肿瘤坏死因子α与妊娠高血压综合征发病关系的研究
作者：徐望明 杨菁 谢青贞 喻伦银 董红梅
单位：徐望明(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)；杨菁(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)；谢青贞(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)；喻伦银(湖北医科大学病理学教研室)；董红梅(湖北医科大学病理学教研室)
关键词：妊娠并发症；心血管；肿瘤坏死因子；内皮；血管；细胞学
中华医学杂志000410 【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)在妊娠高血压综合征(简称妊高征)发病中的作用。方法 对41例妊高征患者(妊高征组)和17例正常妊娠妇女(正常妊娠组)进行了下列研究：(1)测定血浆中TNFα水平，观察胎盘血管内皮细胞的形态学变化；(2)利用其血清对离体培养的脐血管内皮细胞作用，观察其损伤性表现；(3)利用400 U/ml的人重组TNFα (rTNFα)对离体培养的脐血管内皮细胞作用，比较TNFα和妊高征孕妇血清对内皮细胞的损伤作用。结果 (1)妊高征组孕妇血浆TNFα为2.29 μg/L±0.51 μg/L，正常妊娠组血浆TNFα为1.73 μg/L±0.25 μg/L,两组差异有显著意义(t=5.60，P<0.01)；胎盘血管内皮细胞有损伤性改变，主要表现为细胞肿胀、增生、内质网扩张及细胞连接疏松等；(2)正常孕妇血清对培养的脐血管内皮细胞无损伤作用，而妊高征患者血清及rTNFα对培养的脐血管内皮细胞有同样的损伤作用，表现为细胞增殖抑制和细胞形态及结构改变等。结论 (1)妊高征患者胎盘血管内皮细胞损伤与血中TNFα水平增高有关；(2)妊高征患者血清对培养的血管内皮细胞有损伤作用，且这种作用与TNFα有关。提示TNFα可能作为血管内皮细胞损伤的一种免疫因子，参与妊高征的发病。
, 百拇医药
Role of tumor necrosis factor -α in the pathogenesis of pregnancy-induced hypertension
XU Wangming
(First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060, China)
YANG Jing
(First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060, China)
XIE Qingzhen
(First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060, China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the role of tumor necrosis factor-α(TNFα) in the pathogenesis of pregnancy induced hypertension (PIH) by damaging endothelial cells. Methods 41 patients with PIH and 17 healthy pregnant women were studied. The concentration of TNFα in maternal plasma was measured by sensitive radioimmunoassay. The morphology of endothelial cells of placental blood vessels was observed. Endothelial cells were incubated in the presence of TNFα (400 U/ml) and sera (30% vol/vol) from PIH women and normal pregnant women to observe their growth and shape. Results Maternal plasma TNFα level in PIH was 2.29 μg/L±0.51 μg/L, higher than that in normal pregnancy (the latter was 1.73 μg/L±0.25 μg/L, t=5.60, P<0.01). The endothelial cells of placental blood vessels in PIH revealed morphologic damages. Both sera of PIH women and TNFα were cytotoxic to endothelial cells in culture, including inhibition of the proliferation and morphologic changes of the cells. Conclusion Damage of the endothelial cells of placental blood vessels is associated with the abnormal increase in the maternal blood TNFα. Sera of PIH women can damage the endothelial cells in culture and this effect is also associated with TNFα.
