农杆菌介导的GUS基因在枳壳中的转移
作者：贺红 韩美丽
单位：贺红(广州中医药大学中药学院510405)；韩美丽(广西林业科学院)
关键词：枳壳；农杆菌；GUS基因
中草药000429摘 要 用枳壳Poncirus trifoliata Raf.实生苗的上胚轴为材料，探索以根癌农杆菌介导的GUS基因在枳壳中的转移，结果表明：抑菌剂选择头孢霉素较好；卡那霉素作为选择试剂，浓度为50 mg/L；外植体与农杆菌共培养时间以2～3 d为宜。GUS基因瞬时表达检测，80%的外植体呈阳性反应；GUS基因稳定表达检测，抗性植株中，GUS反应呈阳性所占比例为70.0%。
A Study on the Agrobacterium-mediated GUS Gene Transfer to
, 百拇医药 Trifoliate Orange (Poncirus trifoliata)
College of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of TCM and Chinese Materia Medica (Guangzhou 510405) He Hong
Guangxi Academy of Forestry Han Meili
Abstract The transformation of GUS gene by Agrobacterium-mediation was studied. The explants used for transformation were the epicotyls from Poncirus trifoliata Raf. The results indicated that Cefotaxime used as antibiotics was better than carbenicillin. The concentration of kanamycin used as the reagent of choice was 50 mg/L. Shoot regeneration frequency was high when cocultivation time was 2～3 days. Histochemical GUS assay showed that 80.0% of the explants had the transient expression of GUS gene and 70.0% of the resistant plants were GUS-positive.
, 百拇医药
Key words Poncirus trifoliata Raf. Agrobacterium tumefaciens GUS gene
随着对植物形成冠瘿瘤分子机制的阐明，植物细胞培养技术的发展及以根癌农杆菌和Ti质粒为载体的植物细胞转化系统的建立，大大推动了植物遗传转化的研究，转基因成功的植物种类不断扩大，特别是在重要农作物及经济作物方面有重大的突破[1～3]，但在药用植物方面的研究较少报道。枳壳Poncirus trifoliata Raf.为芸香科植物，其幼果及成熟果实入药。枳壳的离体培养工作，国内已有报道[4～5]。本文在离体培养的基础上，采用农杆菌转化法，研究了GUS基因转化枳壳的过程，旨在通过建立高效的转化系统，为导入有价值的目的基因，获得具有预期性的优良品种创造条件。
1 材料与方法
1.1 植物材料：枳壳种子经表面消毒培养无菌苗，当苗长至一定大小时，采取上胚轴切成约1 cm长的小段作转化的外植体。
, http://www.100md.com
1.2 细菌菌株及培养：农杆菌菌株为EHA101，含有质粒载体PGA482GG，质粒上插入了GUS及NPTⅡ基因。菌株在含50 mg/L卡那霉素的YEP培养基上繁殖保存，感染前，在YEP液体培养基中，28 ℃振荡20～25 h，达到菌对数生长期，培养物即可用于感染。
1.3 外植体的转化：将枳壳上胚轴切段浸入到准备好的菌液中20 min，随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液，将外植体接种于MT培养基上共培养3 d后，再转到含卡那霉素(Kanamycin, Km) 50 mg/L和头孢霉素(Cefotaxime, Cx) 300 mg/L的选择培养基上，诱导抗性芽的产生。
1.4 组织化学法检测GUS活性：GUS组织化学染色法参见《植物遗转化手册》[6]。
2 结果与分析
2.1 抑菌剂的选择：在用农杆菌转化植物细胞时，常用羧苄青霉素和头孢霉素抑制农杆菌的过量生长。试验结果表明，两种抗菌素在浓度为500 mg/L时，对外植体出芽均无明显影响。抑菌试验中，300 mg/L的头孢素能完全抑制农杆菌的生长，而相同浓度的羧苄青霉素杀菌效果不太好，农杆菌仍少量生长。因此，枳壳转化试验中，抗菌素采用头孢霉素较好，浓度为300 mg/L。
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2.2 选择培养基中卡那霉素浓度的优化：以卡那霉素作为选择试剂，筛选抗性芽的产生。枳壳上胚轴感染后平放于选择培养基上，本试验观察了不同浓度的卡那霉素对出芽的影响，1个月后统计结果。在无Km的对照中，出芽率较高。Km处理中，Km 25 mg/L仅个别外植体有芽形成，当Km增加至50 mg/L以上时，所有外植体均无芽形成，外植体逐渐变白。因此以Km 50 mg/L作为常用的选择水平。
