慢性乙型肝炎用干扰素治疗的Th1/Th2应答
作者：邢同京 章廉 卢桥生 侯金林 冯筱榕 骆抗先
单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院感染内科
关键词：肝炎；乙型；免疫监测；干扰素α
中华医学杂志000409 【摘要】 目的 探讨干扰素α的疗效是否与调节Th1/Th2细胞因子的表达有关，并以此作为预测干扰素α疗效指标的可能性。方法 采用双抗体夹心法和逆转录PCR方法，对应用干扰素治疗的23例慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中Th1/Th2细胞因子的表达水平进行动态检测。结果 与正常对照组比较，慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞培养上清液中的干扰素α(IFN-γ)水平较低，但差异无显著意义；白细胞介素4(IL-4)水平则升高，差异有显著意义。其外周血淋巴细胞中的mRNA表达水平亦如此。与治疗前比较，干扰素α治疗后3和6个月，在完全应答的患者中，IL-4水平下降；而IFN-γ水平在6个月时升高，差异均有显著意义。结论 慢性乙型肝炎患者的外周血淋巴细胞中Th1/Th2细胞因子的表达水平与干扰素α的疗效密切相关。检测Th1/Th2细胞因子的变化，可预测患者对干扰素α治疗的反应，对及时判断干扰素α疗效有一定作用。
, 百拇医药
Predictor of effect of interferon-α on patients with hepatitis B: Th1/Th2 type cytokines
XING Tongjing
(South Hospital of The First Military Medical University, Guangzhou 510515 China)
ZHANG Lian
(South Hospital of The First Military Medical University, Guangzhou 510515 China)
LU Qiaosheng
, 百拇医药 (South Hospital of The First Military Medical University, Guangzhou 510515 China)
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of Th1/Th2 type cytokines and the effect of interferon-α therapy. Methods Th1/Th2 type cytokines were detected by ELISA and RT-PCR in 23 patients with chronic hepatitis B who were treated with interferon-α for 24 weeks. Results The levels of IFN-γ in the supernatant of PBMC cultures of the patients with hepatitis B were slightly lower than those of the controls. However, the levels of IL-4 were higher in the patients than in the controls. Cytokines measurements during IFN-α treatment showed a trend toward decreased levels of IL-4 at 4, 12 and 24 weeks. However, the levels of IFN-γ were slightly increased following IFN-α treatment. In patients with complete response to IFN-α, the levels of IFN-γ were higher than that of pre-treatment at 24 weeks following IFN-α treatment, and the levels of IL-4 decreased obviously at 12 and 24 weeks. The mRNA levels of Th1/Th2 type cytokines were positively correlated with the levels of supernatant. Conclusion (1) The expression of Th2 type cytokines is predominant in patients with chronic hepatitis B. (2) The effect of interferon-α therapy may play a role in modulating the balance of Th1/Th2 type cytokines. (3) Variations of the levels of Th1/Th2 type cytokines could be used as a predictor of clinical response during interferon-α treatment.
