抗肿瘤抗生素云南霉素对细胞周期的作用及分子机理
作者：童彤 郭素萍 白瑾峰 甄永苏
单位：郭素萍 白瑾峰(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所,北京100021)；童彤 甄永苏(中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所,北京100050)
关键词：云南霉素/药理学；细胞周期
癌症000401
【摘要】目的：研究具有新型结构的胞嘧啶核苷二肽类抗生素云南霉素的抗肿瘤作用的分子机理。方法：应用细胞培养、流式细胞光度术、Western blot分析等方法研究云南霉素对肿瘤细胞周期的影响及分子机理。结果：云南霉素对多种肿瘤细胞(HL-60,KB,GLC)有G2/M期阻滞、S期抑制作用，并伴有cyclin B1蛋白、P34cdc2蛋白、Mpm-2蛋白表达下降。结论：云南霉素导致HL-60细胞G2/M期阻滞的分子机理可能与降低cyclin B1、P34cdc2和Mpm-2蛋白水平有关。
, 百拇医药
中图分类号：R329.2+8 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0289-04
Effect of antitumor antibiotic yunnanmycin on cell cycle and the molecular mechanism
GUO Suping, et al.
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050， P.R.China.)
TONG Tong ZHEN Yongsu
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, P.R.China.)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective: To explore the molecular mechanisms of antitumor effect of yunnanmycin which is a novel cytosine nucleoside antibiotic. Methods: Cell culture, flow cytometry and Western blot analysis were employed toi ivestigate the effects of yunnanmycin on the cell cycle and related mechanisms. Results: Arrest of G2/M phase and inhibition of S phase were observed in HL-60, KB and GLC cells after treated with yunnanmycin. Depressed expression of cyclin B1 protein, P34cdc2 protein, Mpm-2 protein was found in the HL-60 cells treated with yunnanmycin. Conclusions: The results suggest that the G2/M arrest of HL-60 cells by yunnanmycin may be related to the altered low protein levels of cyclin B1, P34cdc2 and Mpm-2.
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Key words: Yunnanmycin; Pharmacology; Cell cycle
云南霉素是新的胞嘧啶核苷类抗生素(图1)，经由云南省关坪自然保护区土壤样品分离的链霉菌2321号菌株发酵液中提取得到，体外试验显示对肿瘤细胞有杀伤作用，云南霉素抑制KB细胞蛋白质和DNA合成，但对RNA无影响[1]。动物体内试验研究显示，云南霉素对小鼠肝癌22，结肠癌26及肉瘤180均有抑制作用[2]。本文研究云南霉素杀伤肿瘤细胞的分子机理，并重点探讨周期相关蛋白表达动态变化与肿瘤细胞周期表型改变的关系。
图1 云南霉素的分子结构
1 材料和方法
1.1主要仪器
, 百拇医药
流式细胞仪(ELITE，USA)；半干蛋白转膜仪(Trans-blot,BioRad,USA)；紫外/可见光分光光度计(UV-140,Shimadzu,Japan)；台式高速冷冻离心机(TGL-16G，上海)。
1.2药品及试剂
