黑海参多糖对β-淀粉样蛋白诱导的皮质神经元凋亡的保护作用△
作者：邱鹏新 黎明涛 唐孝礼 苏兴文 林穗珍 颜光美
单位：中山医科大学药理教研室(广州 510089)
关键词：黑海参多糖；β-淀粉样蛋白；皮质神经元；凋亡
中草药000418摘 要 体外培养大鼠皮质神经元，用β-淀粉样蛋白(β-AP)诱导皮质神经元凋亡。黑海参多糖使皮质神经元存活率增加，使神经元的DNA电泳图谱不出现“梯子状”，使神经元的流式细胞仪分析图上不出现凋亡峰，表明黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元凋亡具有保护作用。
Protective Effects of Polysaccharide from Holothuria
atra on Apoptosis of Cortical Neurons
, http://www.100md.com
Induced by Amyloid β-Protein
Department of Pharmacology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences (Guangzhou 510089) Qiu Pengxin, Li Mingtao, Tang Xiaoli, Su Xingwen, Lin Suizhen and Yan Guangmei
Abstract Cortical neurons were cultured in vitro and induced to apoptosis by amyloid β-protein (β-AP). Polysaccharides from several TCM were screened with the apoptotic model. It was found that the polysaccharide obtained from Holothuria atra Jaegar increased the survival rate of cortical neurons in a dose dependent manner, and prevented the neuronal nuclei from shrinkage, condensation and cleavage induced by β-AP. It also prevented neuronal nuclear DNA fragmentation and blocked the neuronal apoptotic peak induced by β-AP. These results indicated that polysaccharide from H. atra can block cortical neuronal apoptosis induced by β-AP.
, 百拇医药
Key words polysaccharide from Holothuria atra Jaeger amyloid β-protein (β-AP) cortical neurons apoptosis
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)目前已被列入危害人体健康的主要疾病之一。β-淀粉样蛋白(β-AP)的神经元毒性是AD的分子病理学基础，最近用转基因动物模型过度表达β-AP成功地再现了AD的中枢神经系统病理变化，进一步使β-AP在AD的发病机制上的作用成为公论[1，2]。神经元表面的多聚糖蛋白(proteoglycans)可能介导β-AP与神经元的相互作用，这一相互作用是β-AP神经毒性效应所必需的，而这些多聚糖蛋白以肝素或类肝素为结合β-AP的分子基础[3]。许多具有抗衰老作用的中药(如灵芝、银耳、黑海参、茯苓)富含具有生物活性的多糖类物质，其临床应用在国内已得到证实，因此推测某些天然生物多糖可能具有防止中枢神经元退行性病变的作用。我们利用β-AP诱导皮质神经元凋亡模型，对一些中药多糖的药理活性进行了筛选，结果发现黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元损伤有明显的保护作用。
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1 实验材料
1.1 样品与试剂：黑海参多糖由本课题组采用酶法和碱法消化、醋酸钾和乙醇分级沉淀，从新鲜黑海参Holothuria atra Jaeger的体壁中分离得到，分子量为10 253 Da，经琼脂糖电泳证实为单一成分，多糖组成中氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、硫酸基含量分别为16.12%、17.88%、11.66%和23.52%[4]。β-AP购自美国RBI，Hoechst 33258荧光染料、碘化丙碇(propidium iodide,PI)和脱氧核糖核酸酶(Dnase-I)购自美国Sigma公司，阿糖胞苷(Ara-C)购自Upjohn公司，琼脂糖购自Promega公司，多聚赖氨酸(分子量15 000)、Neurobasal Medium和BME培养基为Gibco公司产品，其它试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器：荧光显微镜、电泳仪、流式细胞仪、超净工作台(北京半导体设备一厂)；二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司)；培养皿(美国Costar公司)。
