HPLC法比较不同工艺制备的黄连解毒汤及日本汉方黄连解毒汤中的生物碱含量
作者：沈嘉 孙春梅 徐荣源 王颖
单位：沈嘉 孙春梅 徐荣源(沈阳药科大学中药系110015)；王颖(沈阳大学师范学院化学系)
关键词：小檗碱；巴马亭；黄连解毒汤汉方制剂
中草药000411摘 要 用HPLC法测定4 种不同工艺制备的黄连解毒汤提取物粉末及2 种日本汉方颗粒剂黄连解毒汤中的小檗碱和巴马汀含量。结果表明此方法简便、快速、精密度高、回收率较好。采用此法比较了上述6 种黄连解毒汤的生物碱含量。结果是新工艺制备的提取物中生物碱含量最高，其中小檗碱含量分别是东洋、津村黄连解毒汤的6 倍和13.8 倍，是传统水煎提取物的3 倍。
Determination of Berberine and Palmatine in Chinese
, 百拇医药 Decoction of Compounded Coptis in Comparison with
Japanese Kampo “Oren-gedoku-to” by HPLC
Department of Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University (Shenyang 110015) Shen Jia, Sun Chunmei and Xu Rongyuan
Department of Chemistry, Normal College of Shenyaing University Wang Ying
Abstract Contents of berberine and palmatine in four powdery preparations from “Antidotal Decoction of Compounded Coptis” and two granular Japanese Kampo “Oren-gedoku-to” were determinated by HPLC. Results showed that powdery preparation obtained by the new production process showed a higher content of the two alkaloids than the two Japanese Kampo 6～13.8 times and about 3 times of the products obtained from the traditional water decoction process. The HPLC determination was shown to be simple, rapid, with high precision and satisfactory recovery.
, 百拇医药
Key words berberine palmatine “Oren-gedoku-to” Japanese Kampo medicine
黄连解毒汤(以下简称HLJDT)原载于唐.《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，为清热解毒的代表方。近年来被用于高血压、中风后遗症、老年痴呆症。前文报道不同工艺制备的HLJDT提取物与日本汉方制剂中黄芩苷与栀子苷含量进行比较研究[1～3]。本文报道生物碱测定结果。
1 仪器与色谱条件
LC-10AT液相色谱仪(日本岛津)，SPD-10AV紫外可见检测器，C-R6A数据处理机；CX-25超声清洗器；分离柱：Kromasil C-18(5 μm，150 mm×4.60 mm id)；前置柱YWG C18(10 mm×4.60 mm id)；流动相：乙腈-水(30∶70)，含20 mmol/L KH2PO4，流速：1 mL/min；柱温室温；检测波长：346 nm[4]。
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2 药品、样品及试剂
小檗碱、巴马亭对照品(中国药品生物制品检定所)；实验用水为重蒸馏水，乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。4 味中药为市售，4 种自制黄连解毒汤固体样品及2 种日本市售汉方黄连解毒汤颗粒剂的处方、制法或来源见表1。
表1 黄连解毒汤样品及制剂 样 品
处 方
处方中
来 源
黄
连
黄
芩
, 百拇医药
黄
柏
栀
子
黄连
含量
(%)
黄柏
含量
(%)
新工艺
9
6
6
, 百拇医药
9
30
20
新工艺(合提)
四 味
9