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【Key words】 Pregnancy complications, cardiovascular； Tumor necrosis factor； Endothelium, vascular； Cytology
妊娠高血压综合征(简称妊高征)患者血中肿瘤坏死因子α(TNFα)水平高于正常妊娠孕妇[1，2]，体外试验证实，妊高征孕妇血清与TNFα对血管内皮细胞均有损伤作用[3]，故推测TNFα为妊高征孕妇血中起致病作用的“毒性因子”之一。我们通过测定妊高征患者血浆中TNFα水平，观察胎盘血管内皮细胞损伤性改变，并采用妊高征患者血清和人重组TNFα(r TNFα)对体外培养脐血管内皮细胞的作用，以进一步揭示妊高征的发病机理。
对象与方法
一、对象
为1997年6月～1998年10月在我科住院待分娩孕妇，妊高征41例(妊高征组)，其中轻度14例，中度11例，重度16例，诊断及分类按文献[4]，平均年龄27岁，平均孕周38周；正常妊娠妇女17例(正常妊娠组)，平均年龄26岁，平均孕周39周。两组孕妇既往无心、肝、肾及内分泌疾病史，近期无炎症感染史。
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二、方法
1.孕妇血清的采集及制备：选择妊高征组孕妇13例(其中重度5例，中度2例，轻度6例)和正常孕妇4例，于临产前采集静脉血，0℃静置4 h，无菌条件下2 000 r/min离心5 min，制备血清，-20℃保存，以作细胞培养之用。
2.待测样本的采集：于临产前采集静脉血，放于含依地酸二钠的试管中，离心(3 500 r/min，15 min)，取血浆，-20℃以下保存待测。
3.胎盘标本的采样及处理：胎盘娩出后立即在直视下剪取胎盘一小块组织，生理盐水冲洗干净后，切成2.0 mm×2.0 mm组织块，固定于体积分数为2.5%戍二醛溶液中，经醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，812树脂包埋，超薄切片，作透射电镜观察。
4.TNFα的测定：采用放射免疫分析法进行检测，试剂盒由长城免疫试剂所提供。实验步骤严格按药盒说明书进行，所有标本及标准品为同一批复管测定，批内变异系数为2.9%，测量仪器为FT-613放免测定仪。
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5.血管内皮细胞培养、处理和观察：(1)主要试剂：ECV304血管内皮细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。TNFα为北京邦定生物医学公司产品。(2)细胞传代培养：参照文献[5]方法进行。(3)处理和分组：在细胞传代时加入不同的处理因素(孕妇血清或rTNFα)，根据加入试剂的不同，分为：1组:加入等量MEM培养液；2组:培养液中加入正常孕妇血清；3组:培养液中加入轻度妊高征孕妇血清；4组:培养液中加入中度妊高征孕妇血清；5组:培养液中加入重度妊高征孕妇血清；6组:培养液中加入rTNFα(含量为400 U/ml)。2～5组中所加血清体积分数为30%，其他成分与对照组相同。(4)观察指标：①生长曲线：连续观察7d，以每天所得细胞数绘制成图。②DNA含量的图像分析；应用德国Kenton公司生产的IBAS-2 000图像分析仪测量经Feulgen DNA染色的血管内皮细胞，获取DNA相对含量。③细胞形态和超微结构：细胞HE染色镜检；电镜下观察细胞的超微结构。
三、统计学处理
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所有数据均以
±s表示，差异显著性检验采用方差分析、t检验。
结果
一、妊高征组和正常妊娠组孕妇血TNFα含量
正常妊娠组孕妇血浆TNFα浓度为1.73 μg/L±0.25 μg/L，而妊高征组孕妇血浆TNFα为2.29 μg/L±0.51 μg/L(其中轻度2.18 μg/L±0.49 μg/L，中度2.31 μg/L±0.38 μg/L，重度2.32 μg/L±0.41 μg/L)，两组间差异有显著意义(t=5.60, P<0.01)。
二、胎盘绒毛血管的超微结构
