p16及p15基因在子宫颈癌中的纯合性缺失及其临床意义
作者：徐冰 王言奎 罗兵 戴淑真
单位：徐冰 王言奎 戴淑真(山东省青岛大学医学院附属医院妇科 青岛市 266003)；罗兵(山东省青岛大学医学院微生物教研室 青岛市 266003)
关键词：p16；p15；基因；纯合性缺失；子宫颈癌
肿瘤防治杂志000418
【摘要】目的：探讨抑癌基因p16、p15基因的纯合性缺失在子宫颈癌的发生发展中的作用。方法：应用比较PCR技术检测34例子宫颈癌组织和20例正常宫颈组织中p16、p15基因的纯合性缺失。结果：p16、p15基因的纯合性缺失率分别为11.8%、14.7%，p16、p15基因的纯合性缺失与组织学类型、临床分期及组织学分级无关。结论：p16、p15基因的纯合性缺失在子宫颈癌的发生发展中可能起到一定的作用。
, http://www.100md.com
中图分类号：R737.33 文献标识码：A
文章编号：1009-4571(2000)04-0383-03
Homozygous Deletion of p16 and p15 Genes in Cervical Carcinoma and Clinical Significance
XU Bing,WANG Yan-kui,LUO Bing,DAI Shu-zhen
(Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital,Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003)
【Abstract】Objective:To study the roles of two 2 putative tumor suppressor genes,p16 and p15 genes,in genesis and progression of cervical carcinoma.Methods:Polymerase chain reaction (PCR)-based analysis was performed to search for homozygous deletion of the two genes in 34 cervical carcinomas and 20 normal cervical tissues.Results:Homozygous deletion of p16 and p15 genes evaluated by comparative PCR was found in 4 of 34 and 5 of 34 cervical carcinomas respectively while no deletion was detected in corresponding normal tissues.Deletion was not associated with clinical stage and grading.Conclusions:Homozygous deletion of p16 and p15 genes may play an important role in genesis and progression of cervical carcinoma.
, 百拇医药
【Key words】p16;p15; gene,homozygous deletion;cervical carcinoma
p16、p15基因是新近发现的肿瘤抑制基因，定位于人类染色体9p21区，已在多种人类原发肿瘤中发现p16、p15基因的改变，认为在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。纯合性缺失被认为是p16、p15基因失活的主要作用机制之一。目前有关p16、p15基因在子宫颈癌中的改变的研究较少见。本实验检测了34例子宫颈癌组织中p16、p15基因的纯合性缺失的情况，初步探讨了其临床意义，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本收集
1995年5月～1999年5月收集青岛大学医学院附属医院妇产科宫颈癌标本34例，其中，宫颈鳞癌30例，宫颈腺癌4例。临床分期按1988年FIGO标准，原位癌2例，Ⅰ期7例，临床Ⅱ期12例，临床Ⅲ期9例，临床Ⅳ期4例。组织学分级按3级标准，1级13例，2级11例，3级10例，术中取新鲜标本，置于-70℃冰箱保存待测，同时从中取部分组织用OCT包埋，HE染色，显微镜下确定所取组织中癌组织成分所占的比例。本实验选取恶性组织成分大于50%的标本。术后均经病理学证实诊断。另取因子宫肌瘤而行子宫全切术的正常子宫颈组织20例作为对照。
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1.2 实验方法
比较PCR检测p16基因第1、2外显子，p15基因第1、2外显子的纯合性缺失。
1.2.1 引物的设计与合成 参照文献[1，2]设计p16基因第1、2外显子，p15基因第1、2外显子引物，由北京赛百盛生物工程公司合成。同时选取β-actin 作为内参照基因。引物序列及所扩增目的基因片段长度见表1。
表1 p16、p15基因引物序列及所扩增目的基因片段长度 引物名称
引物序列
所扩增片段
大小(bp)
p16 E1
5′GAAAGGAGAGGAGGGGCT3′
, 百拇医药
5′GCGCTACCTGATTCCAATTC3′
350
p16 E2
5′GGAAATTGGAAACTGGAAGC3′
5′TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3′