, 百拇医药
【Key words】 Chronic Hepatitis B； Monitoring, Immunologic； Interferon-α
干扰素α是目前公认的治疗慢性乙型肝炎的有效药物之一，然而不同个体的应答并不相同，表现为完全、部分或无应答，产生这种现象的原因目前尚不十分清楚。研究表明，干扰素α能够通过调节Th1/Th2细胞因子的表达水平而发挥其治疗作用[1，2]，而Th1/Th2细胞失衡与慢性乙型肝炎密切相关[3]。为此，我们采用双抗体夹心法和逆转录PCR(RT-PCR)方法，对应用干扰素α治疗的慢性乙型肝炎患者Th1/Th2细胞因子的表达水平进行动态检测，旨在进一步阐明干扰素α疗效是否与调节Th1/Th2细胞因子的表达有关，并以此作为预测干扰素α疗效指标的可能性。
对象与方法
1.对象：收集我院1998～1999年23例慢性乙型肝炎患者，男18例，女5例，年 龄18～60岁，平均32岁±10岁。按1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎标准诊断[4]。纳入标准：丙氨酸转氨酶(ALT)>100 U/L，乙型肝炎标志物：HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性，HBV DNA阳性。排除HAV、HCV、HDV、HEV感染，排除近3个月应用糖皮质激素等影响免疫功能药物的患者，并均行肝穿刺组织病理检查确定诊断。
, 百拇医药
2.治疗方案：干扰素α 500万U，3次/周，皮下注射，疗程6个月。分别于治疗前、治疗后1、3、6个月抽血检测，同时化验肝功能、乙型肝炎标志物及HBV DNA(采用斑点杂交法)。疗效判断标准：完全应答：ALT恢复正常，HBeAg阴转，HBV DNA阴性；无应答：无一项达到完全应答标准；部分应答：有一项或者两项达到完全应答标准。
3.标本的采集与处理：无菌采集肝素抗凝静脉血5 ml，常规分离外周血单个核细胞(PBMC)，粘附法除去单核细胞，用RPMI 1640培养液稀释至1×106个/ml, 台盼蓝染色，细胞活力>95%，种入24孔细胞培养板，加入植物血凝素(PHA)，终浓度为100 μg/ml，置37℃，体积分数为0.05的CO2培养箱培养72 h，离心后收集上清和细胞，分别于-20℃、-70℃保存待测。同时收集正常献血员抗凝血作为对照。
4.细胞因子检测: 采用双抗体夹心法，IFN-γ和白细胞介素4(IL-4)试剂盒购自美国Genzyme公司，按试剂盒说明书操作。
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5.RT-PCR：(1)总RNA抽提：按美国Promega公司RNA提取试剂盒说明书提取淋巴细胞总RNA，要求所提RNA经紫外分光度仪分析A260/A280≥1.8，质量分数为0.01的RNA甲醛变性凝胶电泳证实28S和18S真核细胞RNA比值为2∶1[5，6]。(2)引物选择与合成：IFN-γ和IL-4引物的选择见文献[7]，扩增片段分别为507 bp和456 bp，内参照β-actin引物由本室自行设计，扩增片段为174 bp。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。(3)cDNA合成:以所抽提RNA为模板，Oligo dT为引物，在MMLV逆转录酶(美国Promega公司)作用下合成cDNA。20 μl逆转录反应体系，37℃反应1 h。反应产物于94℃灭活5 min。(4)基因扩增：50 μl PCR反应体系加入：10×dNTP 5 μl，5×PCR buffer 10 μl，逆转录产物5 μl，正、负链引物(β-actin和IFN-γ或IL-4)各1 μl，Taq DNA聚合酶5 U，加去离子水补至50 μl。94℃变性3 min，进入PCR 循环：94℃ 50 s、56℃ 50 s、72℃60 s，30个周期，72℃ 5 min结束反应。(5)取PCR反应产物5～10 μl加适量溴酚蓝，质量分数为0.02的琼脂糖电泳，紫外线灯下观察，应用美国Gene公司Molecular Analysis 软件分析，用IFN-γ和IL-4/β-actin比值分别表示IFN-γ和IL-4的表达水平。
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6.统计学处理：结果以均值±标准差表示，组间比较采用多样本均数F检验，治疗前后比较采用自身配对t检验,相关分析采用直线相关。
结果
1. 23例慢性乙型肝炎和20例正常对照外周血淋巴细胞培养上清液中细胞因子的水平见表1。结果显示：与正常对照组比较，慢性乙型肝炎患者的IFN-γ水平较低，应用干扰素-α治疗后1、3和6个月，其IFN-γ水平较治疗前升高，但差异无显著意义；而其IL-4水平明显增高，治疗后的IL-4水平明显降低，与治疗前比较差异有显著意义。
表1 慢性乙型肝炎和正常对照外周血细胞培养