2.3 共培养时间的选择：枳壳外植体分别与农杆菌共培养不同时间(1～4 d)后，取部分外植体小块检测GUS基因的瞬时表达活性，其余转入选择培养基，1.5个月后测定其转化再生频率(表1)。结果表明：共培养1 d时，GUS表达频率中等，转化再生频率为9.6%，2 d与3 d时，GUS表达频率及转化频率均表现较高，4 d时，转化效率有所下降，同时还可观察到，共培养4 d时，培养基上形成菌斑，难以除去。因此共培养时间以2 d～3 d为宜。
表1 共培养时间对转化效率的影响 共培养天数
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(d)
GUS基因瞬时表达
转化再生频率
(%)
1
++
9.6
2
+++
18.2
3
+++
20.0
, 百拇医药
4
+++
14.0
注：++示中等 +++示强
2.4 转化外植体分化成苗及初步鉴定：枳壳上胚轴切段与农杆菌共培养3 d后，转至附加300 mg/L头孢霉素和50 mg/L卡那毒素的选择培养基中进行培养，1个多月后可看到抗性芽的产生(图1)，待芽长至2 cm左右，从外植体上切下诱导生根，生根培养基为MT+NAA 1 mg/L。
外植体与农杆菌共培养3 d后，进行GUS基因瞬时表达活性的检测，取部分外植体进行GUS检测，发现80.0%的外植体，在切口处细胞中可测到GUS活性，显蓝色(图2)。
, 百拇医药
图1 在选择培养上获得抗性芽
图2 GUS基因在被感染的上胚轴中的瞬时表达
图3 GUS基因在抗性植株的叶片、茎段及根尖中的稳定表达
转化处理获得的抗性植株生长5个月后，进行GUS基因稳定表达活性的检测，结果表明：70.0%的植株呈阳性反应，这是茎段染色的结果，又取其叶片进行GUS染色，大多数呈阳性反应，少数不显蓝色，说明有些植株已有稳定的GUS基因表达，也有些植株可能是嵌合的转化体(图3)。
贺红(女，33岁，1997年毕业于华南师范大学生物系，获理学博士学位)
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参考文献
1，余叔文.植物生理与分子生物学.北京：科学出版社，1992：63
2，Hooykaas P J J, et al. Plant Mol Biol, 1992, 19:153
3，Pena L, et al. Plant Cell Reports, 1995,14:616
4，张进仁，等.中国柑桔，1985，(1)：22
5，贺 红.中草药，1998，29(12)：824
6，傅荣昭，等.植物遗传化技术手册.北京：中国科学技术出版社，1994：168
(1999-06-11 收稿), 百拇医药
单位：贺红(广州中医药大学中药学院510405)；韩美丽(广西林业科学院)
关键词：枳壳；农杆菌；GUS基因
中草药000429摘 要 用枳壳Poncirus trifoliata Raf.实生苗的上胚轴为材料，探索以根癌农杆菌介导的GUS基因在枳壳中的转移，结果表明：抑菌剂选择头孢霉素较好；卡那霉素作为选择试剂，浓度为50 mg/L；外植体与农杆菌共培养时间以2～3 d为宜。GUS基因瞬时表达检测，80%的外植体呈阳性反应；GUS基因稳定表达检测，抗性植株中，GUS反应呈阳性所占比例为70.0%。
A Study on the Agrobacterium-mediated GUS Gene Transfer to
, 百拇医药 Trifoliate Orange (Poncirus trifoliata)
College of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of TCM and Chinese Materia Medica (Guangzhou 510405) He Hong
Guangxi Academy of Forestry Han Meili
Abstract The transformation of GUS gene by Agrobacterium-mediation was studied. The explants used for transformation were the epicotyls from Poncirus trifoliata Raf. The results indicated that Cefotaxime used as antibiotics was better than carbenicillin. The concentration of kanamycin used as the reagent of choice was 50 mg/L. Shoot regeneration frequency was high when cocultivation time was 2～3 days. Histochemical GUS assay showed that 80.0% of the explants had the transient expression of GUS gene and 70.0% of the resistant plants were GUS-positive.