500
p15 E1
5′CCAGAAGCAATCCAGGCGCG3′
5′AATGCACACCTCGCCAACG3′
437
p15 E2
, 百拇医药
5′CCTTAAATGGCTCCACCTGC3′
5′CGTTGGCAGCCTTCATCG3′
532
β-actin
5′GAAACTACCTTCAACTCCATC3′
303
5′CTAGAAGCATTTGCGGACGATGGAGGGGCC3′
1.2.2 比较PCR PCR反应体系均用2对引物，即在同一反应体系同时扩增作为内参照基因的β-actin和待测的目的基因(p15、p16基因)。
取10 μg IPCR扩增产物于含EB(0.5 μg/ml)的2%琼脂糖凝胶中电泳，80 V，1 h，紫外透射仪下观察结果并照相。对照PCR marker,可在相应部位分别见到所需的扩增条带。用激光密度扫描仪分析扩增条带，以目的基因与内参照基因条带的强度的比值来判断是否有目的基因的缺失，若未见目的基因条带或比值小于0.25则为缺失，若大于此值则不存在缺失。
, 百拇医药
1.2.3 统计学分析 采用χ2检验和Fisher’s精确检验。
2 结果
20例正常子宫颈组织均未发现p16、p15基因的纯合性缺失。34例子宫颈癌标本中，p16基因缺失4例，均为p16 E2缺失。p15基因缺失5例，p15 E1缺失2例，p15 E2缺失3例。有2例标本显示p15、p16基因的共同缺失。p16、p15基因改变与临床病理特征的关系，见表2。
表2 p16、p15基因纯合性缺失与临床病理特征的关系 临床病理特征
总例数
纯合性缺失
P
p16E1
, 百拇医药
p16E2
p15E1
p15E2
组织学分类
鳞癌
30
0
3
2
2
腺癌
4
0
, 百拇医药 1
0
1
>0.05
组织学分级
1
13
0
1
0
0
2
11
0
, 百拇医药
0
1
1
>0.05※
3
10
0
3
1
2
F1GO分期
0-Ⅱ
21
, 百拇医药
0
2
1
2
>0.05
Ⅲ-Ⅳ
13
0
2
1
1
注：※为1级与3级、2级与3级比较。
3 讨论
, 百拇医药
p16、p15基因是1993年以来先后被克隆鉴定的2种高度同源的基因，均位于人类染色体9p21区[1]。其表达产物p16 INK 4A，p15 INK 4B可与2种细胞周期依赖激酶CDK4和CDK6结合，阻碍其与细胞周期蛋白D(cyclin D)形成复合物，使cyclin D/CDK4、cyclin D/CDK6激酶失活，pRb(retinobastoma protein)去磷酸化，保持活化形式，使细胞周期停滞在G1/S期，细胞增殖受到抑制，呈现抑癌基因的作用[3，4]。如果p16 INK4,p15 IK4B由于p16，p15基因改变不能正常表达，无法竞争CDK4、CDK6与cyclin D的结合，将会导致细胞异常增殖，肿瘤发生。由于在细胞周期的调控中起着关键性的作用，p15、p16基因近年来日益成为人们研究和争论的热点之一。目前较为公认的p15、p16基因的失活机制是纯合性缺失、突变和高甲基化。
为了证实p16，p15基因在子宫颈癌发生、发展中的作用，我们采用比较PCR技术检测了34例宫颈癌组织和20例正常宫颈组织中p16，p15基因的纯合性缺失情况。结果发现，在部分子宫颈癌组织标本中存在P16,p15基因的纯合性缺失，而正常组织无p16，p15基因的改变，从而推断p16，p15基因纯合性缺失在子宫颈癌的发生发展中可能起到一定的作用。
, 百拇医药
本研究显示，20例正常组织无p16，p15基因的改变，34例子宫颈癌组织中4例(11.8%)显示p16基因的纯合性缺失，5例(14.7%)显示p15基因的纯合性缺失，纯合性缺失率略高于Wong[5]的研究。可能与样本例数较少及实验方法的差异有关。为了消除正常间质细胞污染可能造成的假阳性结果，本实验选取恶性肿瘤组织成分大于总体积50%的标本作为研究对象。将内参照基因和目的基因在同一Eppendorf管内进行PCR扩增，消除了可能引起误差的试管效应及其他因素的影响。同时参照Wong[5]方法规定当目的基因与内参照基因条带比值小于25%时定义为缺失，较之以往的认为只有无目的基因的特异性带方为缺失的标准更为客观。在存在纯合性缺失的标本中，发现在不同的临床期别均有p16，p15基因的改变，考虑p16，p15基因的纯合性缺失在宫颈癌的发生中是一早发事件，可能与肿瘤的发生有关，在分化差的肿瘤中缺失频率略高于分化好的标本，但无统计学意义。可能与标本例数较少有关，有待于进行大样本的研究，以阐明p16，p15基因纯合性缺失与组织学分化程度的关系。2例表现p15p16基因共同缺失的标本，均为临床ⅢC期，组织学3级，推测p15p16基因的联合缺失可能提示肿瘤的恶性程度。但是，本研究仅发现较低频率的纯合性缺失，考虑在子宫颈癌的发生发展中，纯合性缺失仅起到有限的作用，也许另有其他作用机制如高甲基化、突变等[6，7]在子宫颈癌的发生发展中起到重要的作用，有待于更深入的研究。
, 百拇医药
最近，WoIF[8]通过一个重组腺病毒载体向存在p16基因缺失的卵巢肿瘤细胞系中导入p16基因，发现导入p16基因的细胞系生长受到抑制，p16蛋白表达增加。这一研究成果使得p15、p16基因在基因治疗方面显示了良好的应用前景。若能进一步证明p15、p16基因的改变在子宫颈癌发生发展中具有重要作用，人们有望在基因治疗方面取得突破性进展。
参考文献：
[1]Jen J,Harper JW,Bigner SH.Deletion of p16 and p15 genes in brain tumors[J].Cancer Res 1994,54:6353～6358.