云南霉素(yunnanmycin,中国医学科学院医药生物技术研究所研制，陈文君老师提供)；蛋白定量试剂盒(Sigma,USA)；ECL发光法检测试剂盒(AmershamLifeScience,England)；抗CyclinB1抗体、抗P34cdc2抗体(SantaCruz,USA)；抗Mpm-2抗体(美国M.D.AndersonCancerCenter,Dr.JianKuang惠赠)；抗PCNA抗体(Zymed,USA)；抗β-Actin抗体(Sigma,USA)。
1.3细胞培养
, 百拇医药
人白血病HL-60细胞、人口腔鳞癌KB细胞、人肺腺癌GLC细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃，5%CO2温箱中培养。取对数生长期KB和GLC细胞，104细胞/cm2密度接种，第二天加云南霉素处理不同时间，分别收集。取对数生长期HL-60细胞，2×105细胞/ml浓度种入培养瓶，云南霉素处理不同时间，分别离心收集，用台盼蓝排除法观察细胞毒性，并计算药物对细胞的生长抑制率。
1.4流式细胞光度术检测
收集细胞，4℃70%乙醇固定，-20℃冰箱保存。检测前，PBS洗3次，RNA酶消化，PI染色，流式细胞仪分析DNA含量，检测群体细胞中G1、S、G2/M期细胞百分率，亚G1期峰为凋亡细胞峰。检测云南霉素处理HL-60、KB和GLC细胞不同时间后，其细胞周期变化。
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1.5Westernblot分析[3]
观察云南霉素处理HL-60细胞不同时间后，多种细胞周期相关蛋白表达改变情况。取生长状态良好细胞提取蛋白。蛋白定量后，制备相应浓度SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样30μg，将样品及Marker置于1×蛋白加样缓冲液中，电泳3～5h电泳完毕后，切下蛋白Marker，氨基黑染色。修整后的凝胶经半干电转仪转膜，转移好的纤维素膜用ECL发光法和不同抗体检测不同蛋白表达状况。
2 实验结果
2.1云南霉素对HL-60细胞的毒性
台盼蓝染色排除法显示，云南霉素400μg/ml处理HL-60细胞24h，没有明显的毒性作用；48h，对HL-60细胞的生长抑制率为58.8%。
2.2云南霉素对HL-60细胞周期的影响
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流式细胞光度术检测结果显示(图2和表1),200μg/ml云南霉素处理HL-60细胞24h，G1期、G2/M期和S期细胞百分率未发生明显改变；48h，G2/M期细胞由8.7%增加到26.9%；72h，G2/M期进一步增加到46.3%，S期由47.6%降至21.1%。说明云南霉素200μg/ml对HL-60细胞有G2/M期阻滞和S期抑制作用。
图2 云南霉素200μg/ml处理HL-60细胞不同时间的流式细胞光度术检测图。
(A)control,(B)24h,(C)48h,(D)72h。
流式细胞光度术检测结果显示(图3和表1),400μg/ml云南霉素处理HL-60细胞5h，各期细胞百分率未发生明显改变；G2/M期细胞由对照组的10.1%增加到24h的50.3%，S期细胞由45.4%降至16.3%，代表凋亡细胞的亚G1期细胞占童彤,等.抗肿瘤抗生素云南霉素对细胞周期的作用及分子机理53.4%；48h，亚G1期细胞达82.7%。说明云南霉素较低浓度、作用较短时间对HL-60细胞即有G2/M期阻滞，较高浓度、作用较长时间则诱导细胞凋亡。
, 百拇医药
图3云南霉素400μg/ml处理HL-60细胞不同时间的流式细胞光度术检测图。
(A)control,(B)5h,(C)24h,(D)48h。
2.3云南霉素对KB细胞和GLC细胞周期的影响
流式细胞光度术检测结果显示(表2)，云南霉素较低浓度(50～200μg/ml)对GLC细胞和KB细胞有G2/M期阻滞，较高浓度(500～1000μg/ml)云南霉素对KB细胞有G2/M期阻滞且对S期有抑制作用。
表1 云南霉素处理HL-60细胞的流式细胞光度术检测数据 Concentration
(μg/ml)
Time
, http://www.100md.com
(h)
G1
(%)
G2/M
(%)
S
(%)
Sub-G*1
(%)
200
0
43.7
, 百拇医药
8.7
47.6
5.9
24
44.5
13.2
42.4
7.4
48
35.0
26.9
38.1
16.9
, http://www.100md.com
72
32.5
46.3
21.1
26.9
0
44.5
10.1
45.4
10.0
5
36.1
17.5
, http://www.100md.com