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Key words Poncirus trifoliata Raf. Agrobacterium tumefaciens GUS gene
随着对植物形成冠瘿瘤分子机制的阐明，植物细胞培养技术的发展及以根癌农杆菌和Ti质粒为载体的植物细胞转化系统的建立，大大推动了植物遗传转化的研究，转基因成功的植物种类不断扩大，特别是在重要农作物及经济作物方面有重大的突破[1～3]，但在药用植物方面的研究较少报道。枳壳Poncirus trifoliata Raf.为芸香科植物，其幼果及成熟果实入药。枳壳的离体培养工作，国内已有报道[4～5]。本文在离体培养的基础上，采用农杆菌转化法，研究了GUS基因转化枳壳的过程，旨在通过建立高效的转化系统，为导入有价值的目的基因，获得具有预期性的优良品种创造条件。
1 材料与方法
1.1 植物材料：枳壳种子经表面消毒培养无菌苗，当苗长至一定大小时，采取上胚轴切成约1 cm长的小段作转化的外植体。
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1.2 细菌菌株及培养：农杆菌菌株为EHA101，含有质粒载体PGA482GG，质粒上插入了GUS及NPTⅡ基因。菌株在含50 mg/L卡那霉素的YEP培养基上繁殖保存，感染前，在YEP液体培养基中，28 ℃振荡20～25 h，达到菌对数生长期，培养物即可用于感染。
1.3 外植体的转化：将枳壳上胚轴切段浸入到准备好的菌液中20 min，随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液，将外植体接种于MT培养基上共培养3 d后，再转到含卡那霉素(Kanamycin, Km) 50 mg/L和头孢霉素(Cefotaxime, Cx) 300 mg/L的选择培养基上，诱导抗性芽的产生。
1.4 组织化学法检测GUS活性：GUS组织化学染色法参见《植物遗转化手册》[6]。
2 结果与分析
2.1 抑菌剂的选择：在用农杆菌转化植物细胞时，常用羧苄青霉素和头孢霉素抑制农杆菌的过量生长。试验结果表明，两种抗菌素在浓度为500 mg/L时，对外植体出芽均无明显影响。抑菌试验中，300 mg/L的头孢素能完全抑制农杆菌的生长，而相同浓度的羧苄青霉素杀菌效果不太好，农杆菌仍少量生长。因此，枳壳转化试验中，抗菌素采用头孢霉素较好，浓度为300 mg/L。
, http://www.100md.com
2.2 选择培养基中卡那霉素浓度的优化：以卡那霉素作为选择试剂，筛选抗性芽的产生。枳壳上胚轴感染后平放于选择培养基上，本试验观察了不同浓度的卡那霉素对出芽的影响，1个月后统计结果。在无Km的对照中，出芽率较高。Km处理中，Km 25 mg/L仅个别外植体有芽形成，当Km增加至50 mg/L以上时，所有外植体均无芽形成，外植体逐渐变白。因此以Km 50 mg/L作为常用的选择水平。
2.3 共培养时间的选择：枳壳外植体分别与农杆菌共培养不同时间(1～4 d)后，取部分外植体小块检测GUS基因的瞬时表达活性，其余转入选择培养基，1.5个月后测定其转化再生频率(表1)。结果表明：共培养1 d时，GUS表达频率中等，转化再生频率为9.6%，2 d与3 d时，GUS表达频率及转化频率均表现较高，4 d时，转化效率有所下降，同时还可观察到，共培养4 d时，培养基上形成菌斑，难以除去。因此共培养时间以2 d～3 d为宜。
表1 共培养时间对转化效率的影响 共培养天数
, http://www.100md.com
(d)
GUS基因瞬时表达
转化再生频率
(%)
1
++
9.6
2
+++
18.2
3
+++
20.0
, 百拇医药
4
+++
14.0
注：++示中等 +++示强
2.4 转化外植体分化成苗及初步鉴定：枳壳上胚轴切段与农杆菌共培养3 d后，转至附加300 mg/L头孢霉素和50 mg/L卡那毒素的选择培养基中进行培养，1个多月后可看到抗性芽的产生(图1)，待芽长至2 cm左右，从外植体上切下诱导生根，生根培养基为MT+NAA 1 mg/L。
外植体与农杆菌共培养3 d后，进行GUS基因瞬时表达活性的检测，取部分外植体进行GUS检测，发现80.0%的外植体，在切口处细胞中可测到GUS活性，显蓝色(图2)。
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图1 在选择培养上获得抗性芽
图2 GUS基因在被感染的上胚轴中的瞬时表达
图3 GUS基因在抗性植株的叶片、茎段及根尖中的稳定表达
转化处理获得的抗性植株生长5个月后，进行GUS基因稳定表达活性的检测，结果表明：70.0%的植株呈阳性反应，这是茎段染色的结果，又取其叶片进行GUS染色，大多数呈阳性反应，少数不显蓝色，说明有些植株已有稳定的GUS基因表达，也有些植株可能是嵌合的转化体(图3)。
贺红(女，33岁，1997年毕业于华南师范大学生物系，获理学博士学位)
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参考文献
1，余叔文.植物生理与分子生物学.北京：科学出版社，1992：63
2，Hooykaas P J J, et al. Plant Mol Biol, 1992, 19:153
3，Pena L, et al. Plant Cell Reports, 1995,14:616
4，张进仁，等.中国柑桔，1985，(1)：22
5，贺 红.中草药，1998，29(12)：824
6，傅荣昭，等.植物遗传化技术手册.北京：中国科学技术出版社，1994：168
(1999-06-11 收稿), 百拇医药