[2]Kamb A,Gruis N.A,Weaver-Feldhaus J.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science(Washington DC),1994,264:436～440.
, http://www.100md.com
[3]Hortwell L.H,Kastan MB.Cell cycle control and cancer[J].Science,1994，266(5192):1821～1828.
[4]Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/cdk4[J].Nature,1993,366(6456):704～707.
[5]Wong YF,Chung TKH,Cheung TH,et al .p16INK4 and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy[J].Gynecol Oncol,1997,65:319～324.
[6]Herman JG,Merlo A,Mao L,et al.Inactivation of the DNKN2/p16/MST lgene is frequently associated with abbrant DNA methylation in all common human cancers [J].Cancer Res,1995,55:4525～4530.
, http://www.100md.com
[7]Wong YF,Chung TK,Cheung TH.Methylation of p16INK4Ain primary gynecologic malignancy[J].Cancer-lett,1999,136(2):231～235.
[8]Wolf JK,Kim TE.Growth suppression of human ovarian cancer cell lines by the introduction of a p16 gene via a recombinant adenovirus[J].Gynecol Oncol,1999,73(1)27:34～35.
收稿日期：2000-03-15
修回日期：2000-04-18, 百拇医药
单位：徐冰 王言奎 戴淑真(山东省青岛大学医学院附属医院妇科 青岛市 266003)；罗兵(山东省青岛大学医学院微生物教研室 青岛市 266003)
关键词：p16；p15；基因；纯合性缺失；子宫颈癌
肿瘤防治杂志000418
【摘要】目的：探讨抑癌基因p16、p15基因的纯合性缺失在子宫颈癌的发生发展中的作用。方法：应用比较PCR技术检测34例子宫颈癌组织和20例正常宫颈组织中p16、p15基因的纯合性缺失。结果：p16、p15基因的纯合性缺失率分别为11.8%、14.7%，p16、p15基因的纯合性缺失与组织学类型、临床分期及组织学分级无关。结论：p16、p15基因的纯合性缺失在子宫颈癌的发生发展中可能起到一定的作用。
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中图分类号：R737.33 文献标识码：A
文章编号：1009-4571(2000)04-0383-03
Homozygous Deletion of p16 and p15 Genes in Cervical Carcinoma and Clinical Significance
XU Bing,WANG Yan-kui,LUO Bing,DAI Shu-zhen
(Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital,Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003)
【Abstract】Objective:To study the roles of two 2 putative tumor suppressor genes,p16 and p15 genes,in genesis and progression of cervical carcinoma.Methods:Polymerase chain reaction (PCR)-based analysis was performed to search for homozygous deletion of the two genes in 34 cervical carcinomas and 20 normal cervical tissues.Results:Homozygous deletion of p16 and p15 genes evaluated by comparative PCR was found in 4 of 34 and 5 of 34 cervical carcinomas respectively while no deletion was detected in corresponding normal tissues.Deletion was not associated with clinical stage and grading.Conclusions:Homozygous deletion of p16 and p15 genes may play an important role in genesis and progression of cervical carcinoma.