上清液中细胞因子的含量(
±s) 组别
例数
, 百拇医药
IFN-γ(pg/ml)
IL-4(pg/ml)
对照组
20
1 830±431
68±19
实验组
治疗前
23
1 479±300
269±56*
治疗1个月
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22
1 456±362
126±42△
治疗3个月
22
1 523±287
138±38△
治疗6个月
22
1 646±385
96±22△
注：*与正常对照组比较t=2.74，P=0.01；△与治疗前比较t=2.56、2.32、2.97，P=0.02、0.03、0.01 2.随访22例慢性乙型肝炎患者，其中完全应答 9例，部分应答8例，无应答5例，其培养细胞上清液中细胞因子的水平见表2。与治疗前比较，完全应答者的IFN-γ水平在治疗6个月时升高，而IL-4水平在治疗3个月和6个月时明显下降，差异均有显著意义。
, 百拇医药
表2 干扰素α治疗不同应答与细胞因子水平的
关系(±s) 组别
例数
时间
IFN-γ(pg/ml)
IL-4(pg/ml)
完全应答
9
治疗前
1 384±126
252±80
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治疗1个月
1 639±259
102±35
治疗3个月
1 650±198
70±21△
治疗6个月
1 825±214*
81±29△
部分应答
8
治疗前
, 百拇医药
1 565±164
309±117
治疗1个月
1 499±195
244±93
治疗3个月
1 548±226
218±75
治疗6个月
1 626±170
176±49
无应答
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5
治疗前
1 411±249
173±72
治疗1个月
1 047±209
155±54
治疗3个月
1 366±221
145±34
治疗6个月
1 280±179
, 百拇医药
132±39
注：*与治疗前比较F=3.76，P=0.04；△与治疗前比较，F=4.12，3.97，P=0.02,0.03 3. 22例慢性乙型肝炎患者治疗前后外周血淋巴细胞中IFN-γ和IL-4 mRNA表达见表3、图1。结果显示，与正常对照组比较，慢性乙型肝炎患者的IFN-γ mRNA的表达水平较低，应用干扰素-α治疗后1、3和6个月，其水平较治疗前升高，但差异无显著意义；而IL-4 mRNA的表达水平明显高于正常对照值，治疗后3个月，IL-4 mRNA的表达水平较治疗前降低，差异均有显著意义。相关分析表明：慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中IFN-γ和IL-4 mRNA的表达水平与培养上清液中细胞因子的水平高度相关，其相关系数(r)见表3。
表3 慢性乙型肝炎患者治疗前后外周血淋巴细胞中
IFN-γ和IL-4 mRNA的表达(±s) 组别
, 百拇医药
例数
IFN-γ
r
IL-4
r
正常对照组
20
0.74±0.26
0.59▲
0.13±0.05
0.61▲
实验组治疗前
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23
0.61±0.12
0.57▲
0.29±0.11△
0.72▲
治疗1个月
22
0.69±0.17
0.69▲
0.21±0.07
0.78▲
, 百拇医药
3个月
22
0.73±0.23
0.48▲
0.18±0.08*
0.66▲
6个月
22
0.71±0.20
0.51▲
0.23±0.09
, http://www.100md.com 0.49▲
注：△与正常对照组比较，t=2.54，P=0.02；*与治疗前比较，t=2.28，P=0.04；▲P<0.05
M：DNA相对分子质量标志；1.IFN-γ(507 bp)；2，4为空白对照；3.IL-4(456 bp)
图1 RT-PCR检测慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞
IFN-γ和IL-4 mRNA表达
讨论
目前研究认为，HBV抗原特异的Th1/Th2细胞亚群之间的平衡关系可能影响慢性化的发生和持续。HBV抗原特异的Th1细胞占据优势，倾向于发生急性或自限性感染，而Th2细胞占据优势，倾向于发生持续性的HBV感染[8-10]。本研究结果显示，与正常对照组比较，不论是培养上清液含量还是细胞内mRNA的表达水平，慢性乙型肝炎患者的IFN-γ的水平均较低，但差异无显著意义，而IL-4水平明显升高，差异有显著意义(P=0.01)，提示慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中细胞因子的表达以Th2类占优势，Th2类细胞因子抑制宿主的细胞免疫应答，可能与乙型肝炎的慢性化有关。
