光敏化姜黄素诱导胃癌细胞凋亡
作者：陈瑞川 苏金华 马胜平 蒋雪玄 霍霞
单位：马胜平；蒋雪玄(厦门大学抗癌研究中心,生物系,福建 厦门 361005)；陈瑞川 苏金华 霍霞(汕头大学医学院中心实验室，广东 汕头 515031)
关键词：姜黄素；光敏化；胃肿瘤；MGC80-3；凋亡
癌症000410
【摘要】目的：研究在光照下姜黄素诱导胃癌细胞凋亡的效应，探讨其作为光动力学治疗肿瘤新型光敏剂的可能性。方法：体外培养的胃癌MGC80-3细胞加入姜黄素后光照处理；以台盼蓝拒染法计数细胞存活率，Giemsa染色观察形态变化并计数及统计凋亡指数，DNA琼脂糖电泳观察DNA片段化，流式细胞术检测细胞周期变化。结果：光敏化姜黄素处理后，细胞存活率随药物浓度及处理时间依赖性下降，并呈现典型的凋亡细胞形态；5μmol/L姜黄素光照处理细胞24小时，即呈现典型凋亡梯形条带；经2.5μmol/L及5μmol/L光敏化姜黄素处理，细胞周期主要阻滞于G2/M期，提示细胞的G2/M期阻滞与光敏化姜黄素诱导MGC80-3细胞凋亡有关。结论：光敏化姜黄素具有显著诱导MGC80-3细胞凋亡的作用，可望进一步开发成光动力学治疗肿瘤的新型光敏剂。
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中图分类号：Q2.24 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0321-04
Induction of human gastric cancer MGC 80-3 cell apoptosis by photoactivated curcumin
CHEN Rui-chuan SU Jin-hua MA Sheng-ping et al.
(Cancer Research Center of Xiamen University, Xiamen 361005, P.R.China)
【Abstract】 Objective: To investigate the effects of photoactivated curcumin on induction of apoptosis in human gastric cancer cell line MGC 80-3. Methods: MGC 80-3 cell was treated with curcumin plus fluorescence. Experiments of dye exclusion counting and Giemsa staining were conducted to determine the cell survival, morphology, and apoptotic index. The analysis of DNA fragmentation and cell cycles were performed by DNA electrophoresis and flow cytometer respectively. Results: Cell viability dropped down dependent on the curcumin concentration and treatment time. Contrarily, the apoptotic index increased dependent on the curcumin concentration and the typical apoptotic morphology "ladder bands"could be seen on DNA electrophoresis in 5 μ mol/L curcumin plus light treated cells. By analysis with flow cytometry, cell cycles showed G2/M arrest after treatment with 2.5 and 5 μ mol/L curcumin plus light, suggesting an association between G2/M arrest and MGC 80- 3 cell apoptosis induced by photoactivated curcumin. Conclusion: Photoactivated curcumin has the effect of inducing cell apoptosis in MGC 80- 3 cells, suggests a potential application of photodynamic therapy for tumor.