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1.3 动物：清洁级SD孕鼠，孕期18 d，由中山医科大学实验动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 大鼠皮质神经元原代培养：无菌条件下取出胎鼠，分离脑皮质，放入无Ca2+、Ma2+ Hank's平衡液中洗净，在含0.05%胰酶和0.53 mmol/L EDTA的溶液中剪碎，37 ℃孵育15 min，加等体积含0.05%胰酶抑制剂和50 μg/mL Dnase-I的Hank's平衡液，200 g离心5 min，沉淀 用含Ca2+、Mg2+ Hank's平衡液洗1次，用含10%小牛血清的培养基稀释至细胞密度为8×105 cells/mL，接种于预先铺有多聚赖氨酸的35 mm培养皿中，每皿2 mL，在含5%CO2、95%空气的二氧化碳培养箱中培养48 h，换含20% B27和0.5 mmol/L谷氨酰胺的培养基。第7天加黑海参多糖或β-AP处理。
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2.2 细胞存活率检测：皮质神经元培养至第7天，各皿加不同浓度的黑海参多糖和50 μmol/L β-AP，继续培养48 h，去培养基，用含Ca2+、Ma2+ PBS洗1次，加5 μg/mL FDA (fluorescein diacetate)染色5 min，用含Ca2+、Mg2+ PBS洗1次，在荧光显微镜下观察并拍照，每皿拍3 个不同视野，在照片上对神经元的存活率进行统计学分析[5]。结果显示，随着黑海参多糖浓度的增加，β-AP处理后的神经元的存活率升高，当黑海参多糖的浓度达到100 μg/mL时，神经元的存活率可达100%，说明黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元凋亡的保护作用是剂量依赖性的(图1)。
图1 不同浓度的黑海参多糖对β-AP(50 μmol/L)处理的皮质神经元存活率的影响
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2.3 神经元凋亡的细胞核形态学检测：实验分4组：空白对照组，β-AP组(50 μmol/L)，黑海参多糖组(50 μg/mL黑海参多糖)，黑海参多糖+β-AP组(50 μg/mL黑海参多糖+50 μmol/L β-AP)。加药后继续培养48 h，去培养基，用含Ca2+、Mg2+ PBS洗1次，用4%的多聚甲醛固定10 min，用PBS洗1次，自然晾干后加5 μg/mL Hoechst 33258染色10 min，双蒸水冲洗2次，晾干，荧光显微镜下观察并拍照[6]。结果显示，用β-AP处理的皮质神经元，其细胞核明显固缩、凝聚和断裂(图2-B)，而50 μg/mL黑海参多糖+50 μmol/L β-AP组神经元的细胞核(图2-D)和黑海参多糖组神经元的细胞核(图2-C)与空白对照组神经元的细胞核(图2-A)形态接近，说明黑海参多糖对皮质神经元没有毒性，对β-AP诱导的皮质神经元凋亡有明显的保护作用。
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A-空白对照；B-经50 μmol/L β-AP处理的神经元；C-加50 μg/mL黑海参多糖的神经元；
D-加50 μg/mL黑海参多糖后用50 μmol/L β-AP处理的神经元
图2 用Hoechst 33258染色分析神经元凋亡的形态变化
2.4 DNA提取与电泳分析：实验分组同2.3。加药后继续培养48 h，去培养基，用含Ca2+、Mg2+ PBS洗1次，0.125%胰酶消化10 min，收集5×106细胞，用裂解液(含0.2% Triton、50 mmol/L Tris、10 mmol/L EDTA)裂解后，酚、氯仿抽提，样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照[7]。以Yan等8，11]建立的小脑颗粒神经元低钾凋亡模型提取的DNA电泳作标准对照(图3-B)。结果显示，50 μg/mL黑海参多糖+50 μmol/L β-AP组(图3-E)细胞DNA与空白对照组(图3-C)细胞DNA一样，在琼脂糖凝胶上电泳显示分子量很大的一条带，说明前两组细胞没有发生凋亡；而50 μmol/L β-AP组细胞DNA电泳显示清晰的“DNA梯”(图3-D)，说明β-AP诱导皮质神经元发生凋亡。