, 百拇医药
Rogge等[2]研究发现干扰素α能诱导IL-12R β2亚单位的表达，从而使Th0细胞向Th1分化，这可能是干扰素α调节Th1/Th2细胞平衡的分子机制之一。研究表明，干扰素α能够调节Th1/Th2细胞因子的表达水平，从而发挥其治疗作用[11]。表2结果显示，与治疗前比较，完全应答者的IFN-γ水平在干扰素α治疗后6个月较治疗前升高，差异有显著意义(P=0.04)；而IL-4水平在治疗后3和6个月显著下降，差异有显著意义(P=0.02、0.03)，提示慢性乙型肝炎患者的外周血淋巴细胞中Th1/Th2细胞因子的表达水平与干扰素α的疗效密切相关。通过检测Th1/Th2细胞因子的变化，可以预测患者对干扰素α治疗的反应，对及时判断干扰素α治疗效果有一定作用。
因此，我们认为，检测Th1/Th2细胞因子的变化，不仅可能作为一种判断慢性乙型肝炎患者免疫功能的定量指标，而且对于指导干扰素等药物的临床应用有重要意义，但其在临床上的实际应用价值尚需进一步的探讨。
, 百拇医药
参考文献
1，Finkelman FD, Svetic A, Gresser I, et al. Regulation by interferon-α of immunoglobulin isotype selection and lymphokine production in mice. J Exp Med, 1991，174:1179-1188.
2 Rogge L, Maino LB, Biffi M, et al. Selective expression of interleukin-12 receptor component by human T helper 1 cells. J Exp Med, 1997, 185: 825-829.
3，Milich DR. Influence of T-helper cell subsets and crossgulation in hepatitis B virus infection. J Viral Hepat, 1997, 4 Suppl. 2: 48-59.
, 百拇医药
4 病毒性肝炎防治方案(试行). 中华传染病杂志，1995，13：241-247.
5，Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Ann Biochem, 1987,162:156-159.
6，Bishop GA, Rokahr KL, Napoli J, et al. Intragraft cytokine mRNA levels in human liver allograft rejection analysed by reverse transcriptase-PCR. Transpl Immunol, 1993,1:253-261.
7，Fukuda R, Ishimura N, Nguyen TX, et al. The expression of IL-2,IL-4 and IFN-γ mRNA using liver biopsies at different phases of acute exacerbation of chronic hepatitis B. Clin Exp Immunol, 1995,100: 446-451.
, http://www.100md.com
8，Bertoletti A, D’Elios MM, Boni C, et al. Different cytokine profiles of intrahepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infections. Gastroenterology, 1997, 112:193-199.
9，Lee M, Lee SK, Son M, et al. Expression of Th1 and Th2 type cytokines responding to HBsAg and HBxAg in chronic hepatitis B patients. J Korean Men Sci. 1999,14,175-181.
10，Nishimura T, Ohta A. A critical role for antigen-specific Th1 cells in acute liver injury in mice. J Immunol, 1999,162: 6503-6509.
11，Im EH, Lee BS, Sung JK, et al. T cell subunits in chronic hepatitis B and the effect of prednisolone withdrawal and interferon alpha -2b. Korean J Intern Med, 1999, 14:1-8.
