流式细胞术DNA测定及其在胃肿瘤中的应用
作者：刘长剑 综述 任本 审校
单位：刘长剑(大连市中心医院，辽宁 大连 116033)；任本(大连市中心医院，辽宁 大连 116033)
关键词：
医师进修杂志000431 分类号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1002-0764(2000)04-0060-02
流式细胞术(FCM)是近十年来迅速发展起来的快速定量、定性分析细胞的新技术。国外若干实验室已将其作为对某些肿瘤的常规研究手段[1]。随着FCM技术的发展、完善，已逐渐形成了样本采集、制备、测量的规范化操作和数据及分析的国际统一标准。美国国立癌症研究所(NCI)于1992年10月召开细胞DNA测量术国际统一标准会议(DNA Cytometry Consensus Conference)，并对此作出规范。本文拟对FCM的DNA测量及其新发展和在胃肿瘤研究方面的应用作简要综述。
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1 FCM原理
FCM技术是集中了计算机技术、流体力学、激光技术、单克隆抗体技术等各项先进科技，对单个细胞行多参数分析的技术。在进行FCM检测时，首先要制备合格的单细胞悬液，并对细胞的生化成分做荧光染色[2]。然后使悬液中的细胞呈单行排列，进入检测区。被染细胞受激光照射后发出荧光，可被探测器接收，并将信息经微机处理，得出关于每个细胞的大小、DNA、RNA含量、酶含量、表面特异抗原等多种参数，从而获得有重要医学意义的大量信息。
2 FCM方法及新发展
2.1 标本采集 肿瘤标本应由病理医师进行组织学和细胞学检查。由于某些肿瘤可同时存在两种或更多的DNA倍型细胞亚群，故至少要从肿瘤病灶的三个不同部位取材。石蜡包埋组织要选取病理确诊的病例。
2.2 样品制备 不同组织来源标本采用不同的细胞分离术。包括酶法、化学法、机械法等，最终要得到靶组织的浓度为105～6/ml的单细胞悬液，之后染色，上机。石蜡包埋标本制备过程如下：蜡块组织—50 μm切片—二甲苯脱蜡—乙醇水化—双蒸水洗两次—剪碎—酶消化—水洗—染色—上机。染色时要注意染料的特性及剂量对结果的影响，且应该保持染料浓度与底物浓度恒定不变。
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2.3 内参的设定 制备好的单细胞悬液都可加鸡血红细胞，鳟鱼红细胞或人淋巴细胞作内参。最好的内参标准还是肿瘤组织中相同细胞起源的正常细胞。因为淋巴细胞核(良性)通常比其他正常二倍体细胞核要小，而纤维细胞核却要比正常二倍体细胞核大。
2.4 FCM上机测定 应使机器保持良好质控状态，定期作标准微球测定(Flow-Check)，确保得到良好可信的结果。在DNA测定时，DNA流式细胞术分析国际统一规范建议：最低G0/G1期细胞峰的均值(Mean)应位于30以上的位置，一般都采用50以上的值，并且为了得到充分的数据以去掉碎片和聚集体对测定的影响，建议获取数据的范围是从0.1C～6.0C；若存在DI指数(DNA Index)>2.0的细胞群，则应达到10C的范围。DNA测定中的CV值(Coefficient Variation)控制有重要意义：标准参照(人淋巴细胞、有核红细胞等)的CV值应<3.0，新鲜组织的CV值很少超过6.0，大多数实验室控制在4.0左右，石蜡包埋组织CV值会异常或增高。恶性肿瘤组织的CV值要高于正常组织。但CV值过高(>8.0)，会对S期测量产生较大影响，这样的结果不可信[3]。
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3 FCM测定DNA含量在胃肿瘤中的应用
肿瘤无限制迅速生长的物质基础是DNA含量的增多，S+G2/M期比率的增高又决定了肿瘤的生物学恶性行为。而DI和PI(Proliferation Index)客观反映了肿瘤细胞增殖的动力学规律，所以异常DNA含量被认为是恶性度的标志[4]。反应性病变和良性肿瘤几乎总是二倍体(Diploid)；而恶性肿瘤多为异倍体(Aneuploid)[5]。DNA含量异常，出现异倍体是恶性肿瘤的一个重要标志，异倍体的有无是判断良恶性肿瘤的很有价值的客观指标[6]。当常规组织学无法判定良、恶性病变时，若发现异倍体存在，则可确诊为恶性病变[5]。所以说FCM对DNA测定是诊断恶性肿瘤的有力辅助手段，异倍体往往提示恶性病变的存在[2]。