46.4
18.3
24
33.4
50.3
16.3
53.4
48
-
-
-
82.7
*apoptoticindex(%)
, 百拇医药
表2 云南霉素对GLC细胞和KB细胞细胞周期的影响 Cell type
Time
(h)
Concentration
(μg/ml)
G1
(%)
G2/M
(%)
S
(%)
GLC
, 百拇医药
72
0
59.4
8.1
32.5
50
40.6
32.1
27.3
100
16.2
57.2
26.3
, http://www.100md.com
200
24.8
49.2
25.5
KB
48
0
59.2
4.8
36.0
200
52.1
20.8
, 百拇医药
27.1
500
53.2
41.6
5.2
1000
4.32
56.8
0.0
2.4云南霉素对HL-60细胞周期相关蛋白表达的影响
Westernblot分析检测HL-60细胞经云南霉素400μg/ml处理不同时间后，周期相关蛋白表达改变的情况(图4)。
, 百拇医药
图4云南霉素400μg/ml处理HL-60细胞不同时间
的Westernblot检测结果(A)control,(B)5h,(C)24h,(D)48h。
P34cdc2蛋白：云南霉素作用5h,P34cdc2蛋白未发生明显表达改变；24h,P34cdc2开始明显下降；至48h，已完全检测不到。
CyclinB1蛋白：云南霉素作用5h，CyclinB1蛋白无明显改变;24h和48h，其表达逐渐下降。Mpm-2蛋白：5h，Mpm-2蛋白开始下降;24h和48h已检测不到。
PCNA蛋白：未发现明显改变。
3 讨论
大量实验证据表明，许多抗癌药物对细胞周期有特异的阻断作用[4]，这种作用受多种调控基因精细而又复杂的相互调控，这些基因最终是通过其表达的蛋白来实现对细胞增殖表型的直接调节，因此，本实验重点研究云南霉素引起肿瘤细胞周期相关蛋白的表达变化与相应细胞表型改变的关系。
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云南霉素是一个具有新型结构的胞嘧啶核苷二肽类抗生素，云南霉素的胞嘧啶结构与一个己糖和两个氨基酸(丝氨酸和肌氨酸)相连接(图1)。本研究结果表明，云南霉素体外对多种肿瘤细胞(HL-60、KB、GLC细胞)有G2/M期阻滞和S期抑制作用。我们的体外实验中，使用了较高浓度的云南霉素(400μg/ml)，过去的研究已显示[2]，与抗代谢药5-氟尿嘧啶(5-FU)相比，云南霉素体外的细胞毒性较弱，但动物体内的抑瘤作用与5-FU相近，这可能是由于云南霉素与5-FU的作用机制及体内代谢方式的差异，需进一步研究。
Westernblot结果显示，HL-60细胞经400μg/ml云南霉素作用5h，G1期、S期和G2/M期细胞百分率未发生明显改变，P34cdc2蛋白和cyclin B1蛋白均未发生表达改变；24h，HL-60细胞有明显的G2/M期阻滞，上述二蛋白已明显下降；48h,HL-60细胞亚G1期峰(凋亡细胞峰)已达到82.7%，此时，P34cdc2蛋白已检测不到，cyclinB1蛋白水平进一步降低，说明云南霉素处理的HL-60细胞G2/M期阻滞与P34cdc2和CyclinB1蛋白水平改变相平行。许多研究已经表明，P34cdc2和cyclinB1复合物在真核细胞G2到M期进行过程中有重要意义[5]。DNA损伤导致细胞P34cdc2活性抑制，有利于G2期阻滞[6]；细胞由G2期进入M期过程中需有cyclinB1蛋白累积到一定阈值之上，否则细胞将停留在G2期[6]。已有研究报道，植物类黄酮Apigenin(5,7,4'-三羟(基)黄酮)可诱导小鼠角质细胞G2/M期阻滞，其机制是抑制P34cdc2活性和cyclinB1表达水平[7]。我们的研究结果说明云南霉素引起HL-60细胞G2/M期阻滞的重要分子基础之一是降低P34cdc2蛋白和cyclinB1蛋白水平。
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我们检测到云南霉素可引起HL-60细胞Mpm-2蛋白表达下降，与HL-60细胞出现G2/M阻滞同步。Mpm-2抗原在整个细胞周期中能够合成，有丝分裂期细胞Mpm-2蛋白磷酸化程度远高于间期细胞，抗Mpm-2抗体主要在有丝分裂期能够检测到Mpm-2抗原。Mpm-2抗原的磷酸化是调节细胞M期的关键因素之一[8]，已有研究表明，X射线和鬼臼乙叉甙(etoposide)引起HeLa细胞DNA损伤、导致G2期阻滞过程中，不改变P34cdc2激酶(P34cdc2和cyclinB1复合物)活性，而是降低Mpm-2磷酸化水平[9]。云南霉素作用HL-60细胞，P34cdc2蛋白和CyclinB1蛋白表达下降，不是导致HL-60细胞G2/M期阻滞的唯一因素，另一可能机制是影响Mpm-2蛋白的磷酸化改变。
