食管癌多药耐药基因和多药耐药相关蛋白基因的研究
作者：王延明 陈志霞 王爱民 李险波 赵玉农 藏玉林
单位：王延明 陈志霞 李险波 赵玉农 藏玉林(河北保定二五二医院胸心外科,河北 保定 071000)；王爱民(河北保定市二五二医院实验中心，河北 保定 071000)
关键词：食管癌；多药耐药基因；多药耐药相关蛋白基因；逆转录-多聚酶链反应
癌症000420
【摘要】目的：探讨食管癌组织中多药耐药基因(mdr-1)和多药耐药相关蛋白基因(mrp)表达的意义。方法：运用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测了32例食管癌患者的癌组织标本及癌旁组织中mdr-1和mrp表达，分析其与肿瘤分化程度、浸润深度及淋巴结转移的关系。结果：32例食管癌组织中mdr-1和mrp表达的阳性率均高于癌旁组织(P<0.01，P<0.025)，两基因的表达水平也显著高于癌旁组织(P<0.001，P<0.001)；在中低分化食管癌和肿瘤侵犯深肌层或纤维层时，mdr-1、mrp表达水平均高于高分化肿瘤和癌肿侵犯浅肌层以内者(P<0.05，P<0.01)。结论：食管癌组织中存在着原发性多药耐药性，mdr-1和mrp表达增高可能提示肿瘤的分化不良，并可反映肿瘤的浸润深度。
, http://www.100md.com
中图分类号：R735.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0353-03
Clinical study of mdr- 1 and mrp gene expression in patients with esophagus cancer
WANG Yan- ming CHEN Zhi- xia
(Department of Thoracic Surgery, 252 Hospital of PLA, Baoding 071000, P.R. China)
WANG Ai- min
(Central Laboratory, 252 Hospital of PLA, Baoding 071000,P.R.China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective： To explore the expression of mdr- 1 and mrp in tissue of esophagus cancer and analyse the relationship between their expression and tumor infiltration and lymphatic metastasis. Methods： Using reverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR) technique, we examined the positive expression of mdr- 1 and mrp, and their levels of gene expression in 32 esophagus cancer samples. Results： The positive rates of mdr- 1 and mrp genes expression were 62.5% and 53.1% respectively in esophagus cancer and 28.1% and 25% respectively in the surrounded normal tissue. The expression rates in cancer tissues were much higher than that in the surrounded normal tissue (P <0.01,P< 0.025),and the levels of mdr- 1 and mrp gene expression were also higher in cancer tissue than that in surrounded normal tissue (0.66∶ 0.27 and 0.46∶ 0.23, P< 0.001 and P< 0.001). The levels of mdr- l and mrp expression in well- differentiated cancer were lower than that in poorly differentiated cancer (P< 0.05). In cancer with deep- muscle and fibro- membrane infiltration,the levels of mdr- l and mrp expression were also higher in comparison with invasion to shallow- muscle. Conclusion： Esophagus carcinomas express primary multidrug resistance genes. High expression levels of mdr- l and mrp might indicate undifferentiated tumor and reflect deeply infiltrating of the tumor. Key words： Esophagus cancer; mdr- 1; mrp gene; RT- PCR
, 百拇医药
近年来，多药耐药(multidrugresistance,MDR)机制是人们研究的热点问题，对肿瘤的多药耐药基因(mdr-l)的报道较多，但对多药耐药相关蛋白基因(mrp)的研究较少。1997年1月～1998年6月,我们采用逆转录-多聚酶链反应(RT-RCR)方法，检测了32例食管癌患者的癌组织及其癌旁组织中mdr-l和mrp表达，并对其与肿瘤分化程度、浸润深度及淋巴结转移的关系进行探讨。
1 材料与方法
1.1临床资料
32例食管癌中，男23例，女9例，年龄在44～72岁，平均60.5岁。术前由胃镜活检组织病理确诊，均未行任何形式的抗肿瘤治疗。术中取癌组织及癌旁组织各1块液氮保存。
1.2主要试剂及仪器
