多药耐药基因mdr-1在肝门部胆管癌组织中的表达及其意义
作者：陈汝福 邹声泉 李志花 衣龙海
单位：陈汝福 邹声泉(同济医科大学附属同济医院普外科，湖北 武汉 430030)；李志花 衣龙海(山东省肿瘤防治研究院，山东 济南 251007)
关键词：肝门部胆管癌；多药耐药基因；RT-PCR
癌症000419
【摘要】目的：检测肝门部胆管癌新鲜组织中多药耐药基因(mdr-1)mRNA表达，探讨其与肝门部胆管癌临床病理间的关系。方法：应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)对26例术前未作治疗的肝门部胆管癌，12例正常胆管组织的mdr-1mRNA表达进行了检测，并与癌组织的分化程度、病理类型、部位、浸润转移作对比研究。结果：26例肝门部胆管癌组织中mdr-1mRNA阳性表达率为65.4%(17/26)，正常胆管组织表达率为8.3%(1/12)，二者差异有显著性(P<0.01)。mdr-1mRNA阳性表达与肝门部胆管癌的分化程度、发生部位、病理类型、浸润转移无关(P>0.05)。结论：肝门部胆管癌组织中mdr-1mRNA的高表达可作为肝门部胆管癌化疗耐药的指标。
, 百拇医药
中图分类号：R735.8 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0350-03
The expression of mdr-1 mRNA in hilar cholangiocarcinoma
CHEN Ru-fu
(Department of General Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030,P.R.China)
ZOU Sheng-quan
(Department of General Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030,P.R.China)
, 百拇医药
LI Zhi-hua
(Shandong Tumor Hospital and Institute, Jinan 251007, P.R. China)
【Abstract】 Objectives： To detect the levels of mdr- l gene experession in fresh untreated hilar cholangiocarcinoma tissues, and to investigate the correlation of mdr- 1 expression with current prognostic indicators of clinicopathology. Method： mdr- 1 mRNA expression of 26 cases untreated hilar cholangicarcinoma and 12 cases normal bile duct tissues were examined using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT- PCR). Results： mdr- 1 mRNA expression in tumor tissue was found in 65.4% (17/26) of the patients, whereas, 8.3% (1/12) was seen in normal bile duct (P<0.01).No correlation with differentiation, invassiveness, metastasis and staging, clinical typing, pathological type was found (P>0.05). Conclusion： Higher expression of mdr- 1 mRNA in hilar cholangiocarcinoma tissue might be served as an indicator for drug resistance in chemotherapy.
, 百拇医药
Key words： Hilar cholangiocarcinoma; mdr- 1 mRNA; RT- PCR
目前研究认为，mdr-1基因的扩增及其产物P-糖蛋白的过表达是化疗失败的重要原因之一[1]。肝门部胆管癌分子生物学研究发现[2]，该肿瘤的遗传性能不稳定，并且容易对化疗和放疗产生治疗耐受,但对其发生机制目前还不清楚。为了探讨肝门部胆管癌化疗不敏感的原因，我们对肝门部胆管癌组织及正常组织的mdr-1mRNA表达进行了研究。现报告如下。
1 材料与方法
1.1病例及组织标本
收集同济医院、山东省肿瘤医院、桂林医学院附院1996年9月～1998年6月手术切除的肝门部胆管癌组织标本26例，其中男16例，女10例，年龄38～73岁(中位年龄52.4岁)。BismuthⅠ型10例，Ⅱ型8例，Ⅲ型5例，Ⅳ型3例；组织学检查：管状腺癌10例，乳头状腺癌9例，未分化癌6例，粘液癌1例；分化程度：高分化13例，中分化6例，低分化7例，有淋巴结转移占61.5%(16/26)，nevin分级S1～S25例，S310例，S4～S511例。术后立即将肿瘤和癌周组织标本投入液氮，-80℃保存备用。
, http://www.100md.com
1.2试剂
mdr-1正向、反向引物、β2-M(β2-微球蛋白)正向、反向引物由上海生工生物公司合成。RNA抽提试剂盒购自promega公司。PCR扩增仪是美国产品(PTC-150-16型)。
1.3RT-PCR
