大蒜素和亚硒酸钠对结肠癌细胞微卫星序列不稳定的抑制作用
作者：汪承亚 周建伟 倪黎 丁小健 赵红 唐玲芳
单位：汪承亚 倪黎 丁小健 赵红(南京医科大学第一附属医院,江苏 南京 210029)；周建伟 唐玲芳(南京医科大学应用毒理研究所,江苏 南京 210029)
关键词：大蒜素；亚硒酸钠；微卫星不稳定性；肿瘤；DNA突变；复制错误
癌症000404
【摘要】目的：以RER(replicationerror)表型的结肠癌细胞作靶细胞，研究大蒜素(diallyltrisulfide,DAT)和亚硒酸钠对肿瘤细胞微卫星序列(microsatellitesequence,MS)突变的影响。方法：将含有外源性MS,(ca)14,的穿梭质粒pCMV-CAR转染RER+或RER-结肠癌细胞株RKO或SW480。外源性(ca)14的突变可使质粒标记基因LacZ恢复正常读码，表达产生β-半乳糖核苷酶，后者使X-gal变蓝。DAT及亚硒酸钠对MS突变的影响可直接通过X-gal染色结果而判断出来。结果：外源性(ca)14的突变只发生于RKO细胞而不发生于SW480细胞。使用DAT0.0015μg/ml及0.015μg/ml以及亚硒酸钠5μmol/L，对细胞活力及增殖无影响，经作用5天，均显示出对外源性(ca)14的突变有明显的抑制效应。但是低浓度亚硒酸钠1μmol/L作用5天，其抑制(ca)14突变的作用不明显，延长作用时间到5～6周，则又表现出对(ca)14突变的明显抑制效应。结论：外源性MS与内源性MS一样在RER+细胞中是不稳定的。DAT和亚硒酸钠能抑制RER+细胞中外源性(ca)14重复序列突变，提示它们对人癌细胞MS遗传不稳定有保护作用。
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中图分类号:R730.5 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0300-04
Inhibitory effect of diallytrisulfide and sodium selenite on microsatellite instability in a colon cancer cell line
WANG Cheng-ya NI li et al.
(First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029,P.R.China)
ZHOU Jian-wei
(Nanjing Medical University, Applied Toxicology Institute,Nanjing 210029,P.R.China)
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【Abstract】 Objective: Investigation of the effects of diallyltrisulfide (DAT) and sodium selenite on genetic instability of human tumor cells via their role in alteration of microsatellite sequence(MS) of replication error (RER) cells. Methods: RER+ and RER-colon cancer cell lines, RKO and SW480, were used as hosts for lipofection with pCMV-CAR in which a foreign (ca)14 repeat was inserted in the coding sequence of lacZ reporter gene, resulting in misreading lacZ frame. Any mutations which made the base number of (ca)14 tract to be 3-fold resumed normal reading frame of lacZ, and lead to expression of β -galactosidase.Variable expression of lacZ in the transfectant cells resulted from DAT or selenite administration was measured by either blue cell counting or OD reading at λ 410 after X-gal staining. Results: Mutations of the exogenous (ca)14 were occurred and maintained in pCMV-CAR transfectant RKO cells but not in SW480 cells. DAT at 0.0015, 0.015 μ g/ml and selenite at 5 μ mol/L reduced markedly blue cells of RKO transfectant clones after incubation for 5 days. Lower concentration of selenite at 1 μ mol/L didn't show suppression of blue cell rate until cell's exposure to it for up to 5 weeks or more. Conclusion: Foreign (ca)14 repeat like endogenous MS was unstable in RER+ cells. Our data showed that DAT and selenite displayed an inhibitory effect on MS instability of cancer cells and thus demonstrated directly their beneficial role in stabilization of genomic DNA.