AMV逆转录酶，RNA酶抑制剂均购自Promega公司。毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品。
, 百拇医药
1.3RNA提取
按照Chomczynski[1]报道的方法提取组织总RNA，采用分光度法测定总RNA含量及纯度。
1.4共扩增-PCR
按照NoonanKE[2]等的方法进行，mdr-l、mrp和β-actin三对引物的设计均参照Genebank的资料，mdr-1、mrp分别与β-actin进行共扩增PCR。
1.5PCR扩增产物定量
mdr-l、mrp、β-actin的扩增产物分别为536bp、336bp和234bp，用凝胶成像系统进行定量分析，mdr-l或mrp与β-actin的比值表示mdr-l、mrp表达的相对表达水平。
, 百拇医药 1.6统计学方法
mdr-l、mrp表达的阳性率间用χ2检验；mdr-l、mrp表达水平用表示，t检验进行处理。
2 结果
2.1mdr-1和mrp的表达见表1
从表1可知，32例食管癌标本中mdr-1表达的阳性率及表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01，P<0.001)。mrp表达的阳性率及表达水平也均高于癌旁组织(P<0.025，P<0.01)
表1 32例食管癌及癌旁组织中mdr-1和mrp的表达 组别
阳性例数
(%)
P值
, 百拇医药
mrpmRNA表达水平
(mdr-1/β-actin)
P值
阳性例数
(%)
P值
mdr-1mRNA表达水平
(mdr-1/β-actin)
P值
癌组织
20(62.5)
0.66±0.29
, 百拇医药
17(53.1)
0.46±0.31
癌旁组织
9(28.1)
<0.001
0.27±0.08
<0.001
8(25)
<0.025
0.23±0.07
<0.01
表2 食管癌中mdr-1,mrp表达与临床病理特征 组别
, 百拇医药
n
mdr-1
mrp
阳性率(%)
表达水平
(mdr1/β-actin)
阳性率(%)
表达水平
(mdr1/β-actin)
分化程度
高分化
17
52.9(9/17)
, http://www.100md.com
0.44±0.15
47(8/17)
0.32±0.09
中低分化
15
73.3(11/15)
0.68±0.29*
60(9/15)
0.48±0.16*
浸润深度
浅肌层以内
6
, 百拇医药
50(3/6)
0.36±0.11
33.3(2/6)
0.25±0.07
深肌层或纤维层
26
65.4(17/26)
0.71±0.20**
57.7(15/26)
0.49±0.16*
淋巴结转移
, 百拇医药
有
19
68.4(13/19)
0.62±0.25
57.9(11/19)
0.41±0.14
无
13
53.8(7/13)
0.64±0.18
46.2(6/13)
0.32±0.21
, http://www.100md.com
注：同组同单位数据比较*P<0.05**P<0.001mdr-1
2.2食管癌组织、癌旁组织中RT-PCR产物的凝胶电泳结果(见图1、2)
图1食管癌组织及癌旁组织中mdr-1的表达
第1、3、5道为癌组织标本，第2、4、6道为相应的癌旁组织标本，第7道为分子量标准，从大到小分别1000bp、750bp、500bp、300bp、150bp和50bp。
图2食管癌组织及癌旁组织中mrp表达
第1、3道为癌组织标本，第2、4道为相应的癌旁组织标本，第5道为分子量标准，从大到小分别1000bp、750bp、500bp、300bp、150bp和50bp。
, http://www.100md.com
2.3食管癌组织中mdr-l和mrp基因表达与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移的关系见表2
从表2可见，食管癌分化不良和肿瘤浸润较深时，mdr-1和mrp表达增高，在中低分化食管癌及癌肿浸润深肌层或纤维层者两基因表达水平显著高于高分化食管癌和肿瘤仅侵犯浅肌层以内者(P<0.05)；mdr-1和mrp表达与淋巴结转移与否无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
随着分子生物学技术发展，人们对肿瘤多药耐药性(MDR)的产生机制进行了多方面研究，而讨论最多的是作为MDR主要表型的多药耐药基因(mdr-1)和多药耐药相关蛋白基因(mrp)。本研究对32例未经任何药物化疗的食管癌组织、癌旁组织标本中mdr-1、mrp的表达进行检测，结果表明，食管癌组织中mdr-1、mrp的阳性率与相应癌旁组织比较具有显著差异(P<0.01、P<0.025)。国外有报道[3]，起源于肝、肾及消化道组织的肿瘤具有原发的MDR。本组食管癌患者术前未接受任何形式的抗肿瘤化疗，而在肿瘤组织中呈现mdr-1和mrp表达增高，表明食管癌组织中存在原发性MDR，并高于其他肿瘤的阳性比率[4，5]。这可能是人们公认的食管癌对化疗效果不好的原因之一。同时，我们也发现mdr-1和mrp表达具有一致性，本组mdr-1阳性者，mrp阳性占75%(15/20)；mrp阳性占94%(16/17)为此推测食管癌组织中mdr-1和mrp的共同表达可能具有某种内在的联系，而在多药耐药中起着协同作用。有研究认为[6]，肿瘤的原发性MDR多发生于分化不良型肿瘤中。分析本组资料，中低分化食管癌的mdr-1和mrp表达水平高于高分化食管癌(P<0.05)，符合上述报道。同时我们也发现肿瘤侵犯深肌层或纤维膜时mdr-1、mrp表达阳性率增高，两基因的表达水平与肿瘤局限于食管浅肌层以内者比较差异显著(P<0.05)，提示mdr-1和mrp的表达增高与肿瘤的浸润深度有关，肿瘤一旦侵犯食管深肌层，两基因表达即明显增高。而在淋巴结转移方面，虽然本组淋巴结转移病例中mdr-1、mrp阳性率高于无淋巴转移者，但其差异无统计学意义(P>0.05)。
, 百拇医药
通讯作者 王延明
[参考文献]
[1]Chomczynski P, Sacchi N.Single- step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol- chloroform extraction [J]. Anal Biochem, 1987,162： 156～ 159.