, 百拇医药
Key words: Curcumin; Photoactivated; Gastric carcinoma; MGC 80-3; Apoptosis
近年，光动力学治疗肿瘤的技术已逐渐完善，但配合治疗所需的光敏剂的开发研究却进展不大，临床使用的光敏剂仍以血卟啉衍生物为主。姜黄素(curcumin)是从中药姜黄中提取的酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、防癌、抑癌及近年发现的诱导癌细胞凋亡的作用[1]。我们在以人胃腺癌细胞MGC80-3为对象，研究姜黄素诱导胃癌细胞凋亡的过程中，发现姜黄素在光照条件下(光敏化姜黄素)诱导细胞凋亡的作用较无光照条件下(非光敏化姜黄素)更显著，提示姜黄素具有光化学反应特性并能显著诱导细胞凋亡。本文着重研究光敏化姜黄素诱导胃癌细胞凋亡的效应，探讨其作为光动力学治疗肿瘤新型光敏剂的开发前景。
图1光敏化姜黄素对MGC80-3细胞存活率的影响
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图2光敏化姜黄素对MGC80-3细胞形态的影响(Giemsa染色,×1000)
A:对照组;B:5μmol/L处理组(剪头示凋亡小体)
1 材料与方法
1.1试剂
RPMI1640购自美国GIBCOBRL公司。小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品。姜黄素、台盼蓝、Giemsa、蛋白酶K和SDS等购自Sigma公司。Tris、琼脂糖、RNaseA及pBR322/HaeIIIDNA分子量标准为Promega公司产品。其余均为国产分析纯试剂。
1.2细胞培养及药物处理
人胃腺癌MGC80-3细胞系由本单位细胞生物学研究室提供，于含10%小牛血清、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，5%CO2、37℃培养传代。细胞按(1～2)×105/ml接种，37℃培养24小时后按实验要求加入不同浓度姜黄素，于15W日光灯下(光距20cm)、37℃继续培养24小时后即收集细胞。
, 百拇医药
1.3细胞计数及光镜观察
常规台盼蓝拒染-血球计数板计数活细胞。培养于盖玻片上的细胞常规Giemsa染色后显微镜观察、拍照。
1.4DNA抽提及电泳分析
每样品取2×106个细胞,参考Ioannou等报道的方法[2]，细胞以0.2%EDTA/PBS消化、收集,以2.5%PEG8000分级沉淀法提取断裂部分的DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外观察仪观察、拍照。
1.5流式细胞仪分析
按文献方法[3]，每样品取(1～2)×106个细胞。流式细胞仪为FACSotFCM(美国BD公司),结果分析软件为CellFITCell-CycleAnalysisVersion2.01.2。
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2 结果
2.1光敏化姜黄素对MGC80-3细胞存活率的影响
以1、2.5和5μmol/L姜黄素光照下连续处理MGC80-3细胞72小时，并于不同时间取样计数活细胞，结果见图1。3种浓度光敏化姜黄素对MGC80-3细胞的存活率均有抑制作用，并随药物浓度及处理时间依赖性下降。
2.2光敏化姜黄素对MGC80-3细胞形态的影响
经5μmol/L姜黄素光照处理MGC80-3细胞24小时,常规Giemsa染色，光镜观察可见凋亡细胞胞膜完整或起泡,并有染色致密的凋亡小体形成,胞核染色质凝集，或附于核膜,或形成边缘清晰的致密块状(见图2)；按此标准随机计数500个细胞中的凋亡细胞并计算凋亡指数，结果见图3。
2.3光敏化姜黄素诱导MGC80-3细胞DNA片断化
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MGC80-3细胞经0、2.5、5、7.5、10μmol/L姜黄素光照处理24小时后的DNA电泳显示:5μmol/L以上终浓度姜黄素光照处理组均有典型的DNA梯形图像；另以0、5、10、20、30μmol/L终浓度姜黄素避光(非光敏化姜黄素)处理MGC80-3细胞24小时后，同样提取DNA进行电泳分析，显示20μmol/L以上终浓度姜黄素可诱导细胞凋亡，而10μmol/L终浓度姜黄素则无此作用(图4)。
图3光敏化姜黄素对MGC80-3细胞凋亡指数的影响
图4DNA琼脂糖电泳结果
A:光敏化姜黄素处理:B:非光敏化姜黄素处理M:pBR322/HaeIIIMarker
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1～5.0、25、5、7.5、10μmol/L姜黄素
a～e.0、5、10、20、30μmol/L姜黄素
图5光敏化姜黄素对MGC80-3细胞亚G1期的诱导作用