与正常妊娠组比较，中、重度妊高征患者胎盘绒毛血管壁的改变主要表现为微血管内皮细胞损伤性变化，具体表现为内皮细胞肿胀，呈层增生，并可突出于管腔或脱落；细胞间连接疏松，红细胞可漏出管腔外；内质网扩张，线粒体肿胀，使内皮细胞呈空泡变；血管内皮细胞外平滑肌及纤维细胞增生；内皮细胞染色质边聚，核膜不完整，见图1。
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图1 重度妊高征胎盘绒毛血管内皮细胞胞浆肿胀 ×5 000
三、妊高征孕妇血清及TNFα对培养的脐静脉内皮细胞的影响
1.对脐血管内皮细胞增殖的影响：(1)生长曲线：由图2可见，正常的血管内皮细胞生长曲线呈光滑的均匀上升趋势，从第6 d后细胞生长进入消退期。妊高征孕妇血清和TNFα在作用3 d内表现为促血管内皮细胞增殖的作用，3 d后则表现为抑制血管内皮细胞生长，妊高征的病情愈严重，其抑制血管内皮细胞增殖的作用愈明显。(2)血管内皮细胞DNA图像分析结果: 每组处理因素作用后1 d、2 d、3 d、7 d的50个细胞的DNA含量平均积分吸光密度(A)值见表1。可以看出，与正常孕妇血清比较，中、重度妊高征孕妇血清和rTNFα的抑制血管内皮细胞生长的作用在处理3 d后表现较明显(t值分别为5.04、3.37、4.03,P<0.01)。
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图2 各组内皮细胞生长曲线
表1 妊高征患者血清及TNFα对血管内皮细胞
DNA含量的影响(A值，±s) 组别
细胞数
(个)
实验时间(d)
1
2
3
7
1
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50
19.7±4.1
24.7±2.8
23.6±3.5
22.7±4.3
2
50
20.8±3.2
27.5±4.5
24.7±6.3
24.1±5.1
3
, http://www.100md.com 50
20.4±3.5
27.6±6.8
25.8±2.5
23.8±5.4
4
50
21.1±3.6
28.2±1.9
25.7±2.1
18.7±3.8
5
50
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23.1±3.7
29.7±4.6
27.5±3.4
21.1±3.5
6
50
24.0±2.8
29.4±4.5
27.6±2.9
20.8±2.8
2.细胞形态和超微结构: (1)HE染色结果：正常孕妇血清作用后，血管内皮细胞仍保持原来的形态，而经rTNFα和妊高征患者血清作用后，细胞由原来的多边形拉长变为梭形，有的甚至伸出长长的伪足，见图3。(2)扫描电镜的结果：正常的血管内皮细胞表面微绒毛丰富，细胞形态亦较规则，而经rTNFα和妊高征患者血清作用后，细胞表面微绒毛明显缩短，且有的细胞表面绒毛呈泡状结构，见图4。正常孕妇血清作用后，无上述改变。(3)透射电镜观察结果：经rTNFα作用后，细胞内质网扩张，线粒体浓缩、深染。妊高征患者血清使血管内皮细胞出现类似rTNFα作用后的改变，且这种改变与妊高征病情呈平行关系，见图5。
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图3 重度妊高征孕妇血清孵育3 d后的脐静脉内皮细胞HE×66
图4 TNFα孵育3 d后的脐静脉内皮细胞，细胞形态不规则，表面微绒毛变短 SEM×15 000
图5 TNFα孵育3 d后的脐静脉内皮细胞，内质网扩张 TEM×15 000
讨论
TNFα是一种主要由活化的单核巨噬细胞产生的多肽，参与多种生理与免疫过程。血管内皮细胞表面存在TNFα受体，为其靶细胞之一。当TNFα在血液中异常增高时，可损伤血管内皮细胞，造成血管内皮细胞形态改变、细胞膜及细胞器损害等[5]，并能增加内皮细胞单层结构的通透性[6]。本研究我们采用含有TNFα的条件培养液孵育血管内皮细胞几天后观察TNFα对血管内皮细胞的影响，从生长曲线和DNA图像分析结果可以看出，TNFα(400 U/ml )抑制血管内皮细胞增殖的效果在作用3 d后表现出来，3 d以内则主要表现为促增殖作用。从光镜、电镜结果来看，TNFα能导致血管内皮细胞损害，表现有血管内皮细胞坏死、脱落、细胞间隙增大等，与国内外文献报道一致[3，6]。血管内皮损伤及其功能不全，在妊高征的发病中可能起着关键性作用。许多研究证实，妊高征患者存在有血管内皮细胞损伤的病理学依据[7]，本结果也提示妊高征患者胎盘血管内皮细胞形态有病理性损害。