[2]Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR- 1(multidrug resistance)gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. J Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87： 7160～ 7164.
, 百拇医药
[3]Linn SC, Pinedo HM, van Ark- Otle J, et al. Expression of drug resistance proteins in breast cancer, in relation to chemotherapy[J]. Int J Cancer, 1997,71(5)： 787～ 795.
[4]Zhou C,Zittoun R, Marie JP. Expression of multidrug resistance- associated protein(MRP) and multidrug resistance(MDR1) genes in acute myeloid leukemia [J]. Leukemia,1995,9： 1661～ 1666.
[5]Broxterman HJ, Lankelma J, Pined HM. How to probe clinical tumor samples for P- glycoprotein and multidrug resistance associated protein [J]. Eur J Cancer, 1996, 32A： 1024～ 1033.
[6]陈金联，吴云林，SusanPCC.肿瘤耐药相关蛋白MRP在胃癌中的表达及对预后的影响[J].中华消化杂志，1997，17(3)：183.
收稿日期：1999-03-16
修回日期：1999-06-03, 百拇医药
单位：王延明 陈志霞 李险波 赵玉农 藏玉林(河北保定二五二医院胸心外科,河北 保定 071000)；王爱民(河北保定市二五二医院实验中心，河北 保定 071000)
关键词：食管癌；多药耐药基因；多药耐药相关蛋白基因；逆转录-多聚酶链反应
癌症000420
【摘要】目的：探讨食管癌组织中多药耐药基因(mdr-1)和多药耐药相关蛋白基因(mrp)表达的意义。方法：运用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测了32例食管癌患者的癌组织标本及癌旁组织中mdr-1和mrp表达，分析其与肿瘤分化程度、浸润深度及淋巴结转移的关系。结果：32例食管癌组织中mdr-1和mrp表达的阳性率均高于癌旁组织(P<0.01，P<0.025)，两基因的表达水平也显著高于癌旁组织(P<0.001，P<0.001)；在中低分化食管癌和肿瘤侵犯深肌层或纤维层时，mdr-1、mrp表达水平均高于高分化肿瘤和癌肿侵犯浅肌层以内者(P<0.05，P<0.01)。结论：食管癌组织中存在着原发性多药耐药性，mdr-1和mrp表达增高可能提示肿瘤的分化不良，并可反映肿瘤的浸润深度。
, http://www.100md.com
中图分类号：R735.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0353-03
Clinical study of mdr- 1 and mrp gene expression in patients with esophagus cancer
WANG Yan- ming CHEN Zhi- xia
(Department of Thoracic Surgery, 252 Hospital of PLA, Baoding 071000, P.R. China)
WANG Ai- min
(Central Laboratory, 252 Hospital of PLA, Baoding 071000,P.R.China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective： To explore the expression of mdr- 1 and mrp in tissue of esophagus cancer and analyse the relationship between their expression and tumor infiltration and lymphatic metastasis. Methods： Using reverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR) technique, we examined the positive expression of mdr- 1 and mrp, and their levels of gene expression in 32 esophagus cancer samples. Results： The positive rates of mdr- 1 and mrp genes expression were 62.5% and 53.1% respectively in esophagus cancer and 28.1% and 25% respectively in the surrounded normal tissue. The expression rates in cancer tissues were much higher