鸽粪中新生隐球菌的分离和鉴定
作者：李莉 王家春 章强强 王家俊
单位：王家春(福建泉州市皮肤病防治医院，福建泉州362000)；章强强 王家俊 李莉(上海华山医院皮肤科真菌室，上海200040)
关键词：新生隐球菌；新生变种；血清型；鸽粪
临床皮肤科杂志000403
摘要：采用GAEC培养基培养了144份私人和公共养鸽场所的鸽粪标本，从中共分离得32株
新生隐球菌，阳性率达22.2%。37℃生长良好。尿素试验均为阳性。血清因子分型结果证
实阳性标本均为新生隐球菌新生变种，全是A血清型，动物接种后能重新分离出该菌。
病理证实具致病性。
, 百拇医药
中图分类号：R379.5文献标识码：A文章编号：1000-4963(2000)04
Isolation and identification of Cryptococcus neoformans from pigeon dropping
LI Li,ZHANG Qiang qiang,WANG Jia jun
(Department of Dermatology, Huashan Hospital,Shanghai Medical University, Shanghai 200040,China)
WANG Jia chun
(Quanzhou Institute of Dermatology,Quanzhou 362000,China)
, 百拇医药
Abstract: 32 Cryptococcus neoformans strains were isolated from 144 samples of pigeon droppings in private and public square pigeon shelters in Shanghai on GAEC. The positive isolation rate was 22.2% (32/144). All strains are Cry. neoformans
var. neoformans and serotype A identified by Crypto. Cheek Kit(Iatron laboratories Inc Tokyo, Japan). Also, Christensen's Urea testes were all positive. Mice were inoculated by two strains in abdomen and same strains can be isolated again. All
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strains can grow well at 37℃ . All above showed that these strains have pathogenicity.
Key Words: Crytococcus neoformans; Pigeon droppings;Cryptococcus neoformans var.neoformans;Serotype
新生隐球菌是一种广泛存在于自然环境中的条件致病菌，可从水果、蔬菜、土壤、按树花和各种鸟类排泄物中分离出[1,2],其中以从鸽粪中分离出的新生隐球菌被认为是人类感染的最重要来源。可侵犯人体诸多组织和器官，引起严重的隐球菌病，死亡率高达18-37%[3]。近年来该病的发病率呈明显上升趋势，尤在AIDS病人中，高达30%。为了解和分析上海鸽粪中新生隐球菌的带菌情况，正确评估鸽粪和隐球菌病的疾系，有效避免由鸽粪污染引起隐球菌病的潜在危险，控制和预防隐球菌的流行和发生。我们对从上海地区广场鸽棚和私人寓所鸽硼中收集的144份鸽粪标本进行了新生隐球菌的分离和鉴定，现总结如下。
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1 材料与方法
1.1 鸽粪中新生隐球菌的分离
1.1.1 标本来源：上海地区私人寓所鸽棚中的鸽粪标本18份，广场鸽棚中的鸽粪标本126份，共计144份。
1.1.2 培养期：(1)CGEC(Guizatia abyssinica extract-creatinine)培养期：将15.0gGuizatia abyssinica磨碎，加适量蒸馏水煮沸1h，粗纱布滤于三角烧瓶中，分别加入蒸馏水300mL，葡萄糖0.3g、KH2PO40.3g、琼脂6.0g、肌酐0.3g、氯霉素0.3g、联苯0.3g，加热溶解后用蒸馏水定容至1000mL，调整pH值至6.5，高压灭菌。冷却至50℃时浇入直径为7cm的平皿中，每平皿约15mL培养基，冷却凝固后置4℃冰箱备用。(2)咖啡酸米粉培养其：米粉10.0g，加蒸馏水1000mL煮沸溶解，再加入琼脂20.0g、吐温8010mL、咖啡酸0.3g、联苯1.0g、氯霉素1.0g，充分溶解后高压灭菌，分装方法同GAEC培养基。