3.1 胃肿瘤及其前期病变DNA含量分析比较 由于细胞良、恶性增殖之前必须先复制DNA，因此DNA含量分析能明确靶细胞的增殖特性，正常胃粘膜的DNA直方图G0/G1峰为主峰，无明显G2/M峰，呈二倍体分布；浅表性胃炎的DNA含量及细胞周期分布与正常粘膜相似；说明浅表性胃炎时，其细胞核DNA含量、代谢、合成并未有质的改变[7]。由于DNA的变化，才导致肉眼可见的细胞染色体异常，所以DNA含量分析可作为恶性肿瘤的一个客观标志[4]。有人用127例实验表明，胃癌的DI明显高于正常人，91%的患者DNA含量异常，呈异倍体或多倍体分布，SPF、G2/M%及PI皆高于正常人[9]。Weiss用77例慢性萎缩性胃炎的DNA分析表明，慢性萎缩性胃炎的SPF(S Phase Fraction)和G2/M%均明显高于正常人[9]；而且有7%病例发现异倍体；因而认为，FCM对DNA分析有可能发现潜在恶性或即将癌变的病例。轻、中度不典型增生的DI与正常人无显著差异，但SPF与PI均明显高于正常人；这说明慢性萎缩性胃炎，轻度、中度不典型增生细胞处于活跃的增殖状态，但DNA含量多未见异常[8]。而Macartney等报道，重度不典型增生的DI、SPF及PI均显著高于正常人，且有异倍体出现[10]。可以看出，从正常粘膜到胃癌，SPF、PI是逐渐增高，正常人(浅表性胃炎)<轻、中度不典型增生<重度不典型增生、胃癌；并有显著性差异；DI指数的变化是：胃癌和重度不典型增生明显高于其他人(正常人，浅表性胃炎，轻、中度不典型增生)。这表明从正常细胞到恶性肿瘤的发展过程是DNA变异，继而细胞恶性增殖的过程，目前认为，重度不典型增生与高分化腺癌之间只存在量的区别而无质的差异[11]。由于DNA含量分析避免了病理检测的主观影响，所以可与之互相弥补不足；对二倍体肿瘤的检测，可在病理诊断基础上，通过SPF、PI等指标作出辅助诊断。
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3.2 在胃癌治疗中的疗效监控作用 在掌握药物对细胞周期的不同作用后，在用药后，用FCM检测靶细胞DNA含量及分布，根据各期细胞的比例，可判定治疗是否有效。当治疗有效时，异倍体减少或消失，SPF、PI会降低。
3.3 在判断胃癌病人预后中的作用 目前认为影响肿瘤预后的主要因素是肿瘤大小，淋巴结转移和肿瘤的增殖活性[12]。大量研究表明，可用FCM来监测肿瘤患者，并根据DNA分布对预后作出判断[13]。一般来说，呈异倍体分布的恶性肿瘤恶性度较高，常常分化低，转移早，患者存活时间短；而呈二倍体分布或近二倍体的恶性肿瘤常常分化较高，转移少，患者存活时间长。
作者简介：刘长剑(1973～)，男，辽宁省大连市人，检验师。
参考文献：
[1] COON J S.Flow cytometric analysis of paraffin embeded tumors.Implications for diagnostic pathology[J].Hum Patho,1986,17:435.
, 百拇医药
[2] LOVETT E J.Application of flow cytometry to diagnostic pathology[J].Lab Ivest,1984,50:115.
[3] BRAYLAN R C.Flow cytometric analysis of lymphomas[J].Arch Pathol Lab Med,1989,113:627.
[4] BARLOGIE B.Cellular DNA content as a marker of neoplasia in man[J].Am J Med,1980,69:195.
[5] BARLOGIE B.Flow cytometry in clinical cancer research[J.Cancer Res,1983,43:3 982.
, 百拇医药
[6] FRIEDLANDER M L.Clinical and biological significance of aneuploidy in human tumors[J].J Clin Pathol,1984,37:961.
[7] JAMES P D.Flow cytometric analysis of the DNA content of gastric cancer[J].Br J Cancer,1987,57:52.
[8] 李 勇，从庆文，左连富，等.胃癌及其癌前病变的流式细胞光度分析[J].实用肿瘤学杂志，1991，5(1)：16～19.
[9] WEISS H.Characterization of chronic gastritis by means of pulses cytophotometry[M].Acta Pathology Ee Microbroblogica Scandianvica Section A Pathology,1980.
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[10] MACARTNEY J C.DNA flow cytometry of histlogical material from dysplastic lesions of human gastric mucosa[J].Journal of Pathology,1986,150:113.