6
6
9
30
20
单提合并(单提)
水 煎
, http://www.100md.com 9
6
6
9
30
20
传统水煎(合提)
醇 提
9
6
6
9
30
20
, http://www.100md.com
60%乙醇回流(合提)
东 洋
2
3
2
2
22.2
22.2
日本市售
津 村
2
3
1.5
, http://www.100md.com
2
23.2
17.6
日本市售
3 线性及精密度测定
3.1 照前文配制巴马亭2.208 μg/mL的甲醇对照品溶液。分别精密量取0.5，1，2，4，6，8，10 μL依次进样，测定峰面积，得回归方程(表2)。
另取对照品溶液，分别进样2，6，10 μL，各重复进样6 次，测定相应峰面积，其RSD(%)分别为0.042，0.0167，0.010。
3.2 同上述方法制得浓度为9.7 μg/mL的小檗碱对照品溶液。同上述方法得回归方程。同上述方法求得小檗碱含量测定的RSD(%)分别为0.034 1，0.014 3，0.023 1。
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4 加样回收实验
精密称取上述供式品粉末适量(相于于黄连生药约20 mg)，分别加入精密称取的生物碱对照品约1 mg，置三角烧瓶中，加分析纯甲醇30 mL，超声提取30 min[5]，滤入50 mL量瓶(生药黄柏取约20 mg，超声前室温浸泡3 h[6])。以分析纯甲醇洗涤三角烧瓶及滤渣一并滤入量瓶中，定容至刻度，适当精确稀释，用0.45 μm滤膜过滤得供试液，精密进样5 μL测定含量。另平行制备同量供试品，不加生物碱对照品，同法操作，测定含量。二者含量之差，换算成测得量，与实验加入量相比较，即得回收率，结果见表3。
表2 生物碱定量曲线
线性范围(μg)
回归方程
r
, 百拇医药
n
巴马亭
1.104×10-3～2.208×10-2
Y=3.59×106X+1.48×103
0.999 6
3
小檗碱
4.85×10-3～7.76×10-2
Y=3.72×106X+3.19×102
, 百拇医药
0.999 6
3
5 样品测定
黄连、黄柏生药：分别取样品粉末(过40 目筛)约20 mg，置三角烧瓶中，同4 项自“加分析纯甲醇约30 mL……”起，至“…，测定含量”。
含生物碱各样品：分别称取相当黄连生药约20 mg的样品，操作同生药测定，含量测定结果见表3。测得图谱见图1。
6 讨论
6.1 实验样品中生物碱含量次序为：新工艺>四味>醇提>水煎>东洋>津村。新工艺制备的提取物中生物碱含量最高，其小檗碱含量是水煎提取物的3 倍，分别是东洋和津村的6 倍和13.8 倍。新工艺制备的提取物干粉量少，物理性状好，利于减小剂量制成固体制剂。
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6.2 初步药理试验结果证明新工艺HLJDT药理活性高于水煎和东洋，可考虑的因素是生物碱是重要活性成分之一，而新工艺提取物的生物碱含量大大高于水煎和东洋。
6.3 相同处方、原料以4 个不同工艺制备的提取物的生物碱提出率结果见表4，其提出率次序如下：新工艺>四味>醇提>水煎。新工艺提生物碱的提出率最高，水煎的提出率最低，还不及生药中含量的一半。现有的试验结果还表明本次试验的6 个复方样品中水煎、东洋、津村3 个样品的生物碱回收率都偏低；东洋、津村黄连解毒汤的提取方式也是水煎，故可以考虑在黄连解毒汤这4 味中药水煎合提时可能有些成分与生物碱形成沉淀或吸附而使提取物的生物碱提出率偏低。
表3 各样品生物碱含量测定结果(n=3) 样 品
巴 马 亭
小 檗 碱
, 百拇医药
含量
(mg/g)
RSD
(%)
加样回
收率(%)
含量
(mg/g)
RSD
(%)
加样回
收率(%)
黄 连
, 百拇医药
18.2
2.11
96.9
74.7
0.01
103.8
黄 柏
4.74
4.87
94.3
13.3
6.52
84.5
, http://www.100md.com
新工艺
22.2
4.58
98.2
81.6
6.42
89.1
水 煎
7.73
4.29
-
26.9
0.989
, 百拇医药
91.2
四 味
21.5
-
107.9
77.9
-
105.4
醇 提
14.1
2.51
100.2
53.6
, 百拇医药
1.42
92.0
东 洋
1.61
6.20
83.0
13.6
2.25
96.7
津 村
0.633
1.27
83.5
, 百拇医药
5.91
1.03
-