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1.1.3 标本(鸽粪)的处理：将采集的标本分置于无菌瓶中带回实验室，每份标本取1.0g，加入10mL无菌生理盐水，充分震荡混匀，溶解后静止15min，使之沉淀。
1.1.4 培养分离：吸取0.5mL上清液接种于GAEC培养基上27℃孵育2周，每3日观察1次，若发现培养基上有棕褐色菌落生长，在显著镜下见厚壁、圆形带有清晰荚膜的孢子，可确定是新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)。桃取单个菌落接种于咖啡酸米粉培养基上进行分离纯化。
1.2 动物接种
选健康的清洁级昆明种小白鼠12只，雄性，体重18～20g。将从鸽粪中分离纯化的新生隐球菌用无菌生理盐水制成浓度为106/mL的菌悬液，每只小鼠腹腔内接种0.5mL菌液。以从临床脑脊液中分离的致病性新生隐球菌(HS18450)作为阳性对照。接种15天后解剖一组(实验和对照鼠各1只)，以后每隔3天解剖一组，取其心、肝、肾、脑、肠、肺、血做直接镜检，组织在咖啡米粉培养基上27℃培养2周，同时做组织病理，培养阳性菌落进行菌种鉴定。
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1.3 尿素酶试验
1.3.1 尿素琼脂培养基(Christensen's urea agar)：葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，蛋白胨1.0g，NaCl5.0g，KH2PO42.0g，酚红0.012g，蒸馏水定容至1000mL，高压灭菌。冷却至50℃时，每450mL培养基中加入抽滤灭菌的20%尿素溶液50mL，混匀后分装试管置斜面，凝固后置4℃冰箱备用。
1.3.2 方法：以标准菌株新生隐球菌ATCC32609作为阳性对照，白念珠菌ATCC76615∶09作为阴性对照，将分离纯化后的待检菌接种于尿素琼脂培养基，于27℃培养，每天观察培养基颜色变化，共7天。培养基呈粉红或桃红色为阳性，说明该菌能产生尿素酶，否则为阴性。
1.4 血清分型
1.4.1 主要试剂：隐球菌因子血清分型试剂盒(Crypto Check Itron Lab.Tokyo,Japan)
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1.4.2 方法：将分离纯化后的受试菌分两管接种于含0.05mg/mL氯霉素的沙氏培养基，一管置37℃培养，做生长试验，另一管置27℃培养，做玻片凝集试验。根据与不同因子血清(隐球菌荚膜多糖单克隆抗体)产生的凝集结果进行血清分型。
2 结果
2.1 分离结果
人寓所鸽棚中的18份鸽粪标本全部分离出新生隐球菌，阳性率100%。广场鸽鸽棚中126份标本有14株阳性，阳性率11.1%。总阳性数32，总阳性率22.2%。
2.2 动物接种结果
12只小白鼠至解剖时均存活。解剖后除血外，肝、肾、心、肺、肠、脑组织直接镜检墨汁涂片见厚壁、圆形直径约2.5～20μm、荚膜较薄的新生隐球菌。这些标本在咖啡酸米粉培养基上培养5天后有棕褐色菌落生长，桃取菌落做墨汁涂片的结果与直接镜检所见相同，均为阳性。肠、肺、脑病理切片糖原(PAS)染色见红色圆形厚壁的隐球菌，为新生隐球菌的组织相。
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2.3 尿素酶试验
所有受试菌与阳性对照菌在尿素培养基上培养72h后培养管上部开始出现桃红色色素，至第7日全管培养基均变为桃红色，阴性对照管始终未变色，未发现尿素酶阴性菌株。
2.4 血清型鉴定结果
所有菌株均能在37℃生长，玻片凝集试验显示所有菌株与1号和2号因子血清凝集，鉴定为血清A型。
3 讨论
本次调查显示鸽粪中新生隐球菌的阳性率是22.2%(32/144)，低于国内鸽粪中新生隐球菌带菌率为52%～76%的报道[4]，这可能与采集场所、标本量、地区、气候和分离方法等有关；与丹麦、墨西哥、埃及等的报道相近，高于英国、印度、巴西，低于比利时、美国、意大利[5～9]。
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另外，调查结果显示私人寓所鸽棚中鸽粪的带菌率明显高于广场鸽鸽粪的带菌素。我们在采集标本时发现私人寓所鸽棚与广场鸽鸽棚相比，前者较小，更拥挤，通风更为不良，鸽棚中地面和笼子中堆积的鸽粪也更厚，这些条件可能为新生隐球菌在鸽粪中生长繁殖提供了更为适宜的条件。
所分离出的阳性菌株经动物膜腔接种后，能在肺、脑等组织中重新分离出新生隐球菌，且37℃培养生长良好，证明从鸽粪中分离所得的新生隐球菌具有致病性。当人体免疫功能低下时，这些新生隐球菌能通过呼吸或其他途径侵入人体，引起隐球菌病。