异硫氰酸胍一步法抽提组织中总RNA。总RNA经紫外线分光光度定量，琼脂糖凝胶电泳鉴定。取3μgRNA用于逆转录实验。20μl反应体系包括：oligo(dt)0.1μg,RNasin20u，2mol/LdNTPs4μl，AMV5u，42℃1小时，95℃5分钟。2.5μl逆转录产物用于PCR40μl总体积包括dNTP10mol/L，正向、反向引物各为10pmol/L，Tag5u,mdr-1正向引物5'-GTACCCATCATTG-CAQATAGC-3'，反向引物5'-CAAACTTCTGC-TCCTGAGTC-3'。PCR反应条件为95℃50秒，56℃45秒；72℃50秒，32个循环。β2-M正向引物为5'-ACCCCCACTGA-AAAAGATGA-3'，反向引物5'-ATCTTCAAACC-TCCATGATG-3'。PCR产物经2%琼脂凝胶电泳，溴化乙锭染色，通过凝胶扫描仪进行DNA电泳条带和光量子强度分析，将mdr-1与β2-M比值作为mdr-1表达水平的参数，对mdr-1PCR产物相对定量。
, 百拇医药
1.4结果判断
阳性结果二条带为175bpmdr-1mRNA条带，另一条为120bpβ2-M条带。将mdr-1与β2M比值>0.1定为阳性。
1.5统计与分析方法
采用χ2检验，精确概率法。
2 结果
2.1肝门部胆管癌及正常组织中mdr-1mRNA表达
26例肝门部胆管癌和癌周组织中mdr-1mRNA表达率为65.4%(17/26)，正常胆管组织的阳性表达率为8.3%(1/12)，癌组织中表达率明显高于正常组织(P<0.01)(图1)。
, 百拇医药
图1肝门胆管癌中mdr-1mRNA表达
1.分子量标志2～6.mdr-1mRNA阳性表达
2.2mdr-1mRNA表达与肝门部胆管癌临床病理类型关系
mdr-1mRNA表达与肝门部胆管癌的分化程度、发生部位、病理类型、浸润转移均无关(P>0.05)，详见表1。
3 讨论
多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现抗药性的同时，对其他结构不同、作用部位不同的抗肿瘤药物也具有抗药性。多药耐药的肿瘤细胞的一个明显生化特征是mdr-1基因编码的P-gp过度表达，P-gp具有膜的药泵作用，它能逆浓度将细胞内多种mdr-1相关药物泵出细胞外，使细胞内药物蓄积减少，从而产生耐药[3]。定量检测分析mdr-1基因表达水平可说明病人抗药性的高低，从而判断预后，指导治疗。有关mdr-1mRNA在肝门部胆管癌中表达的研究，目前国内未见报道。
, 百拇医药
表1mdr-1mRNA表达与肝门部胆管癌临床病理关系 因素
n
mdr-1mRNA
P值
+
-
Bismuth
Ⅰ型
10
6
4
0.889
Ⅱ型
, 百拇医药
8
5
3
Ⅲ型
5
4
1
Ⅳ型
3
2
1
病理类型
乳头状腺癌
10
, 百拇医药
7
3
0.574
管状腺癌
9
6
3
未分化癌
6
4
2
粘液状癌
1
0
, 百拇医药
1
病理分级
高分化癌
13
8
5
0.904
中分化癌
9
4
2
低分化癌
7
5
, http://www.100md.com
2
Nevinw分期
S1S2
5
3
2
0.917
S3
10
7
3
S4S5
11
, http://www.100md.com 7
4
淋巴转移
有
16
10
6
0.696
无
10
7
3
P值为临床病理各因素与mdr-1基因阳性表达率间的比较，P>0.05表明mdr-1mRNA表达与肝门部胆管癌各临床病理间无相关性。
, 百拇医药
RT-PCR方法检测mdr-1mRNA不仅具有相对敏感、特异、方便、快速特点，同样具有通过mdr-1与β2-M比值作为mdr-1表达水平的参数，对mdr-1PCR产物相对定量的优点[4]。本组实验显示，未经治疗的肝门部胆管癌组织中具有mdr-1基因表达率为65.4%，而食道癌组织中mdr-1基因表达率为37%[5]，白血病33.3%[6]、乳癌34.3%[7]，由此可见，未经治疗的肝门部胆管癌组织中mdr-1有先天性高表达。本研究从分子水平证实了肝门部胆管癌化疗效果不佳的原因。
Gottesman[8]认为mdr-1基因过度表达，不仅涉及到耐药，而且也是癌细胞生物学行为进一步恶化的指标。但本实验发现，mdr-1基因表达与肝门部胆管癌的病理类型、分化程度、部位及浸润转移无相关性(χ2，精确概率法计算)，说明mdr-1表达阳性不能反应肿瘤的分化和浸润程度，只能代表其耐药性的强弱，因此，在选择化疗方案时应避免应用mdr能抗药的药物。
, 百拇医药
研究肝门部胆管癌多药耐药的意义在于探索mdr-1表达与其临床耐药的关系，指导化疗方案设计、预测化疗结果、判断预后及克服MDR现象。本实验从分子水平解释了肝门部胆管癌对化疗不敏感的原因，为指导选药，提高在肝门部胆管癌综合治疗中化疗的疗效奠定了基础。有关mdr-1mRNA表达是否为肝门部胆管癌恶性行为的指标，尚需扩大病历数量，定期对病人远期随访等长期深入研究才能定论。
通讯作者：陈汝福 Tel:86-27-83646264 E-mail:chenrufu@hotmail.com
[参考文献]
[1]Broxterman HJ, Lankema J, Pinedo HM. How to probe clinical tumor samples for P- glycoprotein and multidrug resistance associated protein [J]. Eur J Cancer, 1996,32 A： 1024～ 1033. 陈汝福，邹声泉。肝门部胆管癌分子生物学研究新近展[J].中华肝胆外科杂志，1998，4：127～128.
, 百拇医药
[2]Biedler JL. Genetic aspects of multdrug resistance [J]. Cancer, 1992, 70： 1799～ 1809.