Rodgers等[8]发现，妊高征患者血清中存在某种“毒性因素”，导致血管内皮细胞损伤和功能障碍，但这种毒性因子至今未能分离或确定，推测与免疫因素有关。我们通过妊高征患者血清与正常孕妇血清对血管内皮细胞影响的比较，证实妊高征患者血清不仅使血管内皮细胞的生长受到抑制；而且使细胞形态和结构发生损伤性改变。Chen等[9]运用RT-PCR的方法发现，妊高征患者与正常孕妇相比，白细胞TNFα mRNA表达明显增高；我们另外研究结果表明，妊高征患者血浆TNFα水平高于对照组，并且与病情的严重程度有关，且随着TNFα水平增高，伴有内皮素水平增高[10]。本研究表明，妊高征患者血清与TNFα对血管内皮细胞毒性作用相似，证明妊高征患者中血管内皮细胞的损害与TNFα有很大关系，并提示TNFα可能是造成妊高征患者血管内皮细胞损伤的主要因子之一。
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基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(SJ-970572)
参考文献
1，Kupfermic MJ, Peaceman AM, Wigton TR, et al. Tumor necrosis factor-α is elevated in plasma and amniotic fluid of patients with severe preeclampsia. Am J Obstet Gynecol, 1994，170:1752-1759.
2，徐望明，杨菁，陈辉霖，等.肿瘤坏死因子在妊高征发病中的作用.中华妇产科杂志，1997，32:9-11.
3，沙志一，金惠铭.肿瘤坏死因子对体外培养的血管内皮细胞的作用.中国病理生理杂志，1995，11:455-458.
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4，乐杰主编.妇产科学.第4版.北京：人民卫生出版社，1998,115.
5，Goldblum SE, Whining B, Jay M, et al. Tumor necrosis factor induced pulmonary vascular endothelial injury. Infect Immun, 1989，57:1218-1225.
6，Brett BJ, Gerlach H, Nanroth P, et al. Tumor necrosis factor/cachectin increases permeability of endothelial cell monolayers by a mechanism involving regulatory G proteins. J Exp Med, 1989， 169:1977-1988.
7，Khong TY, Sanyer IH, Heryet AR. An immunohistologic study of endothelialization of uteroplacental vessels in human pregnancy-Evidence that endothelium is focally disrupted by trophoblast in preeclampsia, Am J Obstet Gynecol, 1992，167:751-756.
, http://www.100md.com
8，Rodger GM, Taylor RN, Roberts JM. Preeclampsia is associated with a serum factor cytotoxic to human endothelia cells. Am J Obstet Gynecol, 1988，159:908-916.
9，Chen G, Wilson R, Wang SH, et al. Tumor necrosis factor-alpha gene poly-morphism and expression in preeclampsia. Clin Exp Immunol, 1996，104:154-159.
10，徐望明，杨菁，王彩霞.肿瘤坏死因子对妊高征致病作用与内皮素的关系.中国实用妇科与产科杂志，1998，14：25-26.
