm2 proteins and mdm2 p53 protein complexes. Oncoegne,1993;8:2353～60
[5]Carlos CC,Esther L,Marija D,et al. Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res,1994;54:794～ 9
, 百拇医药
[6]Chen J,Lin J,Levine AJ. Regulation of transcription functions of the p53 tumor suppressor by the mdm2 oncogene. Mol Med,1995;1:142～52
[7]董玉昌,左连富,丁文元,等.骨肉瘤、骨巨细胞瘤p53基因蛋白表达的定量研究.中华骨科 杂志,1996;16(5):324～6
[8]Gamberi G,Benassi MS,Bohling T,et al.Prognostic relevance of C-myc gene expression in giant-cell tumor of bone.J Orthop Res,1998;16(1):1～7
(1999-04-01收稿), 百拇医药