[3]Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR- 1 multidrug resistance gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. Proc Natl Acad sci USA, 1990,80： 7160～ 7164.
[4]陈克能，刑海平，程帮昌，等.食道癌多药耐药基因表达与病理学的关系[J].中华医学杂志，1998，78：462～464.
[5]Schneider E, Cowan KH, Bader H, et al. Increased expression of the multidrug resistance associated protein were in relapsed acute lukmia [J]. Blood, 1995,85： 186～ 191.
[6]刘晓晴，石成华，宋三秦，等.RT-PCR方法检测临床乳腺癌组织的多药耐药基因表达[J].中华肿瘤杂志，1996，18：263～265.
[7]Gottesman MM. How cancer cells evade chemotherapy? Sixteeth Richard and Hinda Rosentha Fowdatation Award Lecture [J]. Cancer Res, 1993.53： 747～ 754.
收稿日期：1999-05-18
修回日期：1999-06-21, 百拇医药
单位：陈汝福 邹声泉(同济医科大学附属同济医院普外科，湖北 武汉 430030)；李志花 衣龙海(山东省肿瘤防治研究院，山东 济南 251007)
关键词：肝门部胆管癌；多药耐药基因；RT-PCR
癌症000419
【摘要】目的：检测肝门部胆管癌新鲜组织中多药耐药基因(mdr-1)mRNA表达，探讨其与肝门部胆管癌临床病理间的关系。方法：应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)对26例术前未作治疗的肝门部胆管癌，12例正常胆管组织的mdr-1mRNA表达进行了检测，并与癌组织的分化程度、病理类型、部位、浸润转移作对比研究。结果：26例肝门部胆管癌组织中mdr-1mRNA阳性表达率为65.4%(17/26)，正常胆管组织表达率为8.3%(1/12)，二者差异有显著性(P<0.01)。mdr-1mRNA阳性表达与肝门部胆管癌的分化程度、发生部位、病理类型、浸润转移无关(P>0.05)。结论：肝门部胆管癌组织中mdr-1mRNA的高表达可作为肝门部胆管癌化疗耐药的指标。
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中图分类号：R735.8 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0350-03
The expression of mdr-1 mRNA in hilar cholangiocarcinoma
CHEN Ru-fu
(Department of General Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030,P.R.China)
ZOU Sheng-quan
(Department of General Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030,P.R.China)
, 百拇医药
LI Zhi-hua
(Shandong Tumor Hospital and Institute, Jinan 251007, P.R. China)
【Abstract】 Objectives： To detect the levels of mdr- l gene experession in fresh untreated hilar cholangiocarcinoma tissues, and to investigate the correlation of mdr- 1 expression with current prognostic indicators of clinicopathology. Method： mdr- 1 mRNA expression of 26 cases untreated hilar cholangicarcinoma and 12 cases normal bile duct tissues were examined using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT- PCR). Results： mdr- 1 mRNA expression in tumor tissue was found in 65.4% (17/26) of the patients, whereas, 8.3% (1/12) was seen in normal bile duct (P<0.01).No correlation with differentiation, invassiveness, metastasis and staging, clinical typing, pathological type was found (P>0.05). Conclusion： Higher expression of mdr- 1 mRNA in hilar cholangiocarcinoma tissue might be served as an indicator for drug resistance in chemotherapy.
