逆转录病毒介导肿瘤坏死因子α基因修饰人胰腺癌细胞的建立
作者：张群华 倪泉兴 傅德良 姚琪远 金忱 虞先浚 张妞 沈兆忠 郑颂国 罗建明 张延龄
单位：200040 上海医科大学华山医院胰腺癌诊治中心外科
关键词：
中华医学杂志000427 尽管胰腺癌手术、放疗和化疗有了新进展，但胰腺癌的预后仍很差。利用基因工程技术，将细胞因子基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗，已成为肿瘤生物治疗中的一项重要手段[1]。肿瘤坏死因子(TNFα)具有多方面的抗肿瘤效应，尤以激发或增强宿主抗肿瘤免疫应答最为重要。但TNFα可被机体很快清除，并会造成严重的全身不良反应，直接应用重组TNFα治疗胰腺癌的效果不理想。TNFα基因治疗胰腺癌正受到重视。我们利用逆转录病毒载体MoMLV，将TNFα基因转录致人胰腺癌细胞，经G418抗性筛选建立基因转导克隆后，在体外进行分子生物学鉴定，为进一步研究TNFα基因修饰人胰腺癌细胞的免疫原性奠定了基础。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.细胞培养和基因转染： 人胰腺癌细胞购自北京协和医院，为人胰腺癌细胞系PC-3。RPMI1640(GIBCO BRL)加体积分数为0.1小牛血清(上海生化所)培养。逆转录病毒载体PL(hTNFα)SN含有EcoRI和BamH1位点。外源性基因SV40为启动因子，NeoR为标志基因，TNFα为目标基因。质粒经大肠杆菌扩增，C3CL超离心纯化，采用磷酸钙共沉淀法转染包装细胞系PA317，收集含有TNFα基因复制缺陷型逆转录病毒上清液转染PC3胰腺癌细胞，用G418筛选有抗性的细胞克隆。随机挑选细胞克隆1号和4号转染胰腺癌细胞，进行后继试验，检测TNFα的活性蛋白表达和mRNA的表达。细胞接种量1×105个，在含5 ml培养液的培养瓶中生长5 d，使用MedgenixTNFα ELISA kit(Medgenix Diagnostic S.A)，检测细胞培养上清液中TNFα含量。利用TNFα对放射菌素D处理后的小鼠成纤维肉瘤细胞L929的溶解作用，检测TNFα的生物活性。按异硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提细胞总RNA。RT-PCR法分别测定转染和未转染的胰腺癌细胞中TNFα mRNA的表达。选用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Promega A1250)。1.5%琼脂凝胶电泳检测反应产物，扩增人TNFα基因引物为，上游引物5′-CGGGACGTGGAG-CTGGCCGAGGAG，下游引物3′-CACCAGCTGGTTATC-TCTCAGCTC。
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2.细胞体外扩增情况的观察：以5×104细胞/孔接种于24孔培养板中，每天取3孔，0.2%台酚蓝染色，计算取平均值，绘制生长曲线。
3.统计学处理：差异显著性检验采用χ2检验。
二、结果
1转染TNFα基因的细胞克隆建和表达：培养瓶中未转染TNFα基因细胞由于不能表达新霉素磷酸转移酶II(NPT II)，经过G418筛选14d被杀死，转导TNFα基因的细胞在含有0.3mg/mlG418的培养瓶中扩增形成稳定的克隆.PC3-TNFα的细胞培养5d后,未转染和转染空载体的胰腺癌细胞培养上清液中TNFα会计师极低,而染TNFα基因胰泉癌细胞培养液上精液中TNFα的含量时显增高.未转染的TNFα胰尕癌细胞培养上精液中TNFα活性仅10U/ml,而转染细胞的上精液中TNFα活性250U/ml,是对照组的25倍.