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Key words:MI; DAT; Selenite; Mutation; Cancer; RER
既往有人假设DNA遗传不稳定性是细胞转化或癌变的基础[1]，然而缺乏直接证据证明这一假设。最近报道遗传性非多发性息肉结肠癌(heradifarynonpolyposiscoloncancer,HNPCC)和其他家族性或散发性肿瘤表现出微卫星序列的不稳定性[2～5]。深入研究表明肿瘤细胞微卫星序列的不稳定是由于细胞内碱基错误配对修复系统的基因hMSH2，hMLH1，hPMS1,hPMS2[6]等的表达异常或缺失，对细胞DNA复制时碱基错误配对无法识别与修复，导致微卫星序列(microsatellitesequence,MS)易于突变，即所谓微卫星序列不稳定性(microsatelliteinstability,MI)。有人提出MI既是细胞DNA遗传不稳定的重要标志，也提示了癌变可能的新机制[6]。已表明某些化学致癌物能诱导肿瘤细胞MS的突变[7]，可发生在肿瘤产生的早期阶段[1，3]。研究表明,大蒜素(diallytrisulfide,DAT)或亚硒酸钠(Na2SeO3)能抑制某些突变剂的致突变或致癌作用[8～10]。本文建立了外源性MS转染的的人癌细胞克隆，用以研究某些化合物对于MS的作用,以能直接评价它们对于DNA突变的影响。
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1 材料与方法
1.1细胞培养
本研究使用贴壁培养的人结肠癌细胞株RKO,SW480(ATCC,U.S.A)为质粒pCMV-CAR转染宿主细胞。RKO为RER+细胞株，SW480为RER细胞株[11]。常规应用MEM2+培养液培养,传代时细胞用H2E游离细胞,接种到新培养板[11]。
1.2质粒pCMV-CAR的转染
穿梭质粒pCMV-CAR由美国JohnHopkins大学的Dr.Vogelstein实验室构建，含有外源性(ca)14简单重复序列[11]。抽提与纯化质粒按MolecularCloning(Maniartist,1989)方法进行。
, 百拇医药
质粒转染以Lipofectin(BRL,USA.)为介质。每一转染实验使用106细胞,50μlLipofectin和12μg质粒DNA。操作时取12ml聚苯乙烯(polystyrene)试管，加入3ml不含血清的MEM培养液，再分别加入DNA和Lipofectin。轻轻吹打均匀，放置室温10分钟左右，让DNA和Lipofectin形成复合物。与此同时，用不含血清的H2E游离细胞并用无血清MEM洗涤3次，最后1次洗涤后，将细胞悬浮于上述3mlDNA/Lipofectin混合液中，轻轻打匀。放置37℃，5%CO2培养箱，孵育3小时。然后加入适量完全培养液，分别接种到两块96孔培养板，使一块板上约9×103/孔细胞，另一块板上约1×103/孔细胞。置37℃，5%CO2培养箱。第2天更换培养液1次，第3天开始使用含0.4mg/mlHygromicin(CalBiochem.，USA)的完全培养液以筛选转染克隆。保留只有单个细胞集落的培养孔，并行建株培养。建株克隆的维持及传代用含0.2mg/mlHygromicin(hygro.)的完全培养液。
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1.3X-gal染色试验
细胞传代培养后第5～6天(细胞覆盖达孔面积的80%左右)中止培养，用PBS洗涤一次，用2%甲醛，0.2%戊二醛于4℃固定5分钟后，细胞以PBS洗涤3次。加入新鲜配制的染色液，含20mmol/L铁氰化钾，20mmol/L的亚铁氰化钾，以及2mmol/LMgCl2,加0.2mg/mlX-gal(Sigma＃576701)，放置37℃，2～4小时后，置4℃过夜，计数显示蓝色的细胞。如果蓝细胞达103/孔左右或更多，难以准确计数，则在培养第5天，更新含有X-gal的培养液继续孵育5～6天，中止培养，收集细胞用PBS调整细胞浓度达106/ml，取0.2ml细胞悬液置λ410比色，测定OD值判断蓝色细胞的多少。
1.4抑制MS不稳定性作用的检测
pCMV-CAR转染的建株细胞克隆RKO-1H8、1D9用于本试验的靶细胞。于细胞传代的第二天，细胞培养液中加入不同浓度的DAT(江苏连云港制药厂)或Na2SeO3(Sigma,S-5261)。五天之后，中止培养，作X-gal染色试验。DAT或Na2SeO3对细胞MS不稳定性的抑制作用由细胞染色后蓝细胞计数或由OD值判断。每一实验浓度作双复管试验，求平均数计算。蓝细胞计数资料用u检验，OD值资料用t检验。