[11] 赵明朗.胃肠道癌前病变的形态定量研究[J].国外医学*消化系统分册，1985，5(3)：137.
[12] CHEVALLIER B.Prognostic value of estrogen and progerone in oprables breast cancer[J].Cancer,1988,62:2 517.
[13] HORSFALL D J.Relationship between ploidy and steroid horm-ones receptors in primary breast cancer[J].Br J Cancer,1986,53:23.
收稿日期：1999-06-01, http://www.100md.com
单位：刘长剑(大连市中心医院，辽宁 大连 116033)；任本(大连市中心医院，辽宁 大连 116033)
关键词：
医师进修杂志000431 分类号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1002-0764(2000)04-0060-02
流式细胞术(FCM)是近十年来迅速发展起来的快速定量、定性分析细胞的新技术。国外若干实验室已将其作为对某些肿瘤的常规研究手段[1]。随着FCM技术的发展、完善，已逐渐形成了样本采集、制备、测量的规范化操作和数据及分析的国际统一标准。美国国立癌症研究所(NCI)于1992年10月召开细胞DNA测量术国际统一标准会议(DNA Cytometry Consensus Conference)，并对此作出规范。本文拟对FCM的DNA测量及其新发展和在胃肿瘤研究方面的应用作简要综述。
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1 FCM原理
FCM技术是集中了计算机技术、流体力学、激光技术、单克隆抗体技术等各项先进科技，对单个细胞行多参数分析的技术。在进行FCM检测时，首先要制备合格的单细胞悬液，并对细胞的生化成分做荧光染色[2]。然后使悬液中的细胞呈单行排列，进入检测区。被染细胞受激光照射后发出荧光，可被探测器接收，并将信息经微机处理，得出关于每个细胞的大小、DNA、RNA含量、酶含量、表面特异抗原等多种参数，从而获得有重要医学意义的大量信息。
2 FCM方法及新发展
2.1 标本采集 肿瘤标本应由病理医师进行组织学和细胞学检查。由于某些肿瘤可同时存在两种或更多的DNA倍型细胞亚群，故至少要从肿瘤病灶的三个不同部位取材。石蜡包埋组织要选取病理确诊的病例。
2.2 样品制备 不同组织来源标本采用不同的细胞分离术。包括酶法、化学法、机械法等，最终要得到靶组织的浓度为105～6/ml的单细胞悬液，之后染色，上机。石蜡包埋标本制备过程如下：蜡块组织—50 μm切片—二甲苯脱蜡—乙醇水化—双蒸水洗两次—剪碎—酶消化—水洗—染色—上机。染色时要注意染料的特性及剂量对结果的影响，且应该保持染料浓度与底物浓度恒定不变。
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2.3 内参的设定 制备好的单细胞悬液都可加鸡血红细胞，鳟鱼红细胞或人淋巴细胞作内参。最好的内参标准还是肿瘤组织中相同细胞起源的正常细胞。因为淋巴细胞核(良性)通常比其他正常二倍体细胞核要小，而纤维细胞核却要比正常二倍体细胞核大。
2.4 FCM上机测定 应使机器保持良好质控状态，定期作标准微球测定(Flow-Check)，确保得到良好可信的结果。在DNA测定时，DNA流式细胞术分析国际统一规范建议：最低G0/G1期细胞峰的均值(Mean)应位于30以上的位置，一般都采用50以上的值，并且为了得到充分的数据以去掉碎片和聚集体对测定的影响，建议获取数据的范围是从0.1C～6.0C；若存在DI指数(DNA Index)>2.0的细胞群，则应达到10C的范围。DNA测定中的CV值(Coefficient Variation)控制有重要意义：标准参照(人淋巴细胞、有核红细胞等)的CV值应<3.0，新鲜组织的CV值很少超过6.0，大多数实验室控制在4.0左右，石蜡包埋组织CV值会异常或增高。恶性肿瘤组织的CV值要高于正常组织。但CV值过高(>8.0)，会对S期测量产生较大影响，这样的结果不可信[3]。
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3 FCM测定DNA含量在胃肿瘤中的应用
肿瘤无限制迅速生长的物质基础是DNA含量的增多，S+G2/M期比率的增高又决定了肿瘤的生物学恶性行为。而DI和PI(Proliferation Index)客观反映了肿瘤细胞增殖的动力学规律，所以异常DNA含量被认为是恶性度的标志[4]。反应性病变和良性肿瘤几乎总是二倍体(Diploid)；而恶性肿瘤多为异倍体(Aneuploid)[5]。DNA含量异常，出现异倍体是恶性肿瘤的一个重要标志，异倍体的有无是判断良恶性肿瘤的很有价值的客观指标[6]。当常规组织学无法判定良、恶性病变时，若发现异倍体存在，则可确诊为恶性病变[5]。所以说FCM对DNA测定是诊断恶性肿瘤的有力辅助手段，异倍体往往提示恶性病变的存在[2]。