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2 外源基因检测:采用特异的TNFα引物,通过RT-PCR反应，发现未转染TNFα基因的胰尕癌细胞中无明显TNFα的mRNA，而转染后的胰腺癌克隆细胞中，电泳中有TNFαmRNA有特异性打带波检测，证实外源性TNFα经逆转录病毒载体转染，已有mRNA的表达(图1)。
3.转染TNFα基因的胰腺癌细胞生长抑制：转染TNFα基因的胰腺癌细胞2-3d时其细胞生长差异不明显，但5-6d后转染TNFα基因的胰腺癌细胞增殖速度明显下降比较差异有显著意义(表1P<0.05)。
M1:PCR标记；1、3：分别为转染胰腺癌细胞克隆电泳，出现712bp特异条带；M2：Promega的阳性对照，扩增产物为644bp；2：未转染胰腺癌细胞
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图1 PC3/TNFα细胞TNFαmRNA的RT-PCR分析
表1 不同时间PC-3转染TNF细胞抑制水平(细胞数×104个/ml) 组别
1 d
3 d
5 d
7 d
9 d
11 d
13 d
15 d
未转染
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1
2.3
2.9
8
55
68
74
79
转染
1
1.15
1.8
2.8
8
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15.3
18.6
17.9
4.TNFα的活性测定：PC3/TNFα的上清和PC-3细胞上清TNFα活性比较，PC-3/TNFα对L929细胞裂解率70%，标准TNFα的裂解率为90%，而PC-3上清对L929细胞似乎无裂解作用(图2)。
图2 TNF的活性分析
三、讨论
TNFα是一个强大的免疫调节因子，可介导T细胞和非T细胞的免疫反应，可影响肿瘤细胞的生长，可刺激纤维母细胞的生长，对肿瘤细胞有分化和细胞毒作用[2]。晚近研究表明胰腺癌的生物行为与细胞因子参与有关[3]，利用逆转录病毒载体将TNFα基因转入人胰腺癌细胞，使其分泌有生物活性的TNFα，以期望其对胰腺癌细胞产生抑制作用。
, 百拇医药
本研究发现，人胰腺癌细胞能被TNFα基因转染，RT-PCR结果表明目的基因均有转录行为发生，重要的是发现TNFα基因转染的胰腺癌细胞增殖能力降低。我们认为TNFα对转染的胰腺癌细胞有直接的抗增殖作用，即产生异化作用，通过转基因的方法，将外源性基因TNFα转入胰腺癌细胞后利用胰腺癌细胞本身生长无序性和失控状态，表达出对自身有毒性作用的TNFα导致胰腺癌细胞的逐渐死亡。有学者认为TNFα可表现为通过抑制DNA合成的抗增殖效应，同时TNFα能增强肿瘤免疫性，能上调MHC Ⅰ，Ⅱ类分子，致瘤性降低或消失。所以细胞因子基因转导可以增强瘤细胞的免疫原性[4]，刺激机体产生特异的抗肿瘤免疫，后者可能是阻遏基因转导瘤细胞体内生长及转移的重要机制。由此可见，TNFα基因修饰人胰腺癌细胞的建立，为进一步研究细胞的免疫原性及开展胰腺癌肿瘤疫苗的临床研究奠定基础。
, 百拇医药
参考文献
1，Ohira T, Ohe Y, Heike Y, et al. Genetherapy for Lewis lung carcinoma with tumor necrosis factor and Interleukin 2 cDNAs cotransfacted Sublin. Gene Ther, 1994，1: 269-275.
2，Walther W, Stein U, Pteil D. Gene transfer of human TNFα into glioblastoma cells permits modulation of mdr 1 expression and potentiation of chemosensitivity. Int J Cancer, 1995, 61: 832-839.
3，Kimnra-M, Tagawa M, Takenaga et al. Loss of tumorigenition of human pancreatic carcinoma cells engineered to produce interleukin-2 or interleukin-4 in nude mice. A potentiality for cancer gene therapy. Cancer-lett, 1998,128:47-53.
4，Sato-T, Yamanchi-N, Sasaki-H, et al. An apoptosis-inducing gene of pancreatic cancer with a combination of 55-kDa tumor necrosis factor (TNFα) receptor gene tranfection and mutein TNFα administration. Cancer Res, 1998,58 : 1677-1683.