6.4 实验结果证明上述4 个工艺对巴马亭的提出率全高于小檗碱。HLJDT已测定的4 个有效成分的提出率次序为栀子苷>巴马亭>小檗碱>黄芩苷[3]。
1-新工艺 2-单味药提取后合并 3-东洋 4-津村 5-水煎提取 6-60%乙醇提取 7-黄连生药
8-黄柏生药 9-缺黄连、黄柏阴性对照 10-黄连解毒汤缺黄连 11-黄连解毒汤缺黄柏 12-黄连、黄柏合提
图1 黄连解毒汤生物碱提取物及日本汉方制剂色谱图(*为小檗碱，△为巴马亭)
, http://www.100md.com
表4 不同工艺对黄连解毒汤干粉的收率及生物碱提出率的影响(n=3) 工 艺
干粉
收率
(%)
处方中每1.5 g黄连和1 g黄柏可提出的生物碱
处方中生药黄连、黄柏中的生物碱提出率
巴马亭
小檗碱
巴马亭
小檗碱
(mg)*
, 百拇医药
(%)**
新工艺
22.2
24.6
90.6
76.9
72.2
四 味
21.6
23.2
84.1
72.5
67.1
, 百拇医药
水 煎
28.8
11.1
38.7
34.7
30.9
醇 提
31.4
22.1
84.2
69.1
67.1
黄 连
, 百拇医药
-
100
100
黄 柏
-
100
100
黄连加黄柏
32.0
125.4
*处方中黄连-黄柏=1.5∶1 **以生药提出率为100%计。
致谢：本实验所用日本汉方制剂东洋黄连解毒汤、津村黄连解毒汤为日本的阿部胜利及李颂华医生惠赠。
, 百拇医药
沈嘉(女，1982年毕业于沈阳药学院，学士，高级工程师)
参考文献
1，崔存利，等.国外医药-中医中药分册，1992，14(5)：1
2，沈 嘉，等.中草药，1999，30(2)：102
3，沈 嘉，等.中草药，1999，21(10)：502
4，周元瑶，等.药学学报，1988，23(12)：938
5，闻毓，等.中国药科大学学报，1995，26(3)：170
6，彭艳梅，等.中草药，1997，28(10)：599
(1999-07-12收稿), 百拇医药
单位：沈嘉 孙春梅 徐荣源(沈阳药科大学中药系110015)；王颖(沈阳大学师范学院化学系)
关键词：小檗碱；巴马亭；黄连解毒汤汉方制剂
中草药000411摘 要 用HPLC法测定4 种不同工艺制备的黄连解毒汤提取物粉末及2 种日本汉方颗粒剂黄连解毒汤中的小檗碱和巴马汀含量。结果表明此方法简便、快速、精密度高、回收率较好。采用此法比较了上述6 种黄连解毒汤的生物碱含量。结果是新工艺制备的提取物中生物碱含量最高，其中小檗碱含量分别是东洋、津村黄连解毒汤的6 倍和13.8 倍，是传统水煎提取物的3 倍。
Determination of Berberine and Palmatine in Chinese
, 百拇医药 Decoction of Compounded Coptis in Comparison with
Japanese Kampo “Oren-gedoku-to” by HPLC
Department of Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University (Shenyang 110015) Shen Jia, Sun Chunmei and Xu Rongyuan
Department of Chemistry, Normal College of Shenyaing University Wang Ying
Abstract Contents of berberine and palmatine in four powdery preparations from “Antidotal Decoction of Compounded Coptis” and two granular Japanese Kampo “Oren-gedoku-to” were determinated by HPLC. Results showed that powdery preparation obtained by the new production process showed a higher content of the two alkaloids than the two Japanese Kampo 6～13.8 times and about 3 times of the products obtained from the traditional water decoction process. The HPLC determination was shown to be simple, rapid, with high precision and satisfactory recovery.