Westernblot结果显示，云南霉素对HL-60细胞的增殖核抗原PCNA蛋白表达无影响。PCNA主要存在于分裂细胞的细胞核中，S期细胞PCNA表达增高，静止期(Go期)PCNAmRNA和蛋白量极低[10]。尽管云南霉素对HL-60细胞S期有抑制作用，但不明显改变细胞PCNA蛋白表达量，说明PCNA不是细胞S期抑制的唯一调节机制，上述作用可能与其它S期相关蛋白有关，尚待进一步研究。
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目前的研究表明，云南霉素在体外杀伤肿瘤细胞主要通过引起细胞G2/M期阻滞，S期抑制及诱导细胞凋亡完成的，有关云南霉素引起肿瘤细胞凋亡及相关机理的研究，我们将另作报道。云南霉素导致HL-60细胞G2/M期阻滞的分子基础可能是降低P34cdc2蛋白和cyclinB1蛋白水平，且与改变Mpm2蛋白磷酸化水平有关；抑制细胞S期的作用与PCNA蛋白表达无关，可能受其它S期相关蛋白调节。云南霉素抗肿瘤的分子机理研究，为云南霉素应用于肿瘤治疗提供了理论基础。
基金项目：本课题受国家重点基础研究发展规划973项目(编号G1998051200)资助
通讯作者：甄永苏 Tel:86-10-63010985 Fax：86-10-63017302 E-mail:zhenys@public.bta.net.cn
[参考文献]
, 百拇医药
[1]Zhen YS, Qi CQ, Hu JL， et al. Antitumor activity of yunnanmycin, A novel pyrimidine nucleoside antibiotic [J]. Adv Exper Med Biol, 1998, 431: 575～ 579.
[2]甄永苏,薛玉川，吴淑英,等.新抗肿瘤抗生素云南霉素Ⅲ.抗肿瘤作用[J].中国抗生素杂志,1998,23:274～277.
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[9]Barratt RA, Kao G, Mckenna WQ， et al. The G2 block induced by DNA damage: A caffeine- resistant component independent of Cdc25c, Mpm-2 phosphorylation, and H1 kinase activity [J]. Cancer Res, 1998, 58: 2639～ 2645.
[10]Kelman Z. PCNA: structure, functions and interactions [J]. Oncogene, 1997, 14: 629～ 640.
收稿日期：2000-03-20, 百拇医药
单位：郭素萍 白瑾峰(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所,北京100021)；童彤 甄永苏(中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所,北京100050)
关键词：云南霉素/药理学；细胞周期
癌症000401
【摘要】目的：研究具有新型结构的胞嘧啶核苷二肽类抗生素云南霉素的抗肿瘤作用的分子机理。方法：应用细胞培养、流式细胞光度术、Western blot分析等方法研究云南霉素对肿瘤细胞周期的影响及分子机理。结果：云南霉素对多种肿瘤细胞(HL-60,KB,GLC)有G2/M期阻滞、S期抑制作用，并伴有cyclin B1蛋白、P34cdc2蛋白、Mpm-2蛋白表达下降。结论：云南霉素导致HL-60细胞G2/M期阻滞的分子机理可能与降低cyclin B1、P34cdc2和Mpm-2蛋白水平有关。
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中图分类号：R329.2+8 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0289-04
Effect of antitumor antibiotic yunnanmycin on cell cycle and the molecular mechanism
GUO Suping, et al.
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050， P.R.China.)
TONG Tong ZHEN Yongsu
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, P.R.China.)