(收稿日期：1999-08-13), http://www.100md.com
单位：200040 上海医科大学华山医院胰腺癌诊治中心外科
关键词：
中华医学杂志000427 尽管胰腺癌手术、放疗和化疗有了新进展，但胰腺癌的预后仍很差。利用基因工程技术，将细胞因子基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗，已成为肿瘤生物治疗中的一项重要手段[1]。肿瘤坏死因子(TNFα)具有多方面的抗肿瘤效应，尤以激发或增强宿主抗肿瘤免疫应答最为重要。但TNFα可被机体很快清除，并会造成严重的全身不良反应，直接应用重组TNFα治疗胰腺癌的效果不理想。TNFα基因治疗胰腺癌正受到重视。我们利用逆转录病毒载体MoMLV，将TNFα基因转录致人胰腺癌细胞，经G418抗性筛选建立基因转导克隆后，在体外进行分子生物学鉴定，为进一步研究TNFα基因修饰人胰腺癌细胞的免疫原性奠定了基础。
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一、材料和方法
1.细胞培养和基因转染： 人胰腺癌细胞购自北京协和医院，为人胰腺癌细胞系PC-3。RPMI1640(GIBCO BRL)加体积分数为0.1小牛血清(上海生化所)培养。逆转录病毒载体PL(hTNFα)SN含有EcoRI和BamH1位点。外源性基因SV40为启动因子，NeoR为标志基因，TNFα为目标基因。质粒经大肠杆菌扩增，C3CL超离心纯化，采用磷酸钙共沉淀法转染包装细胞系PA317，收集含有TNFα基因复制缺陷型逆转录病毒上清液转染PC3胰腺癌细胞，用G418筛选有抗性的细胞克隆。随机挑选细胞克隆1号和4号转染胰腺癌细胞，进行后继试验，检测TNFα的活性蛋白表达和mRNA的表达。细胞接种量1×105个，在含5 ml培养液的培养瓶中生长5 d，使用MedgenixTNFα ELISA kit(Medgenix Diagnostic S.A)，检测细胞培养上清液中TNFα含量。利用TNFα对放射菌素D处理后的小鼠成纤维肉瘤细胞L929的溶解作用，检测TNFα的生物活性。按异硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提细胞总RNA。RT-PCR法分别测定转染和未转染的胰腺癌细胞中TNFα mRNA的表达。选用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Promega A1250)。1.5%琼脂凝胶电泳检测反应产物，扩增人TNFα基因引物为，上游引物5′-CGGGACGTGGAG-CTGGCCGAGGAG，下游引物3′-CACCAGCTGGTTATC-TCTCAGCTC。
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2.细胞体外扩增情况的观察：以5×104细胞/孔接种于24孔培养板中，每天取3孔，0.2%台酚蓝染色，计算取平均值，绘制生长曲线。
3.统计学处理：差异显著性检验采用χ2检验。
二、结果
1转染TNFα基因的细胞克隆建和表达：培养瓶中未转染TNFα基因细胞由于不能表达新霉素磷酸转移酶II(NPT II)，经过G418筛选14d被杀死，转导TNFα基因的细胞在含有0.3mg/mlG418的培养瓶中扩增形成稳定的克隆.PC3-TNFα的细胞培养5d后,未转染和转染空载体的胰腺癌细胞培养上清液中TNFα会计师极低,而染TNFα基因胰泉癌细胞培养液上精液中TNFα的含量时显增高.未转染的TNFα胰尕癌细胞培养上精液中TNFα活性仅10U/ml,而转染细胞的上精液中TNFα活性250U/ml,是对照组的25倍.