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A-DNA标准分子量参照物； B-标准凋亡模型对照(5 mmol/L K+中培养的小脑颗粒神经元)； C-空白对照； D-用50 μmol/L β-AP处理的神经元； E-加50 μg/mL黑海参多糖后用50 μmol/L β-AP处理的神经元
图3 神经元凋亡的DNA凝胶电泳分析
2.5 流式细胞仪定量分析细胞凋亡峰：实验分组同2.3。加药后继续培养48 h，去培养基，用PBS洗2次，0.125%胰酶消化5 min，收集1×106细胞，将细胞悬浮于pH7.4 PBS中，用4#注射针头抽吸使成单个细胞悬液，用预先冷却至-20 ℃的70%乙醇固定细胞，4 ℃过夜，200 g×5 min离心收集细胞，弃乙醇，将细胞悬浮于含有50 mg/L碘化丙碇、50 mg/L Rnase-I的染液中，避光于37 ℃温育1 h后进行流式细胞仪测定，采集荧光强度值并以仪器所配软件进行数据处理[9]。结果显示，50 μg/mL黑海参多糖组(图4-D)和正常对照组(图4-A)一样均无亚G1峰出现，50 μmol/L β-AP组(图4-B)出现明显的亚G1峰，50 μg/mL黑海参多糖+50 μmol/L β-AP组(图4-C)的亚G1峰几乎消失，说明黑海参多糖不会诱导皮质神经元凋亡。而对β-AP诱导的皮质神经元凋亡有明显的保护作用。
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A-空白对照； B-经50 μmol/L β-AP处理的神经元； C-加50 μg/mL黑海参多糖的神经元；
D-加50 μg/mL黑海参多糖后用50 μmol/L β-AP处理的神经元
图4 流式细胞仪对细胞凋亡峰的定量分析
3 讨论
程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)是机体在发育过程中清除多余细胞的生理性自杀过程，也称凋亡(apoptosis)。估计在胚胎发育或出生后的早期阶段，中枢神经系统有多达50%以上的神经元发生程序性死亡。越来越多的证据表明，某些神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森氏症(Parkinson's disease)等是由于中枢神经发生了病理性的程序性死亡[10]。国内外对于中枢神经系统细胞凋亡的研究，多采用原代培养的中枢神经元，用某些因素诱导神经元发生凋亡，以研究神经元凋亡的机制或抗凋亡药物的作用机制[11]。细胞发生凋亡时，出现明显的核固缩、凝聚、断裂，形成凋亡小体，细胞DNA电泳时出现明显的“梯子状”，在流式细胞仪DNA定量分析图谱上出现显著的凋亡峰，通过这些凋亡特征的检测，可以定性定量分析细胞凋亡的情况。本文采用原代培养的大鼠皮质神经元，以β-AP诱导神经元凋亡，然后从细胞存活率、细胞核形态观察、DNA断裂的凝胶电泳分析及流式细胞仪凋亡峰的定量分析等方面均确证β-AP诱导的皮质神经元死亡是典型的细胞凋亡，黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元凋亡有明显的保护作用。
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黑海参多糖与肝素一样，都是酸性粘多糖，因此，我们从研究结果推测，神经元细胞上可能存在酸性粘多糖的特异性受体，酸性粘多糖对神经元的保护作用是通过受体介导的。目前，受体的分离纯化及黑海参多糖的分子作用机制研究正在进行之中。
由国家杰出青年基金(No.396250022)、国家自然科学基金(No.39770851、No.39870265)和广东省自然科学基金(No.960125)资助
邱鹏新 男，37岁，副主任技师
参考文献
1，Frank, M L, et al. Nature Genetics, 1995,9:21
2，Barger, S W, et al. Nature, 1997, 388:878
, 百拇医药
3，Yan G M, et al. International Symposium of Alzheimer's disease. Osaka, Japan, 1996
4，唐孝礼，等.中药材，1999，22(5)：223
5，Yan G M, et al. Mol Pharmacol, 1995,47:248
6，Yan G M, et al. J Neurochem, 1995, 65:2425
7，Yan G M, et al. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 274:983
8，Yan G M, et al. Brain Res, 1994, 656:43
9，黎明涛，等.生物化学与生物物理学报，1997， 29 (5)：495
10，Bains J S, et al. Brain Res Brain Res Rev, 1997, 25 (3):335
11，颜光美.中山医科大学学报，1998， 19 (1)：1
(1999-06-29 收稿), 百拇医药