, 百拇医药
Key words berberine palmatine “Oren-gedoku-to” Japanese Kampo medicine
黄连解毒汤(以下简称HLJDT)原载于唐.《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，为清热解毒的代表方。近年来被用于高血压、中风后遗症、老年痴呆症。前文报道不同工艺制备的HLJDT提取物与日本汉方制剂中黄芩苷与栀子苷含量进行比较研究[1～3]。本文报道生物碱测定结果。
1 仪器与色谱条件
LC-10AT液相色谱仪(日本岛津)，SPD-10AV紫外可见检测器，C-R6A数据处理机；CX-25超声清洗器；分离柱：Kromasil C-18(5 μm，150 mm×4.60 mm id)；前置柱YWG C18(10 mm×4.60 mm id)；流动相：乙腈-水(30∶70)，含20 mmol/L KH2PO4，流速：1 mL/min；柱温室温；检测波长：346 nm[4]。
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2 药品、样品及试剂
小檗碱、巴马亭对照品(中国药品生物制品检定所)；实验用水为重蒸馏水，乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。4 味中药为市售，4 种自制黄连解毒汤固体样品及2 种日本市售汉方黄连解毒汤颗粒剂的处方、制法或来源见表1。
表1 黄连解毒汤样品及制剂 样 品
处 方
处方中
来 源
黄
连
黄
芩
, 百拇医药
黄
柏
栀
子
黄连
含量
(%)
黄柏
含量
(%)
新工艺
9
6
6
, 百拇医药
9
30
20
新工艺(合提)
四 味
9
6
6
9
30
20
单提合并(单提)
水 煎
, http://www.100md.com 9
6
6
9
30
20
传统水煎(合提)
醇 提
9
6
6
9
30
20
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60%乙醇回流(合提)
东 洋
2
3
2
2
22.2
22.2
日本市售
津 村
2
3
1.5
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2
23.2
17.6
日本市售
3 线性及精密度测定
3.1 照前文配制巴马亭2.208 μg/mL的甲醇对照品溶液。分别精密量取0.5，1，2，4，6，8，10 μL依次进样，测定峰面积，得回归方程(表2)。
另取对照品溶液，分别进样2，6，10 μL，各重复进样6 次，测定相应峰面积，其RSD(%)分别为0.042，0.0167，0.010。
3.2 同上述方法制得浓度为9.7 μg/mL的小檗碱对照品溶液。同上述方法得回归方程。同上述方法求得小檗碱含量测定的RSD(%)分别为0.034 1，0.014 3，0.023 1。
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4 加样回收实验
精密称取上述供式品粉末适量(相于于黄连生药约20 mg)，分别加入精密称取的生物碱对照品约1 mg，置三角烧瓶中，加分析纯甲醇30 mL，超声提取30 min[5]，滤入50 mL量瓶(生药黄柏取约20 mg，超声前室温浸泡3 h[6])。以分析纯甲醇洗涤三角烧瓶及滤渣一并滤入量瓶中，定容至刻度，适当精确稀释，用0.45 μm滤膜过滤得供试液，精密进样5 μL测定含量。另平行制备同量供试品，不加生物碱对照品，同法操作，测定含量。二者含量之差，换算成测得量，与实验加入量相比较，即得回收率，结果见表3。
表2 生物碱定量曲线
线性范围(μg)
回归方程
r
, 百拇医药
n
巴马亭
1.104×10-3～2.208×10-2
Y=3.59×106X+1.48×103
0.999 6
3
小檗碱
4.85×10-3～7.76×10-2
Y=3.72×106X+3.19×102
, 百拇医药
0.999 6
3
5 样品测定
黄连、黄柏生药：分别取样品粉末(过40 目筛)约20 mg，置三角烧瓶中，同4 项自“加分析纯甲醇约30 mL……”起，至“…，测定含量”。
含生物碱各样品：分别称取相当黄连生药约20 mg的样品，操作同生药测定，含量测定结果见表3。测得图谱见图1。