2.3细胞周期分布分析
以2.5及5μmol/L姜黄素光照处理细胞24小时，取样作流式细胞术分析细胞周期分布,显示G1、S期细胞随姜黄素浓度提高而下降,而亚G1期及G2/M期细胞百分比随药物浓度提高而增加(见图5及表1)。
表1 姜黄素对MGC80-3细胞周期的影响 组别
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G1期细胞(%)
S期细胞(%)
G2/M期细胞(%)
对照组
56.4
35.0
8.6
2.5μmol/L组
61.8
21.8
16.4
5μmol/L组
, 百拇医药
59.4
15.9
24.7
3 讨论
在研究过程中，我们发现姜黄素在光照下可显著诱导MGC80-3细胞死亡，使其存活率下降，进一步研究表明MGC80-3细胞存活率的下降与细胞凋亡有关。细胞凋亡是细胞主动参与的自主性死亡过程，可被多种药物及理化因素诱发[4]。目前，细胞形态观察和DNA琼脂糖电泳检查仍被作为判别细胞凋亡和细胞坏死的主要标志。本文以5μmol/L姜黄素光照处理MGC80-3细胞24小时，在倒置显微镜下观察，即可见培养的细胞由原来的梭状或多角状变为缩水状的圆形细胞，并大量从培养瓶壁脱落(结果未显示)；经Giemsa染色后观察，可见典型的凋亡细胞形态特征(见图2)；DNA琼脂糖电泳也显示5μmol/L浓度以上的姜黄素光照处理组均能观察到撎菪翁醮鴶，与形态观察的结果相符。
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近年的文献报道显示[1]：非光敏化姜黄素诱导各种癌细胞凋亡的浓度基本相近，约在20～30μmol/L左右，我们的研究显示5μmol/L光敏化姜黄素处理24小时后的凋亡指数为52%，与流式细胞仪检测结果相符，并与20μmol/L非光敏化姜黄素诱导MGC80-3细胞凋亡的效果相当(见图4)，表明光敏化姜黄素具有更显著的诱导MGC80-3细胞凋亡作用。
目前，有关姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究均采用非光敏化姜黄素处理细胞，其诱导凋亡机制尚不清楚，有人认为与姜黄素触发细胞内活性氧自由基代谢有关[1]。另有报道显示姜黄素在光照下可发生光化学反应并具有细胞毒作用[5,6]，我们推测光敏化姜黄素诱导细胞凋亡作用可能与姜黄素在光照下产生更多活性氧自由基有关。另外本文结果也提示凋亡可能与姜黄素光照处理MGC80-3细胞后发生G2/M期阻滞有关。总之，光敏化姜黄素诱导细胞凋亡的作用尚属首次报道，有关光敏化姜黄素诱导细胞凋亡的机制尚待进一步研究，其作为光敏剂应用于光动力治疗肿瘤的前景也有待于动物实验的验证。
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致谢：本文在完成过程中，曾获徐洵教授、李祺福副教授等的热心指导和帮助，在此致以衷心的感谢。
基金项目:本课题受福建省自然科学基金(C97108)资助
通讯作者：陈瑞川 Tel:86-592-2186390 E-mail:jydeng@jingxian.xmu.edu.cn
[参考文献]
[1]马晓华,沃兴德,梁海曼.姜黄素抗肿瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡的研究概况[J].国外医学肿瘤学分册,1999,26(1):21～23.
[2]Ioannou YA, Chen FW. Quantitation of DNA fragmentation in apoptosis [J]. Nucleic Acids Res, 1996,24(5):992～ 993.
, 百拇医药
[3]Li X, Melamed MR, Darzynkiewcz Z. Detection of apoptosis and DNA replication by differential labeling of DNA strand breaks with fluorochromes of different color [J]. Exp. Cell. Res., 1996,222(1):28～ 37.
[4]李德玲，王会信，周廷冲.细胞程序性死亡判定方法[J].生物化学与生物物理进展，1996,23:322～325.
[5]Chignel CF l, Bilski P, Reszka KJ, et al. Spectral and photochemical properties of curcumin [J]. Photochem. ＆ Photobiol., 1994,59:295～ 302.
[6]Dahl TA, Bilski P, Reszka KJ, et al. Photocytotoxicity of curcumin [J]. Photochem. ＆ Photobiol., 1994,59: 290～ 294.