(收稿日期：1999-05-07), 百拇医药
单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院感染内科
关键词：肝炎；乙型；免疫监测；干扰素α
中华医学杂志000409 【摘要】 目的 探讨干扰素α的疗效是否与调节Th1/Th2细胞因子的表达有关，并以此作为预测干扰素α疗效指标的可能性。方法 采用双抗体夹心法和逆转录PCR方法，对应用干扰素治疗的23例慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中Th1/Th2细胞因子的表达水平进行动态检测。结果 与正常对照组比较，慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞培养上清液中的干扰素α(IFN-γ)水平较低，但差异无显著意义；白细胞介素4(IL-4)水平则升高，差异有显著意义。其外周血淋巴细胞中的mRNA表达水平亦如此。与治疗前比较，干扰素α治疗后3和6个月，在完全应答的患者中，IL-4水平下降；而IFN-γ水平在6个月时升高，差异均有显著意义。结论 慢性乙型肝炎患者的外周血淋巴细胞中Th1/Th2细胞因子的表达水平与干扰素α的疗效密切相关。检测Th1/Th2细胞因子的变化，可预测患者对干扰素α治疗的反应，对及时判断干扰素α疗效有一定作用。
, 百拇医药
Predictor of effect of interferon-α on patients with hepatitis B: Th1/Th2 type cytokines
XING Tongjing
(South Hospital of The First Military Medical University, Guangzhou 510515 China)
ZHANG Lian
(South Hospital of The First Military Medical University, Guangzhou 510515 China)
LU Qiaosheng
, 百拇医药 (South Hospital of The First Military Medical University, Guangzhou 510515 China)
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of Th1/Th2 type cytokines and the effect of interferon-α therapy. Methods Th1/Th2 type cytokines were detected by ELISA and RT-PCR in 23 patients with chronic hepatitis B who were treated with interferon-α for 24 weeks. Results The levels of IFN-γ in the supernatant of PBMC cultures of the patients with hepatitis B were slightly lower than those of the controls. However, the levels of IL-4 were higher in the patients than in the controls. Cytokines measurements during IFN-α treatment showed a trend toward decreased levels of IL-4 at 4, 12 and 24 weeks. However, the levels of IFN-γ were slightly increased following IFN-α treatment. In patients with complete response to IFN-α, the levels of IFN-γ were higher than that of pre-treatment at 24 weeks following IFN-α treatment, and the levels of IL-4 decreased obviously at 12 and 24 weeks. The mRNA levels of Th1/Th2 type cytokines were positively correlated with the levels of supernatant. Conclusion (1) The expression of Th2 type cytokines is predominant in patients with chronic hepatitis B. (2) The effect of interferon-α therapy may play a role in modulating the balance of Th1/Th2 type cytokines. (3) Variations of the levels of Th1/Th2 type cytokines could be used as a predictor of clinical response during interferon-α treatment.
, 百拇医药
【Key words】 Chronic Hepatitis B； Monitoring, Immunologic； Interferon-α