新生隐球菌根据其生物学特性和荚膜多糖抗原成份分为两个变种五种血清型：新生变种(var.neoformans，血清型1、D和AD)和格特变种(var.gattii，血清型B、C)，不同变种及血清型在导致感染方面有一定的地域性分布[10,11]。本次分离所得阳性菌株的血清型均为A型，与国内报道的结果一致[4]，也一美国、丹麦、意大利、泰国、日本等国从环境中分离出的新生隐球菌血清型分布相同[8]，但澳大利亚环境中分离出的新生隐球菌以血清B型为主，占67.7%，与该国按树的分布广泛有关[11]。
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国内报道从临床分离的新生隐球菌83%～89%为新生变种，17%～19%为格特变种[4]，我国致病性隐球菌血清型分布的特点是：以A型为主，D型少见，有少量的AD型，缺乏C型[12,13]，但从鸽粪中分离所得的新生隐球菌全部是新生变种，目前仍不清楚引起临床感染的格特变种的可能来源，需进一步调查。新生隐球菌格特变种是按树的寄生菌，属致病菌，有文献报道，由格特变种所致隐球菌病的发病率和地区分布与按树尤其是赤桉杩和细叶树的种植和分布密切关系[11]。澳大利亚桉树在世界范围内广泛引种，包括中国在内，因此，对于我国引起临床感染的格特变种与桉树或其它自然环境的关系需进一步调查，从而有可能彻底预防隐球菌感染的发生。
参考文献：
[1] Ellis DH, Pfeiffer JT. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. gattii[J]. J Clin Microbiol, 1990, 28(7):1642～1644.
, 百拇医药
[2] Pfeiffer JT, Ellis DH. Environmental isolation of cryptococcus neoformans var. gattii from Eucalyptis tereticornis[J]. J Med Vet Mycol, 1992,309(5):407～ 408.
[3] 张宏.新型隐球菌的研究进展[J].国外医学微生物学分册，1990，13(6)：265～267.
[4]吴绍熙.展望21世纪的医学真菌学[J].中华皮肤科杂志，1995，28(6)：358～360.
[5] Castanon Olivares LR, Lopez Martinez R. Isolation of Cryptococcus neoformans from pigeon(Columbalivia)droppings in Mexico City[J]. Mycoses, 1994,37(9):325～ 327.
, 百拇医药
[6] Lazera MS, Wanke B, Nishikawa MM,et al. Isolation of both varieties of Cryptococcus neoformans from saprophytic sources in the city of Rio de Janeiro[J]. Braz. J Med Vet Mycol, 1993,31(6):449～ 454.
[7] Criseo G, Gallo M, Serotyping of Cryptococcus neoformans isolation from environmental and clinical sources in extreme southern Italy[J]. Mycoses, 1997,40(3):95～ 100.
[8] Refai M, Taha M, Selim SA, et al. Isolation of Cryptococcus neoformans, Candida albicans and other yeasts from pigeon droppings in Egypt[J]. Sabourandia, 1983,21(2):163～ 165.
, 百拇医药
[9] Bottone EJ, Kirschner PA, Salkin IF. Isolation of highly encapsulated Cryptococcus neoformans serotype B From a patient in New York city[J]. J Clin Microbiol, 1986,23(1):186～ 188.
[10] Ellis DH. Cryptococcus neoformans var. gattii in Australia[J]. J Clin Microbiol, 1987,25(2):430～ 431.
[11] Pfeiffei JT, Ellis DH. Serotypes of Australian environmental and clinical isolates of cryptococcus neoformans[J]. J Med Vet Mycol, 1983,31(5):401～ 404.