单位：中山医科大学药理教研室(广州 510089)
关键词：黑海参多糖；β-淀粉样蛋白；皮质神经元；凋亡
中草药000418摘 要 体外培养大鼠皮质神经元，用β-淀粉样蛋白(β-AP)诱导皮质神经元凋亡。黑海参多糖使皮质神经元存活率增加，使神经元的DNA电泳图谱不出现“梯子状”，使神经元的流式细胞仪分析图上不出现凋亡峰，表明黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元凋亡具有保护作用。
Protective Effects of Polysaccharide from Holothuria
atra on Apoptosis of Cortical Neurons
, http://www.100md.com
Induced by Amyloid β-Protein
Department of Pharmacology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences (Guangzhou 510089) Qiu Pengxin, Li Mingtao, Tang Xiaoli, Su Xingwen, Lin Suizhen and Yan Guangmei
Abstract Cortical neurons were cultured in vitro and induced to apoptosis by amyloid β-protein (β-AP). Polysaccharides from several TCM were screened with the apoptotic model. It was found that the polysaccharide obtained from Holothuria atra Jaegar increased the survival rate of cortical neurons in a dose dependent manner, and prevented the neuronal nuclei from shrinkage, condensation and cleavage induced by β-AP. It also prevented neuronal nuclear DNA fragmentation and blocked the neuronal apoptotic peak induced by β-AP. These results indicated that polysaccharide from H. atra can block cortical neuronal apoptosis induced by β-AP.
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Key words polysaccharide from Holothuria atra Jaeger amyloid β-protein (β-AP) cortical neurons apoptosis
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)目前已被列入危害人体健康的主要疾病之一。β-淀粉样蛋白(β-AP)的神经元毒性是AD的分子病理学基础，最近用转基因动物模型过度表达β-AP成功地再现了AD的中枢神经系统病理变化，进一步使β-AP在AD的发病机制上的作用成为公论[1，2]。神经元表面的多聚糖蛋白(proteoglycans)可能介导β-AP与神经元的相互作用，这一相互作用是β-AP神经毒性效应所必需的，而这些多聚糖蛋白以肝素或类肝素为结合β-AP的分子基础[3]。许多具有抗衰老作用的中药(如灵芝、银耳、黑海参、茯苓)富含具有生物活性的多糖类物质，其临床应用在国内已得到证实，因此推测某些天然生物多糖可能具有防止中枢神经元退行性病变的作用。我们利用β-AP诱导皮质神经元凋亡模型，对一些中药多糖的药理活性进行了筛选，结果发现黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元损伤有明显的保护作用。
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1 实验材料
1.1 样品与试剂：黑海参多糖由本课题组采用酶法和碱法消化、醋酸钾和乙醇分级沉淀，从新鲜黑海参Holothuria atra Jaeger的体壁中分离得到，分子量为10 253 Da，经琼脂糖电泳证实为单一成分，多糖组成中氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、硫酸基含量分别为16.12%、17.88%、11.66%和23.52%[4]。β-AP购自美国RBI，Hoechst 33258荧光染料、碘化丙碇(propidium iodide,PI)和脱氧核糖核酸酶(Dnase-I)购自美国Sigma公司，阿糖胞苷(Ara-C)购自Upjohn公司，琼脂糖购自Promega公司，多聚赖氨酸(分子量15 000)、Neurobasal Medium和BME培养基为Gibco公司产品，其它试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器：荧光显微镜、电泳仪、流式细胞仪、超净工作台(北京半导体设备一厂)；二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司)；培养皿(美国Costar公司)。