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2 结果
2.1外源性MS的突变发生于RKO细胞而不发生于SW480细胞
穿梭质粒CMV-CAR中外源性微卫星序列(ca)14共28个碱基，插在LacZ编码序列之前，并受控于巨细胞病毒启动子，(ca)14的插入使得LacZ不能正确读码。但当(ca)14发生插入或丢失突变而使(ca)14的碱基变成3的倍数时，将恢复LacZ的正常读码，从而可表达产生有生物活性的β-半乳糖核苷酶，后者可经X-gal染色使细胞着色而被检出(见图1)。
图1pCMV-CAR转染克隆RKO-1H8经X-gal染色出现的蓝细胞
蓝细胞表示外源性(ca)14序列发生了碱基丢失或插入突变,使LacZ正确读码表达产生β-半乳糖甘酶,细胞呈蓝色
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RKO及SW480经pCMV-CAR转染后，使用Hygromicin选择培养，只保留孔内含单个细胞集落的培养孔。最终获得23个RKO转染克隆，11个SW480转染克隆。将这些转染克隆进一步建株培养。X-gal染色表明13/23RKO转染克隆，见有蓝色细胞，而11个SW480转染克隆均未出现蓝细胞(表1)。
表1 pCMV-CAR转染RKO和SW480结果 细胞株
RKO
SW480
蓝细胞克隆数
13
0
无蓝细胞克隆数
10
, 百拇医药
11
细胞克隆总数
23
11
图2 1μmol/LNa2SeO3作用不同时间后,pCMV-CAR转染克隆RKO-1D9蓝细胞发生率(以校正OD值表示)
为了解蓝细胞在转染克隆建株传代过程中是否持续存在，我们随机选择X-gal染色试验为阳性的RKO转染克隆1H8和无蓝色细胞出现的SW480转染克隆1D3，每传五代作一次染色试验。结果SW4801D3始终未见有一个蓝色细胞，而RKO-1H8蓝细胞率在0.1%～0.2%之间。见表2。
表2不同代数的转染克隆细胞的X-gal染色结果 转染克隆
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RKO-1H8
SW480-1D3
P5
P10
P5
P10
蓝细胞数
513/494
735/564
0/0
0/0
蓝细胞均数
503
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649
0
0
细胞总数
5×105
3×105
3×105
3×105
蓝细胞率
0.1%
0.2%
0%
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0%
*P5、P10分别表示第5代、第10代细胞
上述结果表明外源性(ca)14在RKO细胞中发生了碱基插入或缺失突变，而且这一特征在传代培养中维持不变。但是(ca)14的这种突变并不发生于SW480细胞。由此可见外源性MS与内源性MS一样在RER+细胞中是不稳定的，是研究某些化合物对癌细胞遗传不稳定和复杂的DNA突变的影响的有用的靶序列。
2.2DAT和Na2SeO3对微卫星不稳定性(MI)的抑制作用
为了探讨DAT及Na2SeO3对于肿瘤细胞MI的影响，我们以pCMV-CAR转染克隆RKO-1H8及1D9为靶细胞，在含不同浓度的DAT(0,0.0015,0.015μg/ml)或Na2SeO3(0,1,5μmol/L)培养液中培养5天后作X-gal染色试验。结果0.015μg/ml及0.0015μg/ml的DAT及5μmol/LNa2SeO3均能明显减少蓝细胞的发生率，但是较低浓度即1μmol/LNa2SeO3却未见明显的作用(表3，表4)。
, 百拇医药
表3 DAT对外源性(ca)14突变的影响 DAT(μg/ml)
蓝细胞数
细胞总数
蓝细胞率
0
676
6.6×105
0.10%
0.0015
320
7.2×105
0.044%*
, 百拇医药
0.015
180
8.0×105
0.023%*
*P〈0.01
表4 Na2SeO3对外源性(ca)14突变的影响 Na2SeO3(μmol/L)
实验次数
校正OD值*(
±s)
0
, 百拇医药
3
0.25±0.03
1
3
0.22±0.08**
5
3
0.10±0.04***
*蓝细胞数超过103/孔，测定OD值估计蓝细胞的多少。
校正OD表示被测样品校正为2×105细胞/0.2ml所得的OD值。
, 百拇医药 **P>0.05;***P〈0.001