收稿日期：1999-09-09
修回日期：1999-12-01, 百拇医药
单位：马胜平；蒋雪玄(厦门大学抗癌研究中心,生物系,福建 厦门 361005)；陈瑞川 苏金华 霍霞(汕头大学医学院中心实验室，广东 汕头 515031)
关键词：姜黄素；光敏化；胃肿瘤；MGC80-3；凋亡
癌症000410
【摘要】目的：研究在光照下姜黄素诱导胃癌细胞凋亡的效应，探讨其作为光动力学治疗肿瘤新型光敏剂的可能性。方法：体外培养的胃癌MGC80-3细胞加入姜黄素后光照处理；以台盼蓝拒染法计数细胞存活率，Giemsa染色观察形态变化并计数及统计凋亡指数，DNA琼脂糖电泳观察DNA片段化，流式细胞术检测细胞周期变化。结果：光敏化姜黄素处理后，细胞存活率随药物浓度及处理时间依赖性下降，并呈现典型的凋亡细胞形态；5μmol/L姜黄素光照处理细胞24小时，即呈现典型凋亡梯形条带；经2.5μmol/L及5μmol/L光敏化姜黄素处理，细胞周期主要阻滞于G2/M期，提示细胞的G2/M期阻滞与光敏化姜黄素诱导MGC80-3细胞凋亡有关。结论：光敏化姜黄素具有显著诱导MGC80-3细胞凋亡的作用，可望进一步开发成光动力学治疗肿瘤的新型光敏剂。
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中图分类号：Q2.24 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0321-04
Induction of human gastric cancer MGC 80-3 cell apoptosis by photoactivated curcumin
CHEN Rui-chuan SU Jin-hua MA Sheng-ping et al.
(Cancer Research Center of Xiamen University, Xiamen 361005, P.R.China)
【Abstract】 Objective: To investigate the effects of photoactivated curcumin on induction of apoptosis in human gastric cancer cell line MGC 80-3. Methods: MGC 80-3 cell was treated with curcumin plus fluorescence. Experiments of dye exclusion counting and Giemsa staining were conducted to determine the cell survival, morphology, and apoptotic index. The analysis of DNA fragmentation and cell cycles were performed by DNA electrophoresis and flow cytometer respectively. Results: Cell viability dropped down dependent on the curcumin concentration and treatment time. Contrarily, the apoptotic index increased dependent on the curcumin concentration and the typical apoptotic morphology "ladder bands"could be seen on DNA electrophoresis in 5 μ mol/L curcumin plus light treated cells. By analysis with flow cytometry, cell cycles showed G2/M arrest after treatment with 2.5 and 5 μ mol/L curcumin plus light, suggesting an association between G2/M arrest and MGC 80- 3 cell apoptosis induced by photoactivated curcumin. Conclusion: Photoactivated curcumin has the effect of inducing cell apoptosis in MGC 80- 3 cells, suggests a potential application of photodynamic therapy for tumor.