, 百拇医药
Key words： Hilar cholangiocarcinoma; mdr- 1 mRNA; RT- PCR
目前研究认为，mdr-1基因的扩增及其产物P-糖蛋白的过表达是化疗失败的重要原因之一[1]。肝门部胆管癌分子生物学研究发现[2]，该肿瘤的遗传性能不稳定，并且容易对化疗和放疗产生治疗耐受,但对其发生机制目前还不清楚。为了探讨肝门部胆管癌化疗不敏感的原因，我们对肝门部胆管癌组织及正常组织的mdr-1mRNA表达进行了研究。现报告如下。
1 材料与方法
1.1病例及组织标本
收集同济医院、山东省肿瘤医院、桂林医学院附院1996年9月～1998年6月手术切除的肝门部胆管癌组织标本26例，其中男16例，女10例，年龄38～73岁(中位年龄52.4岁)。BismuthⅠ型10例，Ⅱ型8例，Ⅲ型5例，Ⅳ型3例；组织学检查：管状腺癌10例，乳头状腺癌9例，未分化癌6例，粘液癌1例；分化程度：高分化13例，中分化6例，低分化7例，有淋巴结转移占61.5%(16/26)，nevin分级S1～S25例，S310例，S4～S511例。术后立即将肿瘤和癌周组织标本投入液氮，-80℃保存备用。
, http://www.100md.com
1.2试剂
mdr-1正向、反向引物、β2-M(β2-微球蛋白)正向、反向引物由上海生工生物公司合成。RNA抽提试剂盒购自promega公司。PCR扩增仪是美国产品(PTC-150-16型)。
1.3RT-PCR
异硫氰酸胍一步法抽提组织中总RNA。总RNA经紫外线分光光度定量，琼脂糖凝胶电泳鉴定。取3μgRNA用于逆转录实验。20μl反应体系包括：oligo(dt)0.1μg,RNasin20u，2mol/LdNTPs4μl，AMV5u，42℃1小时，95℃5分钟。2.5μl逆转录产物用于PCR40μl总体积包括dNTP10mol/L，正向、反向引物各为10pmol/L，Tag5u,mdr-1正向引物5'-GTACCCATCATTG-CAQATAGC-3'，反向引物5'-CAAACTTCTGC-TCCTGAGTC-3'。PCR反应条件为95℃50秒，56℃45秒；72℃50秒，32个循环。β2-M正向引物为5'-ACCCCCACTGA-AAAAGATGA-3'，反向引物5'-ATCTTCAAACC-TCCATGATG-3'。PCR产物经2%琼脂凝胶电泳，溴化乙锭染色，通过凝胶扫描仪进行DNA电泳条带和光量子强度分析，将mdr-1与β2-M比值作为mdr-1表达水平的参数，对mdr-1PCR产物相对定量。
, 百拇医药
1.4结果判断
阳性结果二条带为175bpmdr-1mRNA条带，另一条为120bpβ2-M条带。将mdr-1与β2M比值>0.1定为阳性。
1.5统计与分析方法
采用χ2检验，精确概率法。
2 结果
2.1肝门部胆管癌及正常组织中mdr-1mRNA表达
26例肝门部胆管癌和癌周组织中mdr-1mRNA表达率为65.4%(17/26)，正常胆管组织的阳性表达率为8.3%(1/12)，癌组织中表达率明显高于正常组织(P<0.01)(图1)。
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图1肝门胆管癌中mdr-1mRNA表达
1.分子量标志2～6.mdr-1mRNA阳性表达
2.2mdr-1mRNA表达与肝门部胆管癌临床病理类型关系
mdr-1mRNA表达与肝门部胆管癌的分化程度、发生部位、病理类型、浸润转移均无关(P>0.05)，详见表1。
3 讨论
多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现抗药性的同时，对其他结构不同、作用部位不同的抗肿瘤药物也具有抗药性。多药耐药的肿瘤细胞的一个明显生化特征是mdr-1基因编码的P-gp过度表达，P-gp具有膜的药泵作用，它能逆浓度将细胞内多种mdr-1相关药物泵出细胞外，使细胞内药物蓄积减少，从而产生耐药[3]。定量检测分析mdr-1基因表达水平可说明病人抗药性的高低，从而判断预后，指导治疗。有关mdr-1mRNA在肝门部胆管癌中表达的研究，目前国内未见报道。
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表1mdr-1mRNA表达与肝门部胆管癌临床病理关系 因素
n
mdr-1mRNA
P值
+
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Bismuth
Ⅰ型
10
6
4
0.889
Ⅱ型
, 百拇医药
8
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3
Ⅲ型
5
4
1
Ⅳ型
3
2
1
病理类型
乳头状腺癌
10
, 百拇医药
7
3
0.574
管状腺癌
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未分化癌
6
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粘液状癌
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病理分级
高分化癌