[12]吴绍熙，郭宁如，刘维达，等.新生隐球菌的生态学、流行病学、分子生物学及临床
研究[J].真菌学报，1996，15(2)：114～120.
[13]李竹清，邵经政，廖万清，等.中国致病性新型隐球菌血清型的研究[J].中华医学检验
杂志，1987，10(6)：350～352.
收稿日期：1999-08-28；修回日期：2000-01-28, 百拇医药
单位：王家春(福建泉州市皮肤病防治医院，福建泉州362000)；章强强 王家俊 李莉(上海华山医院皮肤科真菌室，上海200040)
关键词：新生隐球菌；新生变种；血清型；鸽粪
临床皮肤科杂志000403
摘要：采用GAEC培养基培养了144份私人和公共养鸽场所的鸽粪标本，从中共分离得32株
新生隐球菌，阳性率达22.2%。37℃生长良好。尿素试验均为阳性。血清因子分型结果证
实阳性标本均为新生隐球菌新生变种，全是A血清型，动物接种后能重新分离出该菌。
病理证实具致病性。
, 百拇医药
中图分类号：R379.5文献标识码：A文章编号：1000-4963(2000)04
Isolation and identification of Cryptococcus neoformans from pigeon dropping
LI Li,ZHANG Qiang qiang,WANG Jia jun
(Department of Dermatology, Huashan Hospital,Shanghai Medical University, Shanghai 200040,China)
WANG Jia chun
(Quanzhou Institute of Dermatology,Quanzhou 362000,China)
, 百拇医药
Abstract: 32 Cryptococcus neoformans strains were isolated from 144 samples of pigeon droppings in private and public square pigeon shelters in Shanghai on GAEC. The positive isolation rate was 22.2% (32/144). All strains are Cry. neoformans
var. neoformans and serotype A identified by Crypto. Cheek Kit(Iatron laboratories Inc Tokyo, Japan). Also, Christensen's Urea testes were all positive. Mice were inoculated by two strains in abdomen and same strains can be isolated again. All
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strains can grow well at 37℃ . All above showed that these strains have pathogenicity.
Key Words: Crytococcus neoformans; Pigeon droppings;Cryptococcus neoformans var.neoformans;Serotype
新生隐球菌是一种广泛存在于自然环境中的条件致病菌，可从水果、蔬菜、土壤、按树花和各种鸟类排泄物中分离出[1,2],其中以从鸽粪中分离出的新生隐球菌被认为是人类感染的最重要来源。可侵犯人体诸多组织和器官，引起严重的隐球菌病，死亡率高达18-37%[3]。近年来该病的发病率呈明显上升趋势，尤在AIDS病人中，高达30%。为了解和分析上海鸽粪中新生隐球菌的带菌情况，正确评估鸽粪和隐球菌病的疾系，有效避免由鸽粪污染引起隐球菌病的潜在危险，控制和预防隐球菌的流行和发生。我们对从上海地区广场鸽棚和私人寓所鸽硼中收集的144份鸽粪标本进行了新生隐球菌的分离和鉴定，现总结如下。
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1 材料与方法
1.1 鸽粪中新生隐球菌的分离
1.1.1 标本来源：上海地区私人寓所鸽棚中的鸽粪标本18份，广场鸽棚中的鸽粪标本126份，共计144份。
1.1.2 培养期：(1)CGEC(Guizatia abyssinica extract-creatinine)培养期：将15.0gGuizatia abyssinica磨碎，加适量蒸馏水煮沸1h，粗纱布滤于三角烧瓶中，分别加入蒸馏水300mL，葡萄糖0.3g、KH2PO40.3g、琼脂6.0g、肌酐0.3g、氯霉素0.3g、联苯0.3g，加热溶解后用蒸馏水定容至1000mL，调整pH值至6.5，高压灭菌。冷却至50℃时浇入直径为7cm的平皿中，每平皿约15mL培养基，冷却凝固后置4℃冰箱备用。(2)咖啡酸米粉培养其：米粉10.0g，加蒸馏水1000mL煮沸溶解，再加入琼脂20.0g、吐温8010mL、咖啡酸0.3g、联苯1.0g、氯霉素1.0g，充分溶解后高压灭菌，分装方法同GAEC培养基。