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2 外源基因检测:采用特异的TNFα引物,通过RT-PCR反应，发现未转染TNFα基因的胰尕癌细胞中无明显TNFα的mRNA，而转染后的胰腺癌克隆细胞中，电泳中有TNFαmRNA有特异性打带波检测，证实外源性TNFα经逆转录病毒载体转染，已有mRNA的表达(图1)。
3.转染TNFα基因的胰腺癌细胞生长抑制：转染TNFα基因的胰腺癌细胞2-3d时其细胞生长差异不明显，但5-6d后转染TNFα基因的胰腺癌细胞增殖速度明显下降比较差异有显著意义(表1P<0.05)。
M1:PCR标记；1、3：分别为转染胰腺癌细胞克隆电泳，出现712bp特异条带；M2：Promega的阳性对照，扩增产物为644bp；2：未转染胰腺癌细胞
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图1 PC3/TNFα细胞TNFαmRNA的RT-PCR分析
表1 不同时间PC-3转染TNF细胞抑制水平(细胞数×104个/ml) 组别
1 d
3 d
5 d
7 d
9 d
11 d
13 d
15 d
未转染
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1
2.3
2.9
8
55
68
74
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转染
1
1.15
1.8
2.8
8
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15.3
18.6
17.9
4.TNFα的活性测定：PC3/TNFα的上清和PC-3细胞上清TNFα活性比较，PC-3/TNFα对L929细胞裂解率70%，标准TNFα的裂解率为90%，而PC-3上清对L929细胞似乎无裂解作用(图2)。
图2 TNF的活性分析
三、讨论
TNFα是一个强大的免疫调节因子，可介导T细胞和非T细胞的免疫反应，可影响肿瘤细胞的生长，可刺激纤维母细胞的生长，对肿瘤细胞有分化和细胞毒作用[2]。晚近研究表明胰腺癌的生物行为与细胞因子参与有关[3]，利用逆转录病毒载体将TNFα基因转入人胰腺癌细胞，使其分泌有生物活性的TNFα，以期望其对胰腺癌细胞产生抑制作用。
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本研究发现，人胰腺癌细胞能被TNFα基因转染，RT-PCR结果表明目的基因均有转录行为发生，重要的是发现TNFα基因转染的胰腺癌细胞增殖能力降低。我们认为TNFα对转染的胰腺癌细胞有直接的抗增殖作用，即产生异化作用，通过转基因的方法，将外源性基因TNFα转入胰腺癌细胞后利用胰腺癌细胞本身生长无序性和失控状态，表达出对自身有毒性作用的TNFα导致胰腺癌细胞的逐渐死亡。有学者认为TNFα可表现为通过抑制DNA合成的抗增殖效应，同时TNFα能增强肿瘤免疫性，能上调MHC Ⅰ，Ⅱ类分子，致瘤性降低或消失。所以细胞因子基因转导可以增强瘤细胞的免疫原性[4]，刺激机体产生特异的抗肿瘤免疫，后者可能是阻遏基因转导瘤细胞体内生长及转移的重要机制。由此可见，TNFα基因修饰人胰腺癌细胞的建立，为进一步研究细胞的免疫原性及开展胰腺癌肿瘤疫苗的临床研究奠定基础。
, 百拇医药
参考文献
1，Ohira T, Ohe Y, Heike Y, et al. Genetherapy for Lewis lung carcinoma with tumor necrosis factor and Interleukin 2 cDNAs cotransfacted Sublin. Gene Ther, 1994，1: 269-275.
2，Walther W, Stein U, Pteil D. Gene transfer of human TNFα into glioblastoma cells permits modulation of mdr 1 expression and potentiation of chemosensitivity. Int J Cancer, 1995, 61: 832-839.
3，Kimnra-M, Tagawa M, Takenaga et al. Loss of tumorigenition of human pancreatic carcinoma cells engineered to produce interleukin-2 or interleukin-4 in nude mice. A potentiality for cancer gene therapy. Cancer-lett, 1998,128:47-53.
4，Sato-T, Yamanchi-N, Sasaki-H, et al. An apoptosis-inducing gene of pancreatic cancer with a combination of 55-kDa tumor necrosis factor (TNFα) receptor gene tranfection and mutein TNFα administration. Cancer Res, 1998,58 : 1677-1683.
(收稿日期：1999-08-13), http://www.100md.com