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【Abstract】 Objective: To explore the molecular mechanisms of antitumor effect of yunnanmycin which is a novel cytosine nucleoside antibiotic. Methods: Cell culture, flow cytometry and Western blot analysis were employed toi ivestigate the effects of yunnanmycin on the cell cycle and related mechanisms. Results: Arrest of G2/M phase and inhibition of S phase were observed in HL-60, KB and GLC cells after treated with yunnanmycin. Depressed expression of cyclin B1 protein, P34cdc2 protein, Mpm-2 protein was found in the HL-60 cells treated with yunnanmycin. Conclusions: The results suggest that the G2/M arrest of HL-60 cells by yunnanmycin may be related to the altered low protein levels of cyclin B1, P34cdc2 and Mpm-2.
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Key words: Yunnanmycin; Pharmacology; Cell cycle
云南霉素是新的胞嘧啶核苷类抗生素(图1)，经由云南省关坪自然保护区土壤样品分离的链霉菌2321号菌株发酵液中提取得到，体外试验显示对肿瘤细胞有杀伤作用，云南霉素抑制KB细胞蛋白质和DNA合成，但对RNA无影响[1]。动物体内试验研究显示，云南霉素对小鼠肝癌22，结肠癌26及肉瘤180均有抑制作用[2]。本文研究云南霉素杀伤肿瘤细胞的分子机理，并重点探讨周期相关蛋白表达动态变化与肿瘤细胞周期表型改变的关系。
图1 云南霉素的分子结构
1 材料和方法
1.1主要仪器
, 百拇医药
流式细胞仪(ELITE，USA)；半干蛋白转膜仪(Trans-blot,BioRad,USA)；紫外/可见光分光光度计(UV-140,Shimadzu,Japan)；台式高速冷冻离心机(TGL-16G，上海)。
1.2药品及试剂
云南霉素(yunnanmycin,中国医学科学院医药生物技术研究所研制，陈文君老师提供)；蛋白定量试剂盒(Sigma,USA)；ECL发光法检测试剂盒(AmershamLifeScience,England)；抗CyclinB1抗体、抗P34cdc2抗体(SantaCruz,USA)；抗Mpm-2抗体(美国M.D.AndersonCancerCenter,Dr.JianKuang惠赠)；抗PCNA抗体(Zymed,USA)；抗β-Actin抗体(Sigma,USA)。
1.3细胞培养
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人白血病HL-60细胞、人口腔鳞癌KB细胞、人肺腺癌GLC细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃，5%CO2温箱中培养。取对数生长期KB和GLC细胞，104细胞/cm2密度接种，第二天加云南霉素处理不同时间，分别收集。取对数生长期HL-60细胞，2×105细胞/ml浓度种入培养瓶，云南霉素处理不同时间，分别离心收集，用台盼蓝排除法观察细胞毒性，并计算药物对细胞的生长抑制率。
1.4流式细胞光度术检测
收集细胞，4℃70%乙醇固定，-20℃冰箱保存。检测前，PBS洗3次，RNA酶消化，PI染色，流式细胞仪分析DNA含量，检测群体细胞中G1、S、G2/M期细胞百分率，亚G1期峰为凋亡细胞峰。检测云南霉素处理HL-60、KB和GLC细胞不同时间后，其细胞周期变化。
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1.5Westernblot分析[3]