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1.3 动物：清洁级SD孕鼠，孕期18 d，由中山医科大学实验动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 大鼠皮质神经元原代培养：无菌条件下取出胎鼠，分离脑皮质，放入无Ca2+、Ma2+ Hank's平衡液中洗净，在含0.05%胰酶和0.53 mmol/L EDTA的溶液中剪碎，37 ℃孵育15 min，加等体积含0.05%胰酶抑制剂和50 μg/mL Dnase-I的Hank's平衡液，200 g离心5 min，沉淀 用含Ca2+、Mg2+ Hank's平衡液洗1次，用含10%小牛血清的培养基稀释至细胞密度为8×105 cells/mL，接种于预先铺有多聚赖氨酸的35 mm培养皿中，每皿2 mL，在含5%CO2、95%空气的二氧化碳培养箱中培养48 h，换含20% B27和0.5 mmol/L谷氨酰胺的培养基。第7天加黑海参多糖或β-AP处理。
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2.2 细胞存活率检测：皮质神经元培养至第7天，各皿加不同浓度的黑海参多糖和50 μmol/L β-AP，继续培养48 h，去培养基，用含Ca2+、Ma2+ PBS洗1次，加5 μg/mL FDA (fluorescein diacetate)染色5 min，用含Ca2+、Mg2+ PBS洗1次，在荧光显微镜下观察并拍照，每皿拍3 个不同视野，在照片上对神经元的存活率进行统计学分析[5]。结果显示，随着黑海参多糖浓度的增加，β-AP处理后的神经元的存活率升高，当黑海参多糖的浓度达到100 μg/mL时，神经元的存活率可达100%，说明黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元凋亡的保护作用是剂量依赖性的(图1)。
图1 不同浓度的黑海参多糖对β-AP(50 μmol/L)处理的皮质神经元存活率的影响
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2.3 神经元凋亡的细胞核形态学检测：实验分4组：空白对照组，β-AP组(50 μmol/L)，黑海参多糖组(50 μg/mL黑海参多糖)，黑海参多糖+β-AP组(50 μg/mL黑海参多糖+50 μmol/L β-AP)。加药后继续培养48 h，去培养基，用含Ca2+、Mg2+ PBS洗1次，用4%的多聚甲醛固定10 min，用PBS洗1次，自然晾干后加5 μg/mL Hoechst 33258染色10 min，双蒸水冲洗2次，晾干，荧光显微镜下观察并拍照[6]。结果显示，用β-AP处理的皮质神经元，其细胞核明显固缩、凝聚和断裂(图2-B)，而50 μg/mL黑海参多糖+50 μmol/L β-AP组神经元的细胞核(图2-D)和黑海参多糖组神经元的细胞核(图2-C)与空白对照组神经元的细胞核(图2-A)形态接近，说明黑海参多糖对皮质神经元没有毒性，对β-AP诱导的皮质神经元凋亡有明显的保护作用。
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A-空白对照；B-经50 μmol/L β-AP处理的神经元；C-加50 μg/mL黑海参多糖的神经元；
D-加50 μg/mL黑海参多糖后用50 μmol/L β-AP处理的神经元
图2 用Hoechst 33258染色分析神经元凋亡的形态变化
2.4 DNA提取与电泳分析：实验分组同2.3。加药后继续培养48 h，去培养基，用含Ca2+、Mg2+ PBS洗1次，0.125%胰酶消化10 min，收集5×106细胞，用裂解液(含0.2% Triton、50 mmol/L Tris、10 mmol/L EDTA)裂解后，酚、氯仿抽提，样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照[7]。以Yan等8，11]建立的小脑颗粒神经元低钾凋亡模型提取的DNA电泳作标准对照(图3-B)。结果显示，50 μg/mL黑海参多糖+50 μmol/L β-AP组(图3-E)细胞DNA与空白对照组(图3-C)细胞DNA一样，在琼脂糖凝胶上电泳显示分子量很大的一条带，说明前两组细胞没有发生凋亡；而50 μmol/L β-AP组细胞DNA电泳显示清晰的“DNA梯”(图3-D)，说明β-AP诱导皮质神经元发生凋亡。