than that in the surrounded normal tissue (P <0.01,P< 0.025),and the levels of mdr- 1 and mrp gene expression were also higher in cancer tissue than that in surrounded normal tissue (0.66∶ 0.27 and 0.46∶ 0.23, P< 0.001 and P< 0.001). The levels of mdr- l and mrp expression in well- differentiated cancer were lower than that in poorly differentiated cancer (P< 0.05). In cancer with deep- muscle and fibro- membrane infiltration,the levels of mdr- l and mrp expression were also higher in comparison with invasion to shallow- muscle. Conclusion： Esophagus carcinomas express primary multidrug resistance genes. High expression levels of mdr- l and mrp might indicate undifferentiated tumor and reflect deeply infiltrating of the tumor. Key words： Esophagus cancer; mdr- 1; mrp gene; RT- PCR
, 百拇医药
近年来，多药耐药(multidrugresistance,MDR)机制是人们研究的热点问题，对肿瘤的多药耐药基因(mdr-l)的报道较多，但对多药耐药相关蛋白基因(mrp)的研究较少。1997年1月～1998年6月,我们采用逆转录-多聚酶链反应(RT-RCR)方法，检测了32例食管癌患者的癌组织及其癌旁组织中mdr-l和mrp表达，并对其与肿瘤分化程度、浸润深度及淋巴结转移的关系进行探讨。
1 材料与方法
1.1临床资料
32例食管癌中，男23例，女9例，年龄在44～72岁，平均60.5岁。术前由胃镜活检组织病理确诊，均未行任何形式的抗肿瘤治疗。术中取癌组织及癌旁组织各1块液氮保存。
1.2主要试剂及仪器
AMV逆转录酶，RNA酶抑制剂均购自Promega公司。毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品。
, 百拇医药
1.3RNA提取
按照Chomczynski[1]报道的方法提取组织总RNA，采用分光度法测定总RNA含量及纯度。
1.4共扩增-PCR
按照NoonanKE[2]等的方法进行，mdr-l、mrp和β-actin三对引物的设计均参照Genebank的资料，mdr-1、mrp分别与β-actin进行共扩增PCR。
1.5PCR扩增产物定量
mdr-l、mrp、β-actin的扩增产物分别为536bp、336bp和234bp，用凝胶成像系统进行定量分析，mdr-l或mrp与β-actin的比值表示mdr-l、mrp表达的相对表达水平。
, 百拇医药 1.6统计学方法
mdr-l、mrp表达的阳性率间用χ2检验；mdr-l、mrp表达水平用表示，t检验进行处理。
2 结果
2.1mdr-1和mrp的表达见表1
从表1可知，32例食管癌标本中mdr-1表达的阳性率及表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01，P<0.001)。mrp表达的阳性率及表达水平也均高于癌旁组织(P<0.025，P<0.01)
表1 32例食管癌及癌旁组织中mdr-1和mrp的表达 组别
阳性例数
(%)
P值
, 百拇医药
mrpmRNA表达水平
(mdr-1/β-actin)
P值
阳性例数
(%)
P值
mdr-1mRNA表达水平
(mdr-1/β-actin)
P值
癌组织
20(62.5)
0.66±0.29
, 百拇医药
17(53.1)
0.46±0.31
癌旁组织
9(28.1)
<0.001
0.27±0.08
<0.001
8(25)
<0.025
0.23±0.07
<0.01
表2 食管癌中mdr-1,mrp表达与临床病理特征 组别
, 百拇医药
n
mdr-1
mrp
阳性率(%)
表达水平
(mdr1/β-actin)
阳性率(%)
表达水平
(mdr1/β-actin)
分化程度
高分化
17
52.9(9/17)
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0.44±0.15
47(8/17)
0.32±0.09
中低分化
15
73.3(11/15)
0.68±0.29*
60(9/15)
0.48±0.16*
浸润深度
浅肌层以内
6
, 百拇医药
50(3/6)
0.36±0.11
33.3(2/6)
0.25±0.07
深肌层或纤维层
26
65.4(17/26)
0.71±0.20**
57.7(15/26)
0.49±0.16*
淋巴结转移
, 百拇医药
有
19
68.4(13/19)
0.62±0.25
57.9(11/19)
0.41±0.14
无
13
53.8(7/13)
0.64±0.18
46.2(6/13)
0.32±0.21