值得注意的是虽然低浓度的Na2SeO3作用5天对RKO-1D9蓝色细胞出现率没有明显影响，但是延长作用时间至5～6周，1μmol/LNa2SeO3则又能大大地降低蓝细胞的出现率(见图2)。
这些结果提示DAT，Na2SeO3均能抑制肿瘤细胞MI。当使用浓度较低时则需要延长作用时间，才能表现出相应的抑制作用。
3 讨论
DAT是大蒜中的一种成份，以前是用作抗感染的抗生素。Na2SeO3则是一种抗氧化剂。近年来有报告认为DAT有抗突变和抗癌变的作用,且能抑制某些突变剂诱导的突变作用[8]。而Na2SeO3则可增进培养细胞的活力及DNA的稳定性，因此具有预防癌变的作用[9];Na2SeO3的防癌作用可能与硒和谷胱苷肽(glutathione)反应，产生的活性O2有关[10],但是，至今尚未找到它们直接抑制DNA突变的证据。
, 百拇医药
最近，文献报道MS是某些致癌剂的直接作用环节，由杂环胺类诱导的动物肿瘤中出现有MS的改变[7]。我们建立的外源性MS质粒转染细胞克隆表明，在RER+细胞中，外源性(ca)14是不稳定的，直接反映了RER+细胞中MS的不稳定性。外源性(ca)14是理想的检测化合物对于癌细胞MI影响的靶序列。本研究观察到细胞受DAT和Na2SeO3作用5天，即能降低RKO-1H8或1D9的蓝细胞出现率。这说明它们能减少(ca)14重复序列的碱基插入或缺失的突变，因此证明它们对DNA突变和MI有直接的抑制作用。
值得注意的是Na2SeO31μmol/L低浓度下作用5天，对(ca)14突变无明显影响，但是，延长作用时间到5周以上，则能显著地降低RKO-1D9蓝细胞率，这一结果提示低浓度的突变抑制剂的长期作用也许是必要的。
, 百拇医药
此外，应该强调，DNA突变这一非常复杂的过程可以通过本实验系统X-gal染色试验这一简单的方法揭示出来，而且因为本实验中使用人的细胞而不是动物细胞或细菌，因此其结果更能正确反映某些化合物对人细胞DNA突变的影响。由于MI被认为与癌变新机制有关，因此体外MI的抑制实验，对于预测DAT和Na2SeO3防癌作用是有价值的。
基金项目：本课题受国家自然科学基金(No.39670297)资助
通讯作者:汪承亚 Tel:86-25-3718836-6825 Fax:86-25-3724440 E-mail:wangcy@lib.njau.edu.cn
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收稿日期:1999-08-23
修回日期:1999-10-25, 百拇医药
单位：汪承亚 倪黎 丁小健 赵红(南京医科大学第一附属医院,江苏 南京 210029)；周建伟 唐玲芳(南京医科大学应用毒理研究所,江苏 南京 210029)
关键词：大蒜素；亚硒酸钠；微卫星不稳定性；肿瘤；DNA突变；复制错误
癌症000404
【摘要】目的：以RER(replicationerror)表型的结肠癌细胞作靶细胞，研究大蒜素(diallyltrisulfide,DAT)和亚硒酸钠对肿瘤细胞微卫星序列(microsatellitesequence,MS)突变的影响。方法：将含有外源性MS,(ca)14,的穿梭质粒pCMV-CAR转染RER+或RER-结肠癌细胞株RKO或SW480。外源性(ca)14的突变可使质粒标记基因LacZ恢复正常读码，表达产生β-半乳糖核苷酶，后者使X-gal变蓝。DAT及亚硒酸钠对MS突变的影响可直接通过X-gal染色结果而判断出来。结果：外源性(ca)14的突变只发生于RKO细胞而不发生于SW480细胞。使用DAT0.0015μg/ml及0.015μg/ml以及亚硒酸钠5μmol/L，对细胞活力及增殖无影响，经作用5天，均显示出对外源性(ca)14的突变有明显的抑制效应。但是低浓度亚硒酸钠1μmol/L作用5天，其抑制(ca)14突变的作用不明显，延长作用时间到5～6周，则又表现出对(ca)14突变的明显抑制效应。结论：外源性MS与内源性MS一样在RER+细胞中是不稳定的。DAT和亚硒酸钠能抑制RER+细胞中外源性(ca)14重复序列突变，提示它们对人癌细胞MS遗传不稳定有保护作用。
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中图分类号:R730.5 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0300-04
Inhibitory effect of diallytrisulfide and sodium selenite on microsatellite instability in a colon cancer cell line
WANG Cheng-ya NI li et al.