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中分化癌
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低分化癌
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Nevinw分期
S1S2
5
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2
0.917
S3
10
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淋巴转移
有
16
10
6
0.696
无
10
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P值为临床病理各因素与mdr-1基因阳性表达率间的比较，P>0.05表明mdr-1mRNA表达与肝门部胆管癌各临床病理间无相关性。
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RT-PCR方法检测mdr-1mRNA不仅具有相对敏感、特异、方便、快速特点，同样具有通过mdr-1与β2-M比值作为mdr-1表达水平的参数，对mdr-1PCR产物相对定量的优点[4]。本组实验显示，未经治疗的肝门部胆管癌组织中具有mdr-1基因表达率为65.4%，而食道癌组织中mdr-1基因表达率为37%[5]，白血病33.3%[6]、乳癌34.3%[7]，由此可见，未经治疗的肝门部胆管癌组织中mdr-1有先天性高表达。本研究从分子水平证实了肝门部胆管癌化疗效果不佳的原因。
Gottesman[8]认为mdr-1基因过度表达，不仅涉及到耐药，而且也是癌细胞生物学行为进一步恶化的指标。但本实验发现，mdr-1基因表达与肝门部胆管癌的病理类型、分化程度、部位及浸润转移无相关性(χ2，精确概率法计算)，说明mdr-1表达阳性不能反应肿瘤的分化和浸润程度，只能代表其耐药性的强弱，因此，在选择化疗方案时应避免应用mdr能抗药的药物。
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研究肝门部胆管癌多药耐药的意义在于探索mdr-1表达与其临床耐药的关系，指导化疗方案设计、预测化疗结果、判断预后及克服MDR现象。本实验从分子水平解释了肝门部胆管癌对化疗不敏感的原因，为指导选药，提高在肝门部胆管癌综合治疗中化疗的疗效奠定了基础。有关mdr-1mRNA表达是否为肝门部胆管癌恶性行为的指标，尚需扩大病历数量，定期对病人远期随访等长期深入研究才能定论。
通讯作者：陈汝福 Tel:86-27-83646264 E-mail:chenrufu@hotmail.com
[参考文献]
[1]Broxterman HJ, Lankema J, Pinedo HM. How to probe clinical tumor samples for P- glycoprotein and multidrug resistance associated protein [J]. Eur J Cancer, 1996,32 A： 1024～ 1033. 陈汝福，邹声泉。肝门部胆管癌分子生物学研究新近展[J].中华肝胆外科杂志，1998，4：127～128.
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[2]Biedler JL. Genetic aspects of multdrug resistance [J]. Cancer, 1992, 70： 1799～ 1809.
[3]Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR- 1 multidrug resistance gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. Proc Natl Acad sci USA, 1990,80： 7160～ 7164.
[4]陈克能，刑海平，程帮昌，等.食道癌多药耐药基因表达与病理学的关系[J].中华医学杂志，1998，78：462～464.
[5]Schneider E, Cowan KH, Bader H, et al. Increased expression of the multidrug resistance associated protein were in relapsed acute lukmia [J]. Blood, 1995,85： 186～ 191.
[6]刘晓晴，石成华，宋三秦，等.RT-PCR方法检测临床乳腺癌组织的多药耐药基因表达[J].中华肿瘤杂志，1996，18：263～265.
[7]Gottesman MM. How cancer cells evade chemotherapy? Sixteeth Richard and Hinda Rosentha Fowdatation Award Lecture [J]. Cancer Res, 1993.53： 747～ 754.
收稿日期：1999-05-18
修回日期：1999-06-21, 百拇医药