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【Key words】p16;p15; gene,homozygous deletion;cervical carcinoma
p16、p15基因是新近发现的肿瘤抑制基因，定位于人类染色体9p21区，已在多种人类原发肿瘤中发现p16、p15基因的改变，认为在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。纯合性缺失被认为是p16、p15基因失活的主要作用机制之一。目前有关p16、p15基因在子宫颈癌中的改变的研究较少见。本实验检测了34例子宫颈癌组织中p16、p15基因的纯合性缺失的情况，初步探讨了其临床意义，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本收集
1995年5月～1999年5月收集青岛大学医学院附属医院妇产科宫颈癌标本34例，其中，宫颈鳞癌30例，宫颈腺癌4例。临床分期按1988年FIGO标准，原位癌2例，Ⅰ期7例，临床Ⅱ期12例，临床Ⅲ期9例，临床Ⅳ期4例。组织学分级按3级标准，1级13例，2级11例，3级10例，术中取新鲜标本，置于-70℃冰箱保存待测，同时从中取部分组织用OCT包埋，HE染色，显微镜下确定所取组织中癌组织成分所占的比例。本实验选取恶性组织成分大于50%的标本。术后均经病理学证实诊断。另取因子宫肌瘤而行子宫全切术的正常子宫颈组织20例作为对照。
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1.2 实验方法
比较PCR检测p16基因第1、2外显子，p15基因第1、2外显子的纯合性缺失。
1.2.1 引物的设计与合成 参照文献[1，2]设计p16基因第1、2外显子，p15基因第1、2外显子引物，由北京赛百盛生物工程公司合成。同时选取β-actin 作为内参照基因。引物序列及所扩增目的基因片段长度见表1。
表1 p16、p15基因引物序列及所扩增目的基因片段长度 引物名称
引物序列
所扩增片段
大小(bp)
p16 E1
5′GAAAGGAGAGGAGGGGCT3′
, 百拇医药
5′GCGCTACCTGATTCCAATTC3′
350
p16 E2
5′GGAAATTGGAAACTGGAAGC3′
5′TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3′
500
p15 E1
5′CCAGAAGCAATCCAGGCGCG3′
5′AATGCACACCTCGCCAACG3′
437
p15 E2
, 百拇医药
5′CCTTAAATGGCTCCACCTGC3′
5′CGTTGGCAGCCTTCATCG3′
532
β-actin
5′GAAACTACCTTCAACTCCATC3′
303
5′CTAGAAGCATTTGCGGACGATGGAGGGGCC3′
1.2.2 比较PCR PCR反应体系均用2对引物，即在同一反应体系同时扩增作为内参照基因的β-actin和待测的目的基因(p15、p16基因)。
取10 μg IPCR扩增产物于含EB(0.5 μg/ml)的2%琼脂糖凝胶中电泳，80 V，1 h，紫外透射仪下观察结果并照相。对照PCR marker,可在相应部位分别见到所需的扩增条带。用激光密度扫描仪分析扩增条带，以目的基因与内参照基因条带的强度的比值来判断是否有目的基因的缺失，若未见目的基因条带或比值小于0.25则为缺失，若大于此值则不存在缺失。
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1.2.3 统计学分析 采用χ2检验和Fisher’s精确检验。
2 结果
20例正常子宫颈组织均未发现p16、p15基因的纯合性缺失。34例子宫颈癌标本中，p16基因缺失4例，均为p16 E2缺失。p15基因缺失5例，p15 E1缺失2例，p15 E2缺失3例。有2例标本显示p15、p16基因的共同缺失。p16、p15基因改变与临床病理特征的关系，见表2。
表2 p16、p15基因纯合性缺失与临床病理特征的关系 临床病理特征
总例数
纯合性缺失
P
p16E1
, 百拇医药
p16E2
p15E1
p15E2
组织学分类
鳞癌
30
0
3
2
2
腺癌
4
0
, 百拇医药 1
0
1
>0.05
组织学分级
1
13
0
1
0
0
2
11
0
, 百拇医药
0
1
1
>0.05※
3
10
0
3
1
2
F1GO分期
0-Ⅱ
21
, 百拇医药
0
2
1
2
>0.05
Ⅲ-Ⅳ
13
0
2
1
1
注：※为1级与3级、2级与3级比较。
3 讨论
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p16、p15基因是1993年以来先后被克隆鉴定的2种高度同源的基因，均位于人类染色体9p21区[1]。其表达产物p16 INK 4A，p15 INK 4B可与2种细胞周期依赖激酶CDK4和CDK6结合，阻碍其与细胞周期蛋白D(cyclin D)形成复合物，使cyclin D/CDK4、cyclin D/CDK6激酶失活，pRb(retinobastoma protein)去磷酸化，保持活化形式，使细胞周期停滞在G1/S期，细胞增殖受到抑制，呈现抑癌基因的作用[3，4]。如果p16 INK4,p15 IK4B由于p16，p15基因改变不能正常表达，无法竞争CDK4、CDK6与cyclin D的结合，将会导致细胞异常增殖，肿瘤发生。由于在细胞周期的调控中起着关键性的作用，p15、p16基因近年来日益成为人们研究和争论的热点之一。目前较为公认的p15、p16基因的失活机制是纯合性缺失、突变和高甲基化。