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Key words: Curcumin; Photoactivated; Gastric carcinoma; MGC 80-3; Apoptosis
近年，光动力学治疗肿瘤的技术已逐渐完善，但配合治疗所需的光敏剂的开发研究却进展不大，临床使用的光敏剂仍以血卟啉衍生物为主。姜黄素(curcumin)是从中药姜黄中提取的酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、防癌、抑癌及近年发现的诱导癌细胞凋亡的作用[1]。我们在以人胃腺癌细胞MGC80-3为对象，研究姜黄素诱导胃癌细胞凋亡的过程中，发现姜黄素在光照条件下(光敏化姜黄素)诱导细胞凋亡的作用较无光照条件下(非光敏化姜黄素)更显著，提示姜黄素具有光化学反应特性并能显著诱导细胞凋亡。本文着重研究光敏化姜黄素诱导胃癌细胞凋亡的效应，探讨其作为光动力学治疗肿瘤新型光敏剂的开发前景。
图1光敏化姜黄素对MGC80-3细胞存活率的影响
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图2光敏化姜黄素对MGC80-3细胞形态的影响(Giemsa染色,×1000)
A:对照组;B:5μmol/L处理组(剪头示凋亡小体)
1 材料与方法
1.1试剂
RPMI1640购自美国GIBCOBRL公司。小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品。姜黄素、台盼蓝、Giemsa、蛋白酶K和SDS等购自Sigma公司。Tris、琼脂糖、RNaseA及pBR322/HaeIIIDNA分子量标准为Promega公司产品。其余均为国产分析纯试剂。
1.2细胞培养及药物处理
人胃腺癌MGC80-3细胞系由本单位细胞生物学研究室提供，于含10%小牛血清、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，5%CO2、37℃培养传代。细胞按(1～2)×105/ml接种，37℃培养24小时后按实验要求加入不同浓度姜黄素，于15W日光灯下(光距20cm)、37℃继续培养24小时后即收集细胞。
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1.3细胞计数及光镜观察
常规台盼蓝拒染-血球计数板计数活细胞。培养于盖玻片上的细胞常规Giemsa染色后显微镜观察、拍照。
1.4DNA抽提及电泳分析
每样品取2×106个细胞,参考Ioannou等报道的方法[2]，细胞以0.2%EDTA/PBS消化、收集,以2.5%PEG8000分级沉淀法提取断裂部分的DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外观察仪观察、拍照。
1.5流式细胞仪分析
按文献方法[3]，每样品取(1～2)×106个细胞。流式细胞仪为FACSotFCM(美国BD公司),结果分析软件为CellFITCell-CycleAnalysisVersion2.01.2。
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2 结果
2.1光敏化姜黄素对MGC80-3细胞存活率的影响
以1、2.5和5μmol/L姜黄素光照下连续处理MGC80-3细胞72小时，并于不同时间取样计数活细胞，结果见图1。3种浓度光敏化姜黄素对MGC80-3细胞的存活率均有抑制作用，并随药物浓度及处理时间依赖性下降。
2.2光敏化姜黄素对MGC80-3细胞形态的影响
经5μmol/L姜黄素光照处理MGC80-3细胞24小时,常规Giemsa染色，光镜观察可见凋亡细胞胞膜完整或起泡,并有染色致密的凋亡小体形成,胞核染色质凝集，或附于核膜,或形成边缘清晰的致密块状(见图2)；按此标准随机计数500个细胞中的凋亡细胞并计算凋亡指数，结果见图3。
2.3光敏化姜黄素诱导MGC80-3细胞DNA片断化
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MGC80-3细胞经0、2.5、5、7.5、10μmol/L姜黄素光照处理24小时后的DNA电泳显示:5μmol/L以上终浓度姜黄素光照处理组均有典型的DNA梯形图像；另以0、5、10、20、30μmol/L终浓度姜黄素避光(非光敏化姜黄素)处理MGC80-3细胞24小时后，同样提取DNA进行电泳分析，显示20μmol/L以上终浓度姜黄素可诱导细胞凋亡，而10μmol/L终浓度姜黄素则无此作用(图4)。
图3光敏化姜黄素对MGC80-3细胞凋亡指数的影响
图4DNA琼脂糖电泳结果
A:光敏化姜黄素处理:B:非光敏化姜黄素处理M:pBR322/HaeIIIMarker
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1～5.0、25、5、7.5、10μmol/L姜黄素
a～e.0、5、10、20、30μmol/L姜黄素
图5光敏化姜黄素对MGC80-3细胞亚G1期的诱导作用
2.3细胞周期分布分析