(收稿日期：1999-07-20), http://www.100md.com
单位：徐望明(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)；杨菁(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)；谢青贞(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)；喻伦银(湖北医科大学病理学教研室)；董红梅(湖北医科大学病理学教研室)
关键词：妊娠并发症；心血管；肿瘤坏死因子；内皮；血管；细胞学
中华医学杂志000410 【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)在妊娠高血压综合征(简称妊高征)发病中的作用。方法 对41例妊高征患者(妊高征组)和17例正常妊娠妇女(正常妊娠组)进行了下列研究：(1)测定血浆中TNFα水平，观察胎盘血管内皮细胞的形态学变化；(2)利用其血清对离体培养的脐血管内皮细胞作用，观察其损伤性表现；(3)利用400 U/ml的人重组TNFα (rTNFα)对离体培养的脐血管内皮细胞作用，比较TNFα和妊高征孕妇血清对内皮细胞的损伤作用。结果 (1)妊高征组孕妇血浆TNFα为2.29 μg/L±0.51 μg/L，正常妊娠组血浆TNFα为1.73 μg/L±0.25 μg/L,两组差异有显著意义(t=5.60，P<0.01)；胎盘血管内皮细胞有损伤性改变，主要表现为细胞肿胀、增生、内质网扩张及细胞连接疏松等；(2)正常孕妇血清对培养的脐血管内皮细胞无损伤作用，而妊高征患者血清及rTNFα对培养的脐血管内皮细胞有同样的损伤作用，表现为细胞增殖抑制和细胞形态及结构改变等。结论 (1)妊高征患者胎盘血管内皮细胞损伤与血中TNFα水平增高有关；(2)妊高征患者血清对培养的血管内皮细胞有损伤作用，且这种作用与TNFα有关。提示TNFα可能作为血管内皮细胞损伤的一种免疫因子，参与妊高征的发病。
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Role of tumor necrosis factor -α in the pathogenesis of pregnancy-induced hypertension
XU Wangming
(First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060, China)
YANG Jing
(First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060, China)
XIE Qingzhen
(First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060, China)
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【Abstract】 Objective To investigate the role of tumor necrosis factor-α(TNFα) in the pathogenesis of pregnancy induced hypertension (PIH) by damaging endothelial cells. Methods 41 patients with PIH and 17 healthy pregnant women were studied. The concentration of TNFα in maternal plasma was measured by sensitive radioimmunoassay. The morphology of endothelial cells of placental blood vessels was observed. Endothelial cells were incubated in the presence of TNFα (400 U/ml) and sera (30% vol/vol) from PIH women and normal pregnant women to observe their growth and shape. Results Maternal plasma TNFα level in PIH was 2.29 μg/L±0.51 μg/L, higher than that in normal pregnancy (the latter was 1.73 μg/L±0.25 μg/L, t=5.60, P<0.01). The endothelial cells of placental blood vessels in PIH revealed morphologic damages. Both sera of PIH women and TNFα were cytotoxic to endothelial cells in culture, including inhibition of the proliferation and morphologic changes of the cells. Conclusion Damage of the endothelial cells of placental blood vessels is associated with the abnormal increase in the maternal blood TNFα. Sera of PIH women can damage the endothelial cells in culture and this effect is also associated with TNFα.