(First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029,P.R.China)
ZHOU Jian-wei
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【Abstract】 Objective: Investigation of the effects of diallyltrisulfide (DAT) and sodium selenite on genetic instability of human tumor cells via their role in alteration of microsatellite sequence(MS) of replication error (RER) cells. Methods: RER+ and RER-colon cancer cell lines, RKO and SW480, were used as hosts for lipofection with pCMV-CAR in which a foreign (ca)14 repeat was inserted in the coding sequence of lacZ reporter gene, resulting in misreading lacZ frame. Any mutations which made the base number of (ca)14 tract to be 3-fold resumed normal reading frame of lacZ, and lead to expression of β -galactosidase.Variable expression of lacZ in the transfectant cells resulted from DAT or selenite administration was measured by either blue cell counting or OD reading at λ 410 after X-gal staining. Results: Mutations of the exogenous (ca)14 were occurred and maintained in pCMV-CAR transfectant RKO cells but not in SW480 cells. DAT at 0.0015, 0.015 μ g/ml and selenite at 5 μ mol/L reduced markedly blue cells of RKO transfectant clones after incubation for 5 days. Lower concentration of selenite at 1 μ mol/L didn't show suppression of blue cell rate until cell's exposure to it for up to 5 weeks or more. Conclusion: Foreign (ca)14 repeat like endogenous MS was unstable in RER+ cells. Our data showed that DAT and selenite displayed an inhibitory effect on MS instability of cancer cells and thus demonstrated directly their beneficial role in stabilization of genomic DNA.
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Key words:MI; DAT; Selenite; Mutation; Cancer; RER
既往有人假设DNA遗传不稳定性是细胞转化或癌变的基础[1]，然而缺乏直接证据证明这一假设。最近报道遗传性非多发性息肉结肠癌(heradifarynonpolyposiscoloncancer,HNPCC)和其他家族性或散发性肿瘤表现出微卫星序列的不稳定性[2～5]。深入研究表明肿瘤细胞微卫星序列的不稳定是由于细胞内碱基错误配对修复系统的基因hMSH2，hMLH1，hPMS1,hPMS2[6]等的表达异常或缺失，对细胞DNA复制时碱基错误配对无法识别与修复，导致微卫星序列(microsatellitesequence,MS)易于突变，即所谓微卫星序列不稳定性(microsatelliteinstability,MI)。有人提出MI既是细胞DNA遗传不稳定的重要标志，也提示了癌变可能的新机制[6]。已表明某些化学致癌物能诱导肿瘤细胞MS的突变[7]，可发生在肿瘤产生的早期阶段[1，3]。研究表明,大蒜素(diallytrisulfide,DAT)或亚硒酸钠(Na2SeO3)能抑制某些突变剂的致突变或致癌作用[8～10]。本文建立了外源性MS转染的的人癌细胞克隆，用以研究某些化合物对于MS的作用,以能直接评价它们对于DNA突变的影响。
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1 材料与方法
1.1细胞培养
本研究使用贴壁培养的人结肠癌细胞株RKO,SW480(ATCC,U.S.A)为质粒pCMV-CAR转染宿主细胞。RKO为RER+细胞株，SW480为RER细胞株[11]。常规应用MEM2+培养液培养,传代时细胞用H2E游离细胞,接种到新培养板[11]。
1.2质粒pCMV-CAR的转染
穿梭质粒pCMV-CAR由美国JohnHopkins大学的Dr.Vogelstein实验室构建，含有外源性(ca)14简单重复序列[11]。抽提与纯化质粒按MolecularCloning(Maniartist,1989)方法进行。