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A-DNA标准分子量参照物； B-标准凋亡模型对照(5 mmol/L K+中培养的小脑颗粒神经元)； C-空白对照； D-用50 μmol/L β-AP处理的神经元； E-加50 μg/mL黑海参多糖后用50 μmol/L β-AP处理的神经元
图3 神经元凋亡的DNA凝胶电泳分析
2.5 流式细胞仪定量分析细胞凋亡峰：实验分组同2.3。加药后继续培养48 h，去培养基，用PBS洗2次，0.125%胰酶消化5 min，收集1×106细胞，将细胞悬浮于pH7.4 PBS中，用4#注射针头抽吸使成单个细胞悬液，用预先冷却至-20 ℃的70%乙醇固定细胞，4 ℃过夜，200 g×5 min离心收集细胞，弃乙醇，将细胞悬浮于含有50 mg/L碘化丙碇、50 mg/L Rnase-I的染液中，避光于37 ℃温育1 h后进行流式细胞仪测定，采集荧光强度值并以仪器所配软件进行数据处理[9]。结果显示，50 μg/mL黑海参多糖组(图4-D)和正常对照组(图4-A)一样均无亚G1峰出现，50 μmol/L β-AP组(图4-B)出现明显的亚G1峰，50 μg/mL黑海参多糖+50 μmol/L β-AP组(图4-C)的亚G1峰几乎消失，说明黑海参多糖不会诱导皮质神经元凋亡。而对β-AP诱导的皮质神经元凋亡有明显的保护作用。
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A-空白对照； B-经50 μmol/L β-AP处理的神经元； C-加50 μg/mL黑海参多糖的神经元；
D-加50 μg/mL黑海参多糖后用50 μmol/L β-AP处理的神经元
图4 流式细胞仪对细胞凋亡峰的定量分析
3 讨论
程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)是机体在发育过程中清除多余细胞的生理性自杀过程，也称凋亡(apoptosis)。估计在胚胎发育或出生后的早期阶段，中枢神经系统有多达50%以上的神经元发生程序性死亡。越来越多的证据表明，某些神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森氏症(Parkinson's disease)等是由于中枢神经发生了病理性的程序性死亡[10]。国内外对于中枢神经系统细胞凋亡的研究，多采用原代培养的中枢神经元，用某些因素诱导神经元发生凋亡，以研究神经元凋亡的机制或抗凋亡药物的作用机制[11]。细胞发生凋亡时，出现明显的核固缩、凝聚、断裂，形成凋亡小体，细胞DNA电泳时出现明显的“梯子状”，在流式细胞仪DNA定量分析图谱上出现显著的凋亡峰，通过这些凋亡特征的检测，可以定性定量分析细胞凋亡的情况。本文采用原代培养的大鼠皮质神经元，以β-AP诱导神经元凋亡，然后从细胞存活率、细胞核形态观察、DNA断裂的凝胶电泳分析及流式细胞仪凋亡峰的定量分析等方面均确证β-AP诱导的皮质神经元死亡是典型的细胞凋亡，黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元凋亡有明显的保护作用。
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黑海参多糖与肝素一样，都是酸性粘多糖，因此，我们从研究结果推测，神经元细胞上可能存在酸性粘多糖的特异性受体，酸性粘多糖对神经元的保护作用是通过受体介导的。目前，受体的分离纯化及黑海参多糖的分子作用机制研究正在进行之中。
由国家杰出青年基金(No.396250022)、国家自然科学基金(No.39770851、No.39870265)和广东省自然科学基金(No.960125)资助
邱鹏新 男，37岁，副主任技师
参考文献
1，Frank, M L, et al. Nature Genetics, 1995,9:21
2，Barger, S W, et al. Nature, 1997, 388:878
, 百拇医药
3，Yan G M, et al. International Symposium of Alzheimer's disease. Osaka, Japan, 1996
4，唐孝礼，等.中药材，1999，22(5)：223
5，Yan G M, et al. Mol Pharmacol, 1995,47:248
6，Yan G M, et al. J Neurochem, 1995, 65:2425
7，Yan G M, et al. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 274:983
8，Yan G M, et al. Brain Res, 1994, 656:43
9，黎明涛，等.生物化学与生物物理学报，1997， 29 (5)：495
10，Bains J S, et al. Brain Res Brain Res Rev, 1997, 25 (3):335
11，颜光美.中山医科大学学报，1998， 19 (1)：1
(1999-06-29 收稿), 百拇医药