观察云南霉素处理HL-60细胞不同时间后，多种细胞周期相关蛋白表达改变情况。取生长状态良好细胞提取蛋白。蛋白定量后，制备相应浓度SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样30μg，将样品及Marker置于1×蛋白加样缓冲液中，电泳3～5h电泳完毕后，切下蛋白Marker，氨基黑染色。修整后的凝胶经半干电转仪转膜，转移好的纤维素膜用ECL发光法和不同抗体检测不同蛋白表达状况。
2 实验结果
2.1云南霉素对HL-60细胞的毒性
台盼蓝染色排除法显示，云南霉素400μg/ml处理HL-60细胞24h，没有明显的毒性作用；48h，对HL-60细胞的生长抑制率为58.8%。
2.2云南霉素对HL-60细胞周期的影响
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流式细胞光度术检测结果显示(图2和表1),200μg/ml云南霉素处理HL-60细胞24h，G1期、G2/M期和S期细胞百分率未发生明显改变；48h，G2/M期细胞由8.7%增加到26.9%；72h，G2/M期进一步增加到46.3%，S期由47.6%降至21.1%。说明云南霉素200μg/ml对HL-60细胞有G2/M期阻滞和S期抑制作用。
图2 云南霉素200μg/ml处理HL-60细胞不同时间的流式细胞光度术检测图。
(A)control,(B)24h,(C)48h,(D)72h。
流式细胞光度术检测结果显示(图3和表1),400μg/ml云南霉素处理HL-60细胞5h，各期细胞百分率未发生明显改变；G2/M期细胞由对照组的10.1%增加到24h的50.3%，S期细胞由45.4%降至16.3%，代表凋亡细胞的亚G1期细胞占童彤,等.抗肿瘤抗生素云南霉素对细胞周期的作用及分子机理53.4%；48h，亚G1期细胞达82.7%。说明云南霉素较低浓度、作用较短时间对HL-60细胞即有G2/M期阻滞，较高浓度、作用较长时间则诱导细胞凋亡。
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图3云南霉素400μg/ml处理HL-60细胞不同时间的流式细胞光度术检测图。
(A)control,(B)5h,(C)24h,(D)48h。
2.3云南霉素对KB细胞和GLC细胞周期的影响
流式细胞光度术检测结果显示(表2)，云南霉素较低浓度(50～200μg/ml)对GLC细胞和KB细胞有G2/M期阻滞，较高浓度(500～1000μg/ml)云南霉素对KB细胞有G2/M期阻滞且对S期有抑制作用。
表1 云南霉素处理HL-60细胞的流式细胞光度术检测数据 Concentration
(μg/ml)
Time
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(h)
G1
(%)
G2/M
(%)
S
(%)
Sub-G*1
(%)
200
0
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8.7
47.6
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38.1
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46.4
18.3
24
33.4
50.3
16.3
53.4
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82.7
*apoptoticindex(%)
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表2 云南霉素对GLC细胞和KB细胞细胞周期的影响 Cell type
Time
(h)
Concentration
(μg/ml)
G1
(%)
G2/M
(%)
S
(%)
GLC
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0
59.4
8.1
32.5
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2.4云南霉素对HL-60细胞周期相关蛋白表达的影响
Westernblot分析检测HL-60细胞经云南霉素400μg/ml处理不同时间后，周期相关蛋白表达改变的情况(图4)。
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图4云南霉素400μg/ml处理HL-60细胞不同时间
的Westernblot检测结果(A)control,(B)5h,(C)24h,(D)48h。
P34cdc2蛋白：云南霉素作用5h,P34cdc2蛋白未发生明显表达改变；24h,P34cdc2开始明显下降；至48h，已完全检测不到。
CyclinB1蛋白：云南霉素作用5h，CyclinB1蛋白无明显改变;24h和48h，其表达逐渐下降。Mpm-2蛋白：5h，Mpm-2蛋白开始下降;24h和48h已检测不到。