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1.1.3 标本(鸽粪)的处理：将采集的标本分置于无菌瓶中带回实验室，每份标本取1.0g，加入10mL无菌生理盐水，充分震荡混匀，溶解后静止15min，使之沉淀。
1.1.4 培养分离：吸取0.5mL上清液接种于GAEC培养基上27℃孵育2周，每3日观察1次，若发现培养基上有棕褐色菌落生长，在显著镜下见厚壁、圆形带有清晰荚膜的孢子，可确定是新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)。桃取单个菌落接种于咖啡酸米粉培养基上进行分离纯化。
1.2 动物接种
选健康的清洁级昆明种小白鼠12只，雄性，体重18～20g。将从鸽粪中分离纯化的新生隐球菌用无菌生理盐水制成浓度为106/mL的菌悬液，每只小鼠腹腔内接种0.5mL菌液。以从临床脑脊液中分离的致病性新生隐球菌(HS18450)作为阳性对照。接种15天后解剖一组(实验和对照鼠各1只)，以后每隔3天解剖一组，取其心、肝、肾、脑、肠、肺、血做直接镜检，组织在咖啡米粉培养基上27℃培养2周，同时做组织病理，培养阳性菌落进行菌种鉴定。
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1.3 尿素酶试验
1.3.1 尿素琼脂培养基(Christensen's urea agar)：葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，蛋白胨1.0g，NaCl5.0g，KH2PO42.0g，酚红0.012g，蒸馏水定容至1000mL，高压灭菌。冷却至50℃时，每450mL培养基中加入抽滤灭菌的20%尿素溶液50mL，混匀后分装试管置斜面，凝固后置4℃冰箱备用。
1.3.2 方法：以标准菌株新生隐球菌ATCC32609作为阳性对照，白念珠菌ATCC76615∶09作为阴性对照，将分离纯化后的待检菌接种于尿素琼脂培养基，于27℃培养，每天观察培养基颜色变化，共7天。培养基呈粉红或桃红色为阳性，说明该菌能产生尿素酶，否则为阴性。
1.4 血清分型
1.4.1 主要试剂：隐球菌因子血清分型试剂盒(Crypto Check Itron Lab.Tokyo,Japan)
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1.4.2 方法：将分离纯化后的受试菌分两管接种于含0.05mg/mL氯霉素的沙氏培养基，一管置37℃培养，做生长试验，另一管置27℃培养，做玻片凝集试验。根据与不同因子血清(隐球菌荚膜多糖单克隆抗体)产生的凝集结果进行血清分型。
2 结果
2.1 分离结果
人寓所鸽棚中的18份鸽粪标本全部分离出新生隐球菌，阳性率100%。广场鸽鸽棚中126份标本有14株阳性，阳性率11.1%。总阳性数32，总阳性率22.2%。
2.2 动物接种结果
12只小白鼠至解剖时均存活。解剖后除血外，肝、肾、心、肺、肠、脑组织直接镜检墨汁涂片见厚壁、圆形直径约2.5～20μm、荚膜较薄的新生隐球菌。这些标本在咖啡酸米粉培养基上培养5天后有棕褐色菌落生长，桃取菌落做墨汁涂片的结果与直接镜检所见相同，均为阳性。肠、肺、脑病理切片糖原(PAS)染色见红色圆形厚壁的隐球菌，为新生隐球菌的组织相。
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2.3 尿素酶试验
所有受试菌与阳性对照菌在尿素培养基上培养72h后培养管上部开始出现桃红色色素，至第7日全管培养基均变为桃红色，阴性对照管始终未变色，未发现尿素酶阴性菌株。
2.4 血清型鉴定结果
所有菌株均能在37℃生长，玻片凝集试验显示所有菌株与1号和2号因子血清凝集，鉴定为血清A型。
3 讨论
本次调查显示鸽粪中新生隐球菌的阳性率是22.2%(32/144)，低于国内鸽粪中新生隐球菌带菌率为52%～76%的报道[4]，这可能与采集场所、标本量、地区、气候和分离方法等有关；与丹麦、墨西哥、埃及等的报道相近，高于英国、印度、巴西，低于比利时、美国、意大利[5～9]。
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另外，调查结果显示私人寓所鸽棚中鸽粪的带菌率明显高于广场鸽鸽粪的带菌素。我们在采集标本时发现私人寓所鸽棚与广场鸽鸽棚相比，前者较小，更拥挤，通风更为不良，鸽棚中地面和笼子中堆积的鸽粪也更厚，这些条件可能为新生隐球菌在鸽粪中生长繁殖提供了更为适宜的条件。