干扰素α是目前公认的治疗慢性乙型肝炎的有效药物之一，然而不同个体的应答并不相同，表现为完全、部分或无应答，产生这种现象的原因目前尚不十分清楚。研究表明，干扰素α能够通过调节Th1/Th2细胞因子的表达水平而发挥其治疗作用[1，2]，而Th1/Th2细胞失衡与慢性乙型肝炎密切相关[3]。为此，我们采用双抗体夹心法和逆转录PCR(RT-PCR)方法，对应用干扰素α治疗的慢性乙型肝炎患者Th1/Th2细胞因子的表达水平进行动态检测，旨在进一步阐明干扰素α疗效是否与调节Th1/Th2细胞因子的表达有关，并以此作为预测干扰素α疗效指标的可能性。
对象与方法
1.对象：收集我院1998～1999年23例慢性乙型肝炎患者，男18例，女5例，年 龄18～60岁，平均32岁±10岁。按1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎标准诊断[4]。纳入标准：丙氨酸转氨酶(ALT)>100 U/L，乙型肝炎标志物：HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性，HBV DNA阳性。排除HAV、HCV、HDV、HEV感染，排除近3个月应用糖皮质激素等影响免疫功能药物的患者，并均行肝穿刺组织病理检查确定诊断。
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2.治疗方案：干扰素α 500万U，3次/周，皮下注射，疗程6个月。分别于治疗前、治疗后1、3、6个月抽血检测，同时化验肝功能、乙型肝炎标志物及HBV DNA(采用斑点杂交法)。疗效判断标准：完全应答：ALT恢复正常，HBeAg阴转，HBV DNA阴性；无应答：无一项达到完全应答标准；部分应答：有一项或者两项达到完全应答标准。
3.标本的采集与处理：无菌采集肝素抗凝静脉血5 ml，常规分离外周血单个核细胞(PBMC)，粘附法除去单核细胞，用RPMI 1640培养液稀释至1×106个/ml, 台盼蓝染色，细胞活力>95%，种入24孔细胞培养板，加入植物血凝素(PHA)，终浓度为100 μg/ml，置37℃，体积分数为0.05的CO2培养箱培养72 h，离心后收集上清和细胞，分别于-20℃、-70℃保存待测。同时收集正常献血员抗凝血作为对照。
4.细胞因子检测: 采用双抗体夹心法，IFN-γ和白细胞介素4(IL-4)试剂盒购自美国Genzyme公司，按试剂盒说明书操作。
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5.RT-PCR：(1)总RNA抽提：按美国Promega公司RNA提取试剂盒说明书提取淋巴细胞总RNA，要求所提RNA经紫外分光度仪分析A260/A280≥1.8，质量分数为0.01的RNA甲醛变性凝胶电泳证实28S和18S真核细胞RNA比值为2∶1[5，6]。(2)引物选择与合成：IFN-γ和IL-4引物的选择见文献[7]，扩增片段分别为507 bp和456 bp，内参照β-actin引物由本室自行设计，扩增片段为174 bp。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。(3)cDNA合成:以所抽提RNA为模板，Oligo dT为引物，在MMLV逆转录酶(美国Promega公司)作用下合成cDNA。20 μl逆转录反应体系，37℃反应1 h。反应产物于94℃灭活5 min。(4)基因扩增：50 μl PCR反应体系加入：10×dNTP 5 μl，5×PCR buffer 10 μl，逆转录产物5 μl，正、负链引物(β-actin和IFN-γ或IL-4)各1 μl，Taq DNA聚合酶5 U，加去离子水补至50 μl。94℃变性3 min，进入PCR 循环：94℃ 50 s、56℃ 50 s、72℃60 s，30个周期，72℃ 5 min结束反应。(5)取PCR反应产物5～10 μl加适量溴酚蓝，质量分数为0.02的琼脂糖电泳，紫外线灯下观察，应用美国Gene公司Molecular Analysis 软件分析，用IFN-γ和IL-4/β-actin比值分别表示IFN-γ和IL-4的表达水平。
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6.统计学处理：结果以均值±标准差表示，组间比较采用多样本均数F检验，治疗前后比较采用自身配对t检验,相关分析采用直线相关。
结果
1. 23例慢性乙型肝炎和20例正常对照外周血淋巴细胞培养上清液中细胞因子的水平见表1。结果显示：与正常对照组比较，慢性乙型肝炎患者的IFN-γ水平较低，应用干扰素-α治疗后1、3和6个月，其IFN-γ水平较治疗前升高，但差异无显著意义；而其IL-4水平明显增高，治疗后的IL-4水平明显降低，与治疗前比较差异有显著意义。
表1 慢性乙型肝炎和正常对照外周血细胞培养
上清液中细胞因子的含量(
±s) 组别例数
, 百拇医药
IFN-γ(pg/ml)
IL-4(pg/ml)
对照组
20
1 830±431
68±19
实验组
治疗前
23
1 479±300
269±56*
治疗1个月
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22
1 456±362
126±42△
治疗3个月
22
1 523±287
138±38△
治疗6个月
22
1 646±385
96±22△