PCNA蛋白：未发现明显改变。
3 讨论
大量实验证据表明，许多抗癌药物对细胞周期有特异的阻断作用[4]，这种作用受多种调控基因精细而又复杂的相互调控，这些基因最终是通过其表达的蛋白来实现对细胞增殖表型的直接调节，因此，本实验重点研究云南霉素引起肿瘤细胞周期相关蛋白的表达变化与相应细胞表型改变的关系。
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云南霉素是一个具有新型结构的胞嘧啶核苷二肽类抗生素，云南霉素的胞嘧啶结构与一个己糖和两个氨基酸(丝氨酸和肌氨酸)相连接(图1)。本研究结果表明，云南霉素体外对多种肿瘤细胞(HL-60、KB、GLC细胞)有G2/M期阻滞和S期抑制作用。我们的体外实验中，使用了较高浓度的云南霉素(400μg/ml)，过去的研究已显示[2]，与抗代谢药5-氟尿嘧啶(5-FU)相比，云南霉素体外的细胞毒性较弱，但动物体内的抑瘤作用与5-FU相近，这可能是由于云南霉素与5-FU的作用机制及体内代谢方式的差异，需进一步研究。
Westernblot结果显示，HL-60细胞经400μg/ml云南霉素作用5h，G1期、S期和G2/M期细胞百分率未发生明显改变，P34cdc2蛋白和cyclin B1蛋白均未发生表达改变；24h，HL-60细胞有明显的G2/M期阻滞，上述二蛋白已明显下降；48h,HL-60细胞亚G1期峰(凋亡细胞峰)已达到82.7%，此时，P34cdc2蛋白已检测不到，cyclinB1蛋白水平进一步降低，说明云南霉素处理的HL-60细胞G2/M期阻滞与P34cdc2和CyclinB1蛋白水平改变相平行。许多研究已经表明，P34cdc2和cyclinB1复合物在真核细胞G2到M期进行过程中有重要意义[5]。DNA损伤导致细胞P34cdc2活性抑制，有利于G2期阻滞[6]；细胞由G2期进入M期过程中需有cyclinB1蛋白累积到一定阈值之上，否则细胞将停留在G2期[6]。已有研究报道，植物类黄酮Apigenin(5,7,4'-三羟(基)黄酮)可诱导小鼠角质细胞G2/M期阻滞，其机制是抑制P34cdc2活性和cyclinB1表达水平[7]。我们的研究结果说明云南霉素引起HL-60细胞G2/M期阻滞的重要分子基础之一是降低P34cdc2蛋白和cyclinB1蛋白水平。
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我们检测到云南霉素可引起HL-60细胞Mpm-2蛋白表达下降，与HL-60细胞出现G2/M阻滞同步。Mpm-2抗原在整个细胞周期中能够合成，有丝分裂期细胞Mpm-2蛋白磷酸化程度远高于间期细胞，抗Mpm-2抗体主要在有丝分裂期能够检测到Mpm-2抗原。Mpm-2抗原的磷酸化是调节细胞M期的关键因素之一[8]，已有研究表明，X射线和鬼臼乙叉甙(etoposide)引起HeLa细胞DNA损伤、导致G2期阻滞过程中，不改变P34cdc2激酶(P34cdc2和cyclinB1复合物)活性，而是降低Mpm-2磷酸化水平[9]。云南霉素作用HL-60细胞，P34cdc2蛋白和CyclinB1蛋白表达下降，不是导致HL-60细胞G2/M期阻滞的唯一因素，另一可能机制是影响Mpm-2蛋白的磷酸化改变。
Westernblot结果显示，云南霉素对HL-60细胞的增殖核抗原PCNA蛋白表达无影响。PCNA主要存在于分裂细胞的细胞核中，S期细胞PCNA表达增高，静止期(Go期)PCNAmRNA和蛋白量极低[10]。尽管云南霉素对HL-60细胞S期有抑制作用，但不明显改变细胞PCNA蛋白表达量，说明PCNA不是细胞S期抑制的唯一调节机制，上述作用可能与其它S期相关蛋白有关，尚待进一步研究。
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目前的研究表明，云南霉素在体外杀伤肿瘤细胞主要通过引起细胞G2/M期阻滞，S期抑制及诱导细胞凋亡完成的，有关云南霉素引起肿瘤细胞凋亡及相关机理的研究，我们将另作报道。云南霉素导致HL-60细胞G2/M期阻滞的分子基础可能是降低P34cdc2蛋白和cyclinB1蛋白水平，且与改变Mpm2蛋白磷酸化水平有关；抑制细胞S期的作用与PCNA蛋白表达无关，可能受其它S期相关蛋白调节。云南霉素抗肿瘤的分子机理研究，为云南霉素应用于肿瘤治疗提供了理论基础。
基金项目：本课题受国家重点基础研究发展规划973项目(编号G1998051200)资助
通讯作者：甄永苏 Tel:86-10-63010985 Fax：86-10-63017302 E-mail:zhenys@public.bta.net.cn
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收稿日期：2000-03-20, 百拇医药