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注：同组同单位数据比较*P<0.05**P<0.001mdr-1
2.2食管癌组织、癌旁组织中RT-PCR产物的凝胶电泳结果(见图1、2)
图1食管癌组织及癌旁组织中mdr-1的表达
第1、3、5道为癌组织标本，第2、4、6道为相应的癌旁组织标本，第7道为分子量标准，从大到小分别1000bp、750bp、500bp、300bp、150bp和50bp。
图2食管癌组织及癌旁组织中mrp表达
第1、3道为癌组织标本，第2、4道为相应的癌旁组织标本，第5道为分子量标准，从大到小分别1000bp、750bp、500bp、300bp、150bp和50bp。
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2.3食管癌组织中mdr-l和mrp基因表达与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移的关系见表2
从表2可见，食管癌分化不良和肿瘤浸润较深时，mdr-1和mrp表达增高，在中低分化食管癌及癌肿浸润深肌层或纤维层者两基因表达水平显著高于高分化食管癌和肿瘤仅侵犯浅肌层以内者(P<0.05)；mdr-1和mrp表达与淋巴结转移与否无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
随着分子生物学技术发展，人们对肿瘤多药耐药性(MDR)的产生机制进行了多方面研究，而讨论最多的是作为MDR主要表型的多药耐药基因(mdr-1)和多药耐药相关蛋白基因(mrp)。本研究对32例未经任何药物化疗的食管癌组织、癌旁组织标本中mdr-1、mrp的表达进行检测，结果表明，食管癌组织中mdr-1、mrp的阳性率与相应癌旁组织比较具有显著差异(P<0.01、P<0.025)。国外有报道[3]，起源于肝、肾及消化道组织的肿瘤具有原发的MDR。本组食管癌患者术前未接受任何形式的抗肿瘤化疗，而在肿瘤组织中呈现mdr-1和mrp表达增高，表明食管癌组织中存在原发性MDR，并高于其他肿瘤的阳性比率[4，5]。这可能是人们公认的食管癌对化疗效果不好的原因之一。同时，我们也发现mdr-1和mrp表达具有一致性，本组mdr-1阳性者，mrp阳性占75%(15/20)；mrp阳性占94%(16/17)为此推测食管癌组织中mdr-1和mrp的共同表达可能具有某种内在的联系，而在多药耐药中起着协同作用。有研究认为[6]，肿瘤的原发性MDR多发生于分化不良型肿瘤中。分析本组资料，中低分化食管癌的mdr-1和mrp表达水平高于高分化食管癌(P<0.05)，符合上述报道。同时我们也发现肿瘤侵犯深肌层或纤维膜时mdr-1、mrp表达阳性率增高，两基因的表达水平与肿瘤局限于食管浅肌层以内者比较差异显著(P<0.05)，提示mdr-1和mrp的表达增高与肿瘤的浸润深度有关，肿瘤一旦侵犯食管深肌层，两基因表达即明显增高。而在淋巴结转移方面，虽然本组淋巴结转移病例中mdr-1、mrp阳性率高于无淋巴转移者，但其差异无统计学意义(P>0.05)。
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通讯作者 王延明
[参考文献]
[1]Chomczynski P, Sacchi N.Single- step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol- chloroform extraction [J]. Anal Biochem, 1987,162： 156～ 159.
[2]Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR- 1(multidrug resistance)gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. J Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87： 7160～ 7164.
, 百拇医药
[3]Linn SC, Pinedo HM, van Ark- Otle J, et al. Expression of drug resistance proteins in breast cancer, in relation to chemotherapy[J]. Int J Cancer, 1997,71(5)： 787～ 795.
[4]Zhou C,Zittoun R, Marie JP. Expression of multidrug resistance- associated protein(MRP) and multidrug resistance(MDR1) genes in acute myeloid leukemia [J]. Leukemia,1995,9： 1661～ 1666.
[5]Broxterman HJ, Lankelma J, Pined HM. How to probe clinical tumor samples for P- glycoprotein and multidrug resistance associated protein [J]. Eur J Cancer, 1996, 32A： 1024～ 1033.
[6]陈金联，吴云林，SusanPCC.肿瘤耐药相关蛋白MRP在胃癌中的表达及对预后的影响[J].中华消化杂志，1997，17(3)：183.
收稿日期：1999-03-16
修回日期：1999-06-03, 百拇医药