注：*与正常对照组比较t=2.74，P=0.01；△与治疗前比较t=2.56、2.32、2.97，P=0.02、0.03、0.01 2.随访22例慢性乙型肝炎患者，其中完全应答 9例，部分应答8例，无应答5例，其培养细胞上清液中细胞因子的水平见表2。与治疗前比较，完全应答者的IFN-γ水平在治疗6个月时升高，而IL-4水平在治疗3个月和6个月时明显下降，差异均有显著意义。
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表2 干扰素α治疗不同应答与细胞因子水平的
关系(
±s) 组别例数
时间
IFN-γ(pg/ml)
IL-4(pg/ml)
完全应答
9
治疗前
1 384±126
252±80
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治疗1个月
1 639±259
102±35
治疗3个月
1 650±198
70±21△
治疗6个月
1 825±214*
81±29△
部分应答
8
治疗前
, 百拇医药
1 565±164
309±117
治疗1个月
1 499±195
244±93
治疗3个月
1 548±226
218±75
治疗6个月
1 626±170
176±49
无应答
, http://www.100md.com
5
治疗前
1 411±249
173±72
治疗1个月
1 047±209
155±54
治疗3个月
1 366±221
145±34
治疗6个月
1 280±179
, 百拇医药
132±39
注：*与治疗前比较F=3.76，P=0.04；△与治疗前比较，F=4.12，3.97，P=0.02,0.03 3. 22例慢性乙型肝炎患者治疗前后外周血淋巴细胞中IFN-γ和IL-4 mRNA表达见表3、图1。结果显示，与正常对照组比较，慢性乙型肝炎患者的IFN-γ mRNA的表达水平较低，应用干扰素-α治疗后1、3和6个月，其水平较治疗前升高，但差异无显著意义；而IL-4 mRNA的表达水平明显高于正常对照值，治疗后3个月，IL-4 mRNA的表达水平较治疗前降低，差异均有显著意义。相关分析表明：慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中IFN-γ和IL-4 mRNA的表达水平与培养上清液中细胞因子的水平高度相关，其相关系数(r)见表3。
表3 慢性乙型肝炎患者治疗前后外周血淋巴细胞中
IFN-γ和IL-4 mRNA的表达(
±s) 组别, 百拇医药
例数
IFN-γ
r
IL-4
r
正常对照组
20
0.74±0.26
0.59▲
0.13±0.05
0.61▲
实验组治疗前
, http://www.100md.com
23
0.61±0.12
0.57▲
0.29±0.11△
0.72▲
治疗1个月
22
0.69±0.17
0.69▲
0.21±0.07
0.78▲
, 百拇医药
3个月
22
0.73±0.23
0.48▲
0.18±0.08*
0.66▲
6个月
22
0.71±0.20
0.51▲
0.23±0.09
, http://www.100md.com 0.49▲
注：△与正常对照组比较，t=2.54，P=0.02；*与治疗前比较，t=2.28，P=0.04；▲P<0.05
M：DNA相对分子质量标志；1.IFN-γ(507 bp)；2，4为空白对照；3.IL-4(456 bp)
图1 RT-PCR检测慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞
IFN-γ和IL-4 mRNA表达
讨论
目前研究认为，HBV抗原特异的Th1/Th2细胞亚群之间的平衡关系可能影响慢性化的发生和持续。HBV抗原特异的Th1细胞占据优势，倾向于发生急性或自限性感染，而Th2细胞占据优势，倾向于发生持续性的HBV感染[8-10]。本研究结果显示，与正常对照组比较，不论是培养上清液含量还是细胞内mRNA的表达水平，慢性乙型肝炎患者的IFN-γ的水平均较低，但差异无显著意义，而IL-4水平明显升高，差异有显著意义(P=0.01)，提示慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中细胞因子的表达以Th2类占优势，Th2类细胞因子抑制宿主的细胞免疫应答，可能与乙型肝炎的慢性化有关。
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Rogge等[2]研究发现干扰素α能诱导IL-12R β2亚单位的表达，从而使Th0细胞向Th1分化，这可能是干扰素α调节Th1/Th2细胞平衡的分子机制之一。研究表明，干扰素α能够调节Th1/Th2细胞因子的表达水平，从而发挥其治疗作用[11]。表2结果显示，与治疗前比较，完全应答者的IFN-γ水平在干扰素α治疗后6个月较治疗前升高，差异有显著意义(P=0.04)；而IL-4水平在治疗后3和6个月显著下降，差异有显著意义(P=0.02、0.03)，提示慢性乙型肝炎患者的外周血淋巴细胞中Th1/Th2细胞因子的表达水平与干扰素α的疗效密切相关。通过检测Th1/Th2细胞因子的变化，可以预测患者对干扰素α治疗的反应，对及时判断干扰素α治疗效果有一定作用。
因此，我们认为，检测Th1/Th2细胞因子的变化，不仅可能作为一种判断慢性乙型肝炎患者免疫功能的定量指标，而且对于指导干扰素等药物的临床应用有重要意义，但其在临床上的实际应用价值尚需进一步的探讨。
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(收稿日期：1999-05-07), 百拇医药