所分离出的阳性菌株经动物膜腔接种后，能在肺、脑等组织中重新分离出新生隐球菌，且37℃培养生长良好，证明从鸽粪中分离所得的新生隐球菌具有致病性。当人体免疫功能低下时，这些新生隐球菌能通过呼吸或其他途径侵入人体，引起隐球菌病。
新生隐球菌根据其生物学特性和荚膜多糖抗原成份分为两个变种五种血清型：新生变种(var.neoformans，血清型1、D和AD)和格特变种(var.gattii，血清型B、C)，不同变种及血清型在导致感染方面有一定的地域性分布[10,11]。本次分离所得阳性菌株的血清型均为A型，与国内报道的结果一致[4]，也一美国、丹麦、意大利、泰国、日本等国从环境中分离出的新生隐球菌血清型分布相同[8]，但澳大利亚环境中分离出的新生隐球菌以血清B型为主，占67.7%，与该国按树的分布广泛有关[11]。
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国内报道从临床分离的新生隐球菌83%～89%为新生变种，17%～19%为格特变种[4]，我国致病性隐球菌血清型分布的特点是：以A型为主，D型少见，有少量的AD型，缺乏C型[12,13]，但从鸽粪中分离所得的新生隐球菌全部是新生变种，目前仍不清楚引起临床感染的格特变种的可能来源，需进一步调查。新生隐球菌格特变种是按树的寄生菌，属致病菌，有文献报道，由格特变种所致隐球菌病的发病率和地区分布与按树尤其是赤桉杩和细叶树的种植和分布密切关系[11]。澳大利亚桉树在世界范围内广泛引种，包括中国在内，因此，对于我国引起临床感染的格特变种与桉树或其它自然环境的关系需进一步调查，从而有可能彻底预防隐球菌感染的发生。
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[1] Ellis DH, Pfeiffer JT. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. gattii[J]. J Clin Microbiol, 1990, 28(7):1642～1644.
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[2] Pfeiffer JT, Ellis DH. Environmental isolation of cryptococcus neoformans var. gattii from Eucalyptis tereticornis[J]. J Med Vet Mycol, 1992,309(5):407～ 408.
[3] 张宏.新型隐球菌的研究进展[J].国外医学微生物学分册，1990，13(6)：265～267.
[4]吴绍熙.展望21世纪的医学真菌学[J].中华皮肤科杂志，1995，28(6)：358～360.
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[7] Criseo G, Gallo M, Serotyping of Cryptococcus neoformans isolation from environmental and clinical sources in extreme southern Italy[J]. Mycoses, 1997,40(3):95～ 100.
[8] Refai M, Taha M, Selim SA, et al. Isolation of Cryptococcus neoformans, Candida albicans and other yeasts from pigeon droppings in Egypt[J]. Sabourandia, 1983,21(2):163～ 165.
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[10] Ellis DH. Cryptococcus neoformans var. gattii in Australia[J]. J Clin Microbiol, 1987,25(2):430～ 431.
[11] Pfeiffei JT, Ellis DH. Serotypes of Australian environmental and clinical isolates of cryptococcus neoformans[J]. J Med Vet Mycol, 1983,31(5):401～ 404.
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研究[J].真菌学报，1996，15(2)：114～120.
[13]李竹清，邵经政，廖万清，等.中国致病性新型隐球菌血清型的研究[J].中华医学检验
杂志，1987，10(6)：350～352.
收稿日期：1999-08-28；修回日期：2000-01-28, 百拇医药