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【Key words】 Pregnancy complications, cardiovascular； Tumor necrosis factor； Endothelium, vascular； Cytology
妊娠高血压综合征(简称妊高征)患者血中肿瘤坏死因子α(TNFα)水平高于正常妊娠孕妇[1，2]，体外试验证实，妊高征孕妇血清与TNFα对血管内皮细胞均有损伤作用[3]，故推测TNFα为妊高征孕妇血中起致病作用的“毒性因子”之一。我们通过测定妊高征患者血浆中TNFα水平，观察胎盘血管内皮细胞损伤性改变，并采用妊高征患者血清和人重组TNFα(r TNFα)对体外培养脐血管内皮细胞的作用，以进一步揭示妊高征的发病机理。
对象与方法
一、对象
为1997年6月～1998年10月在我科住院待分娩孕妇，妊高征41例(妊高征组)，其中轻度14例，中度11例，重度16例，诊断及分类按文献[4]，平均年龄27岁，平均孕周38周；正常妊娠妇女17例(正常妊娠组)，平均年龄26岁，平均孕周39周。两组孕妇既往无心、肝、肾及内分泌疾病史，近期无炎症感染史。
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二、方法
1.孕妇血清的采集及制备：选择妊高征组孕妇13例(其中重度5例，中度2例，轻度6例)和正常孕妇4例，于临产前采集静脉血，0℃静置4 h，无菌条件下2 000 r/min离心5 min，制备血清，-20℃保存，以作细胞培养之用。
2.待测样本的采集：于临产前采集静脉血，放于含依地酸二钠的试管中，离心(3 500 r/min，15 min)，取血浆，-20℃以下保存待测。
3.胎盘标本的采样及处理：胎盘娩出后立即在直视下剪取胎盘一小块组织，生理盐水冲洗干净后，切成2.0 mm×2.0 mm组织块，固定于体积分数为2.5%戍二醛溶液中，经醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，812树脂包埋，超薄切片，作透射电镜观察。
4.TNFα的测定：采用放射免疫分析法进行检测，试剂盒由长城免疫试剂所提供。实验步骤严格按药盒说明书进行，所有标本及标准品为同一批复管测定，批内变异系数为2.9%，测量仪器为FT-613放免测定仪。
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5.血管内皮细胞培养、处理和观察：(1)主要试剂：ECV304血管内皮细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。TNFα为北京邦定生物医学公司产品。(2)细胞传代培养：参照文献[5]方法进行。(3)处理和分组：在细胞传代时加入不同的处理因素(孕妇血清或rTNFα)，根据加入试剂的不同，分为：1组:加入等量MEM培养液；2组:培养液中加入正常孕妇血清；3组:培养液中加入轻度妊高征孕妇血清；4组:培养液中加入中度妊高征孕妇血清；5组:培养液中加入重度妊高征孕妇血清；6组:培养液中加入rTNFα(含量为400 U/ml)。2～5组中所加血清体积分数为30%，其他成分与对照组相同。(4)观察指标：①生长曲线：连续观察7d，以每天所得细胞数绘制成图。②DNA含量的图像分析；应用德国Kenton公司生产的IBAS-2 000图像分析仪测量经Feulgen DNA染色的血管内皮细胞，获取DNA相对含量。③细胞形态和超微结构：细胞HE染色镜检；电镜下观察细胞的超微结构。
三、统计学处理
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所有数据均以
±s表示，差异显著性检验采用方差分析、t检验。结果
一、妊高征组和正常妊娠组孕妇血TNFα含量
正常妊娠组孕妇血浆TNFα浓度为1.73 μg/L±0.25 μg/L，而妊高征组孕妇血浆TNFα为2.29 μg/L±0.51 μg/L(其中轻度2.18 μg/L±0.49 μg/L，中度2.31 μg/L±0.38 μg/L，重度2.32 μg/L±0.41 μg/L)，两组间差异有显著意义(t=5.60, P<0.01)。
二、胎盘绒毛血管的超微结构
与正常妊娠组比较，中、重度妊高征患者胎盘绒毛血管壁的改变主要表现为微血管内皮细胞损伤性变化，具体表现为内皮细胞肿胀，呈层增生，并可突出于管腔或脱落；细胞间连接疏松，红细胞可漏出管腔外；内质网扩张，线粒体肿胀，使内皮细胞呈空泡变；血管内皮细胞外平滑肌及纤维细胞增生；内皮细胞染色质边聚，核膜不完整，见图1。
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图1 重度妊高征胎盘绒毛血管内皮细胞胞浆肿胀 ×5 000
三、妊高征孕妇血清及TNFα对培养的脐静脉内皮细胞的影响
1.对脐血管内皮细胞增殖的影响：(1)生长曲线：由图2可见，正常的血管内皮细胞生长曲线呈光滑的均匀上升趋势，从第6 d后细胞生长进入消退期。妊高征孕妇血清和TNFα在作用3 d内表现为促血管内皮细胞增殖的作用，3 d后则表现为抑制血管内皮细胞生长，妊高征的病情愈严重，其抑制血管内皮细胞增殖的作用愈明显。(2)血管内皮细胞DNA图像分析结果: 每组处理因素作用后1 d、2 d、3 d、7 d的50个细胞的DNA含量平均积分吸光密度(A)值见表1。可以看出，与正常孕妇血清比较，中、重度妊高征孕妇血清和rTNFα的抑制血管内皮细胞生长的作用在处理3 d后表现较明显(t值分别为5.04、3.37、4.03,P<0.01)。