以2.5及5μmol/L姜黄素光照处理细胞24小时，取样作流式细胞术分析细胞周期分布,显示G1、S期细胞随姜黄素浓度提高而下降,而亚G1期及G2/M期细胞百分比随药物浓度提高而增加(见图5及表1)。
表1 姜黄素对MGC80-3细胞周期的影响 组别
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G1期细胞(%)
S期细胞(%)
G2/M期细胞(%)
对照组
56.4
35.0
8.6
2.5μmol/L组
61.8
21.8
16.4
5μmol/L组
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59.4
15.9
24.7
3 讨论
在研究过程中，我们发现姜黄素在光照下可显著诱导MGC80-3细胞死亡，使其存活率下降，进一步研究表明MGC80-3细胞存活率的下降与细胞凋亡有关。细胞凋亡是细胞主动参与的自主性死亡过程，可被多种药物及理化因素诱发[4]。目前，细胞形态观察和DNA琼脂糖电泳检查仍被作为判别细胞凋亡和细胞坏死的主要标志。本文以5μmol/L姜黄素光照处理MGC80-3细胞24小时，在倒置显微镜下观察，即可见培养的细胞由原来的梭状或多角状变为缩水状的圆形细胞，并大量从培养瓶壁脱落(结果未显示)；经Giemsa染色后观察，可见典型的凋亡细胞形态特征(见图2)；DNA琼脂糖电泳也显示5μmol/L浓度以上的姜黄素光照处理组均能观察到撎菪翁醮鴶，与形态观察的结果相符。
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近年的文献报道显示[1]：非光敏化姜黄素诱导各种癌细胞凋亡的浓度基本相近，约在20～30μmol/L左右，我们的研究显示5μmol/L光敏化姜黄素处理24小时后的凋亡指数为52%，与流式细胞仪检测结果相符，并与20μmol/L非光敏化姜黄素诱导MGC80-3细胞凋亡的效果相当(见图4)，表明光敏化姜黄素具有更显著的诱导MGC80-3细胞凋亡作用。
目前，有关姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究均采用非光敏化姜黄素处理细胞，其诱导凋亡机制尚不清楚，有人认为与姜黄素触发细胞内活性氧自由基代谢有关[1]。另有报道显示姜黄素在光照下可发生光化学反应并具有细胞毒作用[5,6]，我们推测光敏化姜黄素诱导细胞凋亡作用可能与姜黄素在光照下产生更多活性氧自由基有关。另外本文结果也提示凋亡可能与姜黄素光照处理MGC80-3细胞后发生G2/M期阻滞有关。总之，光敏化姜黄素诱导细胞凋亡的作用尚属首次报道，有关光敏化姜黄素诱导细胞凋亡的机制尚待进一步研究，其作为光敏剂应用于光动力治疗肿瘤的前景也有待于动物实验的验证。
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致谢：本文在完成过程中，曾获徐洵教授、李祺福副教授等的热心指导和帮助，在此致以衷心的感谢。
基金项目:本课题受福建省自然科学基金(C97108)资助
通讯作者：陈瑞川 Tel:86-592-2186390 E-mail:jydeng@jingxian.xmu.edu.cn
[参考文献]
[1]马晓华,沃兴德,梁海曼.姜黄素抗肿瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡的研究概况[J].国外医学肿瘤学分册,1999,26(1):21～23.
[2]Ioannou YA, Chen FW. Quantitation of DNA fragmentation in apoptosis [J]. Nucleic Acids Res, 1996,24(5):992～ 993.
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[3]Li X, Melamed MR, Darzynkiewcz Z. Detection of apoptosis and DNA replication by differential labeling of DNA strand breaks with fluorochromes of different color [J]. Exp. Cell. Res., 1996,222(1):28～ 37.
[4]李德玲，王会信，周廷冲.细胞程序性死亡判定方法[J].生物化学与生物物理进展，1996,23:322～325.
[5]Chignel CF l, Bilski P, Reszka KJ, et al. Spectral and photochemical properties of curcumin [J]. Photochem. ＆ Photobiol., 1994,59:295～ 302.
[6]Dahl TA, Bilski P, Reszka KJ, et al. Photocytotoxicity of curcumin [J]. Photochem. ＆ Photobiol., 1994,59: 290～ 294.
收稿日期：1999-09-09
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