6 讨论
6.1 实验样品中生物碱含量次序为：新工艺>四味>醇提>水煎>东洋>津村。新工艺制备的提取物中生物碱含量最高，其小檗碱含量是水煎提取物的3 倍，分别是东洋和津村的6 倍和13.8 倍。新工艺制备的提取物干粉量少，物理性状好，利于减小剂量制成固体制剂。
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6.2 初步药理试验结果证明新工艺HLJDT药理活性高于水煎和东洋，可考虑的因素是生物碱是重要活性成分之一，而新工艺提取物的生物碱含量大大高于水煎和东洋。
6.3 相同处方、原料以4 个不同工艺制备的提取物的生物碱提出率结果见表4，其提出率次序如下：新工艺>四味>醇提>水煎。新工艺提生物碱的提出率最高，水煎的提出率最低，还不及生药中含量的一半。现有的试验结果还表明本次试验的6 个复方样品中水煎、东洋、津村3 个样品的生物碱回收率都偏低；东洋、津村黄连解毒汤的提取方式也是水煎，故可以考虑在黄连解毒汤这4 味中药水煎合提时可能有些成分与生物碱形成沉淀或吸附而使提取物的生物碱提出率偏低。
表3 各样品生物碱含量测定结果(n=3) 样 品
巴 马 亭
小 檗 碱
, 百拇医药
含量
(mg/g)
RSD
(%)
加样回
收率(%)
含量
(mg/g)
RSD
(%)
加样回
收率(%)
黄 连
, 百拇医药
18.2
2.11
96.9
74.7
0.01
103.8
黄 柏
4.74
4.87
94.3
13.3
6.52
84.5
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新工艺
22.2
4.58
98.2
81.6
6.42
89.1
水 煎
7.73
4.29
-
26.9
0.989
, 百拇医药
91.2
四 味
21.5
-
107.9
77.9
-
105.4
醇 提
14.1
2.51
100.2
53.6
, 百拇医药
1.42
92.0
东 洋
1.61
6.20
83.0
13.6
2.25
96.7
津 村
0.633
1.27
83.5
, 百拇医药
5.91
1.03
-
6.4 实验结果证明上述4 个工艺对巴马亭的提出率全高于小檗碱。HLJDT已测定的4 个有效成分的提出率次序为栀子苷>巴马亭>小檗碱>黄芩苷[3]。
1-新工艺 2-单味药提取后合并 3-东洋 4-津村 5-水煎提取 6-60%乙醇提取 7-黄连生药
8-黄柏生药 9-缺黄连、黄柏阴性对照 10-黄连解毒汤缺黄连 11-黄连解毒汤缺黄柏 12-黄连、黄柏合提
图1 黄连解毒汤生物碱提取物及日本汉方制剂色谱图(*为小檗碱，△为巴马亭)
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表4 不同工艺对黄连解毒汤干粉的收率及生物碱提出率的影响(n=3) 工 艺
干粉
收率
(%)
处方中每1.5 g黄连和1 g黄柏可提出的生物碱
处方中生药黄连、黄柏中的生物碱提出率
巴马亭
小檗碱
巴马亭
小檗碱
(mg)*
, 百拇医药
(%)**
新工艺
22.2
24.6
90.6
76.9
72.2
四 味
21.6
23.2
84.1
72.5
67.1
, 百拇医药
水 煎
28.8
11.1
38.7
34.7
30.9
醇 提
31.4
22.1
84.2
69.1
67.1
黄 连
, 百拇医药
-
100
100
黄 柏
-
100
100
黄连加黄柏
32.0
125.4
*处方中黄连-黄柏=1.5∶1 **以生药提出率为100%计。
致谢：本实验所用日本汉方制剂东洋黄连解毒汤、津村黄连解毒汤为日本的阿部胜利及李颂华医生惠赠。
, 百拇医药
沈嘉(女，1982年毕业于沈阳药学院，学士，高级工程师)
参考文献
1，崔存利，等.国外医药-中医中药分册，1992，14(5)：1
2，沈 嘉，等.中草药，1999，30(2)：102
3，沈 嘉，等.中草药，1999，21(10)：502
4，周元瑶，等.药学学报，1988，23(12)：938
5，闻毓，等.中国药科大学学报，1995，26(3)：170
6，彭艳梅，等.中草药，1997，28(10)：599
(1999-07-12收稿), 百拇医药
参见：首页 > 中医药 > 中医专业 > 中医方剂 > 常用方剂 > 清热剂 > 清热解毒 > 黄连解毒汤