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图2 各组内皮细胞生长曲线
表1 妊高征患者血清及TNFα对血管内皮细胞
DNA含量的影响(A值，
±s) 组别细胞数
(个)
实验时间(d)
1
2
3
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1
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19.7±4.1
24.7±2.8
23.6±3.5
22.7±4.3
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27.6±6.8
25.8±2.5
23.8±5.4
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21.1±3.6
28.2±1.9
25.7±2.1
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29.7±4.6
27.5±3.4
21.1±3.5
6
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29.4±4.5
27.6±2.9
20.8±2.8
2.细胞形态和超微结构: (1)HE染色结果：正常孕妇血清作用后，血管内皮细胞仍保持原来的形态，而经rTNFα和妊高征患者血清作用后，细胞由原来的多边形拉长变为梭形，有的甚至伸出长长的伪足，见图3。(2)扫描电镜的结果：正常的血管内皮细胞表面微绒毛丰富，细胞形态亦较规则，而经rTNFα和妊高征患者血清作用后，细胞表面微绒毛明显缩短，且有的细胞表面绒毛呈泡状结构，见图4。正常孕妇血清作用后，无上述改变。(3)透射电镜观察结果：经rTNFα作用后，细胞内质网扩张，线粒体浓缩、深染。妊高征患者血清使血管内皮细胞出现类似rTNFα作用后的改变，且这种改变与妊高征病情呈平行关系，见图5。
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图3 重度妊高征孕妇血清孵育3 d后的脐静脉内皮细胞HE×66
图4 TNFα孵育3 d后的脐静脉内皮细胞，细胞形态不规则，表面微绒毛变短 SEM×15 000
图5 TNFα孵育3 d后的脐静脉内皮细胞，内质网扩张 TEM×15 000
讨论
TNFα是一种主要由活化的单核巨噬细胞产生的多肽，参与多种生理与免疫过程。血管内皮细胞表面存在TNFα受体，为其靶细胞之一。当TNFα在血液中异常增高时，可损伤血管内皮细胞，造成血管内皮细胞形态改变、细胞膜及细胞器损害等[5]，并能增加内皮细胞单层结构的通透性[6]。本研究我们采用含有TNFα的条件培养液孵育血管内皮细胞几天后观察TNFα对血管内皮细胞的影响，从生长曲线和DNA图像分析结果可以看出，TNFα(400 U/ml )抑制血管内皮细胞增殖的效果在作用3 d后表现出来，3 d以内则主要表现为促增殖作用。从光镜、电镜结果来看，TNFα能导致血管内皮细胞损害，表现有血管内皮细胞坏死、脱落、细胞间隙增大等，与国内外文献报道一致[3，6]。血管内皮损伤及其功能不全，在妊高征的发病中可能起着关键性作用。许多研究证实，妊高征患者存在有血管内皮细胞损伤的病理学依据[7]，本结果也提示妊高征患者胎盘血管内皮细胞形态有病理性损害。Rodgers等[8]发现，妊高征患者血清中存在某种“毒性因素”，导致血管内皮细胞损伤和功能障碍，但这种毒性因子至今未能分离或确定，推测与免疫因素有关。我们通过妊高征患者血清与正常孕妇血清对血管内皮细胞影响的比较，证实妊高征患者血清不仅使血管内皮细胞的生长受到抑制；而且使细胞形态和结构发生损伤性改变。Chen等[9]运用RT-PCR的方法发现，妊高征患者与正常孕妇相比，白细胞TNFα mRNA表达明显增高；我们另外研究结果表明，妊高征患者血浆TNFα水平高于对照组，并且与病情的严重程度有关，且随着TNFα水平增高，伴有内皮素水平增高[10]。本研究表明，妊高征患者血清与TNFα对血管内皮细胞毒性作用相似，证明妊高征患者中血管内皮细胞的损害与TNFα有很大关系，并提示TNFα可能是造成妊高征患者血管内皮细胞损伤的主要因子之一。
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基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(SJ-970572)
参考文献
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9，Chen G, Wilson R, Wang SH, et al. Tumor necrosis factor-alpha gene poly-morphism and expression in preeclampsia. Clin Exp Immunol, 1996，104:154-159.
10，徐望明，杨菁，王彩霞.肿瘤坏死因子对妊高征致病作用与内皮素的关系.中国实用妇科与产科杂志，1998，14：25-26.
(收稿日期：1999-07-20), http://www.100md.com