3.1 胃肿瘤及其前期病变DNA含量分析比较 由于细胞良、恶性增殖之前必须先复制DNA，因此DNA含量分析能明确靶细胞的增殖特性，正常胃粘膜的DNA直方图G0/G1峰为主峰，无明显G2/M峰，呈二倍体分布；浅表性胃炎的DNA含量及细胞周期分布与正常粘膜相似；说明浅表性胃炎时，其细胞核DNA含量、代谢、合成并未有质的改变[7]。由于DNA的变化，才导致肉眼可见的细胞染色体异常，所以DNA含量分析可作为恶性肿瘤的一个客观标志[4]。有人用127例实验表明，胃癌的DI明显高于正常人，91%的患者DNA含量异常，呈异倍体或多倍体分布，SPF、G2/M%及PI皆高于正常人[9]。Weiss用77例慢性萎缩性胃炎的DNA分析表明，慢性萎缩性胃炎的SPF(S Phase Fraction)和G2/M%均明显高于正常人[9]；而且有7%病例发现异倍体；因而认为，FCM对DNA分析有可能发现潜在恶性或即将癌变的病例。轻、中度不典型增生的DI与正常人无显著差异，但SPF与PI均明显高于正常人；这说明慢性萎缩性胃炎，轻度、中度不典型增生细胞处于活跃的增殖状态，但DNA含量多未见异常[8]。而Macartney等报道，重度不典型增生的DI、SPF及PI均显著高于正常人，且有异倍体出现[10]。可以看出，从正常粘膜到胃癌，SPF、PI是逐渐增高，正常人(浅表性胃炎)<轻、中度不典型增生<重度不典型增生、胃癌；并有显著性差异；DI指数的变化是：胃癌和重度不典型增生明显高于其他人(正常人，浅表性胃炎，轻、中度不典型增生)。这表明从正常细胞到恶性肿瘤的发展过程是DNA变异，继而细胞恶性增殖的过程，目前认为，重度不典型增生与高分化腺癌之间只存在量的区别而无质的差异[11]。由于DNA含量分析避免了病理检测的主观影响，所以可与之互相弥补不足；对二倍体肿瘤的检测，可在病理诊断基础上，通过SPF、PI等指标作出辅助诊断。
, 百拇医药
3.2 在胃癌治疗中的疗效监控作用 在掌握药物对细胞周期的不同作用后，在用药后，用FCM检测靶细胞DNA含量及分布，根据各期细胞的比例，可判定治疗是否有效。当治疗有效时，异倍体减少或消失，SPF、PI会降低。
3.3 在判断胃癌病人预后中的作用 目前认为影响肿瘤预后的主要因素是肿瘤大小，淋巴结转移和肿瘤的增殖活性[12]。大量研究表明，可用FCM来监测肿瘤患者，并根据DNA分布对预后作出判断[13]。一般来说，呈异倍体分布的恶性肿瘤恶性度较高，常常分化低，转移早，患者存活时间短；而呈二倍体分布或近二倍体的恶性肿瘤常常分化较高，转移少，患者存活时间长。
作者简介：刘长剑(1973～)，男，辽宁省大连市人，检验师。
参考文献：
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[4] BARLOGIE B.Cellular DNA content as a marker of neoplasia in man[J].Am J Med,1980,69:195.
[5] BARLOGIE B.Flow cytometry in clinical cancer research[J.Cancer Res,1983,43:3 982.
, 百拇医药
[6] FRIEDLANDER M L.Clinical and biological significance of aneuploidy in human tumors[J].J Clin Pathol,1984,37:961.
[7] JAMES P D.Flow cytometric analysis of the DNA content of gastric cancer[J].Br J Cancer,1987,57:52.
[8] 李 勇，从庆文，左连富，等.胃癌及其癌前病变的流式细胞光度分析[J].实用肿瘤学杂志，1991，5(1)：16～19.
[9] WEISS H.Characterization of chronic gastritis by means of pulses cytophotometry[M].Acta Pathology Ee Microbroblogica Scandianvica Section A Pathology,1980.
, 百拇医药
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[13] HORSFALL D J.Relationship between ploidy and steroid horm-ones receptors in primary breast cancer[J].Br J Cancer,1986,53:23.
收稿日期：1999-06-01, http://www.100md.com