为了证实p16，p15基因在子宫颈癌发生、发展中的作用，我们采用比较PCR技术检测了34例宫颈癌组织和20例正常宫颈组织中p16，p15基因的纯合性缺失情况。结果发现，在部分子宫颈癌组织标本中存在P16,p15基因的纯合性缺失，而正常组织无p16，p15基因的改变，从而推断p16，p15基因纯合性缺失在子宫颈癌的发生发展中可能起到一定的作用。
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本研究显示，20例正常组织无p16，p15基因的改变，34例子宫颈癌组织中4例(11.8%)显示p16基因的纯合性缺失，5例(14.7%)显示p15基因的纯合性缺失，纯合性缺失率略高于Wong[5]的研究。可能与样本例数较少及实验方法的差异有关。为了消除正常间质细胞污染可能造成的假阳性结果，本实验选取恶性肿瘤组织成分大于总体积50%的标本作为研究对象。将内参照基因和目的基因在同一Eppendorf管内进行PCR扩增，消除了可能引起误差的试管效应及其他因素的影响。同时参照Wong[5]方法规定当目的基因与内参照基因条带比值小于25%时定义为缺失，较之以往的认为只有无目的基因的特异性带方为缺失的标准更为客观。在存在纯合性缺失的标本中，发现在不同的临床期别均有p16，p15基因的改变，考虑p16，p15基因的纯合性缺失在宫颈癌的发生中是一早发事件，可能与肿瘤的发生有关，在分化差的肿瘤中缺失频率略高于分化好的标本，但无统计学意义。可能与标本例数较少有关，有待于进行大样本的研究，以阐明p16，p15基因纯合性缺失与组织学分化程度的关系。2例表现p15p16基因共同缺失的标本，均为临床ⅢC期，组织学3级，推测p15p16基因的联合缺失可能提示肿瘤的恶性程度。但是，本研究仅发现较低频率的纯合性缺失，考虑在子宫颈癌的发生发展中，纯合性缺失仅起到有限的作用，也许另有其他作用机制如高甲基化、突变等[6，7]在子宫颈癌的发生发展中起到重要的作用，有待于更深入的研究。
, 百拇医药
最近，WoIF[8]通过一个重组腺病毒载体向存在p16基因缺失的卵巢肿瘤细胞系中导入p16基因，发现导入p16基因的细胞系生长受到抑制，p16蛋白表达增加。这一研究成果使得p15、p16基因在基因治疗方面显示了良好的应用前景。若能进一步证明p15、p16基因的改变在子宫颈癌发生发展中具有重要作用，人们有望在基因治疗方面取得突破性进展。
参考文献：
[1]Jen J,Harper JW,Bigner SH.Deletion of p16 and p15 genes in brain tumors[J].Cancer Res 1994,54:6353～6358.
[2]Kamb A,Gruis N.A,Weaver-Feldhaus J.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science(Washington DC),1994,264:436～440.
, http://www.100md.com
[3]Hortwell L.H,Kastan MB.Cell cycle control and cancer[J].Science,1994，266(5192):1821～1828.
[4]Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/cdk4[J].Nature,1993,366(6456):704～707.
[5]Wong YF,Chung TKH,Cheung TH,et al .p16INK4 and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy[J].Gynecol Oncol,1997,65:319～324.
[6]Herman JG,Merlo A,Mao L,et al.Inactivation of the DNKN2/p16/MST lgene is frequently associated with abbrant DNA methylation in all common human cancers [J].Cancer Res,1995,55:4525～4530.
, http://www.100md.com
[7]Wong YF,Chung TK,Cheung TH.Methylation of p16INK4Ain primary gynecologic malignancy[J].Cancer-lett,1999,136(2):231～235.
[8]Wolf JK,Kim TE.Growth suppression of human ovarian cancer cell lines by the introduction of a p16 gene via a recombinant adenovirus[J].Gynecol Oncol,1999,73(1)27:34～35.
收稿日期：2000-03-15
修回日期：2000-04-18, 百拇医药