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质粒转染以Lipofectin(BRL,USA.)为介质。每一转染实验使用106细胞,50μlLipofectin和12μg质粒DNA。操作时取12ml聚苯乙烯(polystyrene)试管，加入3ml不含血清的MEM培养液，再分别加入DNA和Lipofectin。轻轻吹打均匀，放置室温10分钟左右，让DNA和Lipofectin形成复合物。与此同时，用不含血清的H2E游离细胞并用无血清MEM洗涤3次，最后1次洗涤后，将细胞悬浮于上述3mlDNA/Lipofectin混合液中，轻轻打匀。放置37℃，5%CO2培养箱，孵育3小时。然后加入适量完全培养液，分别接种到两块96孔培养板，使一块板上约9×103/孔细胞，另一块板上约1×103/孔细胞。置37℃，5%CO2培养箱。第2天更换培养液1次，第3天开始使用含0.4mg/mlHygromicin(CalBiochem.，USA)的完全培养液以筛选转染克隆。保留只有单个细胞集落的培养孔，并行建株培养。建株克隆的维持及传代用含0.2mg/mlHygromicin(hygro.)的完全培养液。
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1.3X-gal染色试验
细胞传代培养后第5～6天(细胞覆盖达孔面积的80%左右)中止培养，用PBS洗涤一次，用2%甲醛，0.2%戊二醛于4℃固定5分钟后，细胞以PBS洗涤3次。加入新鲜配制的染色液，含20mmol/L铁氰化钾，20mmol/L的亚铁氰化钾，以及2mmol/LMgCl2,加0.2mg/mlX-gal(Sigma＃576701)，放置37℃，2～4小时后，置4℃过夜，计数显示蓝色的细胞。如果蓝细胞达103/孔左右或更多，难以准确计数，则在培养第5天，更新含有X-gal的培养液继续孵育5～6天，中止培养，收集细胞用PBS调整细胞浓度达106/ml，取0.2ml细胞悬液置λ410比色，测定OD值判断蓝色细胞的多少。
1.4抑制MS不稳定性作用的检测
pCMV-CAR转染的建株细胞克隆RKO-1H8、1D9用于本试验的靶细胞。于细胞传代的第二天，细胞培养液中加入不同浓度的DAT(江苏连云港制药厂)或Na2SeO3(Sigma,S-5261)。五天之后，中止培养，作X-gal染色试验。DAT或Na2SeO3对细胞MS不稳定性的抑制作用由细胞染色后蓝细胞计数或由OD值判断。每一实验浓度作双复管试验，求平均数计算。蓝细胞计数资料用u检验，OD值资料用t检验。
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2 结果
2.1外源性MS的突变发生于RKO细胞而不发生于SW480细胞
穿梭质粒CMV-CAR中外源性微卫星序列(ca)14共28个碱基，插在LacZ编码序列之前，并受控于巨细胞病毒启动子，(ca)14的插入使得LacZ不能正确读码。但当(ca)14发生插入或丢失突变而使(ca)14的碱基变成3的倍数时，将恢复LacZ的正常读码，从而可表达产生有生物活性的β-半乳糖核苷酶，后者可经X-gal染色使细胞着色而被检出(见图1)。
图1pCMV-CAR转染克隆RKO-1H8经X-gal染色出现的蓝细胞
蓝细胞表示外源性(ca)14序列发生了碱基丢失或插入突变,使LacZ正确读码表达产生β-半乳糖甘酶,细胞呈蓝色
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RKO及SW480经pCMV-CAR转染后，使用Hygromicin选择培养，只保留孔内含单个细胞集落的培养孔。最终获得23个RKO转染克隆，11个SW480转染克隆。将这些转染克隆进一步建株培养。X-gal染色表明13/23RKO转染克隆，见有蓝色细胞，而11个SW480转染克隆均未出现蓝细胞(表1)。
表1 pCMV-CAR转染RKO和SW480结果 细胞株
RKO
SW480
蓝细胞克隆数
13
0
无蓝细胞克隆数
10
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11
细胞克隆总数
23
11
图2 1μmol/LNa2SeO3作用不同时间后,pCMV-CAR转染克隆RKO-1D9蓝细胞发生率(以校正OD值表示)
为了解蓝细胞在转染克隆建株传代过程中是否持续存在，我们随机选择X-gal染色试验为阳性的RKO转染克隆1H8和无蓝色细胞出现的SW480转染克隆1D3，每传五代作一次染色试验。结果SW4801D3始终未见有一个蓝色细胞，而RKO-1H8蓝细胞率在0.1%～0.2%之间。见表2。
表2不同代数的转染克隆细胞的X-gal染色结果 转染克隆
, 百拇医药
RKO-1H8
SW480-1D3
P5
P10
P5
P10
蓝细胞数
513/494
735/564
0/0
0/0
蓝细胞均数
503
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649
0
0
细胞总数
5×105
3×105
3×105
3×105
蓝细胞率
0.1%
0.2%
0%
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0%
*P5、P10分别表示第5代、第10代细胞
上述结果表明外源性(ca)14在RKO细胞中发生了碱基插入或缺失突变，而且这一特征在传代培养中维持不变。但是(ca)14的这种突变并不发生于SW480细胞。由此可见外源性MS与内源性MS一样在RER+细胞中是不稳定的，是研究某些化合物对癌细胞遗传不稳定和复杂的DNA突变的影响的有用的靶序列。
2.2DAT和Na2SeO3对微卫星不稳定性(MI)的抑制作用
为了探讨DAT及Na2SeO3对于肿瘤细胞MI的影响，我们以pCMV-CAR转染克隆RKO-1H8及1D9为靶细胞，在含不同浓度的DAT(0,0.0015,0.015μg/ml)或Na2SeO3(0,1,5μmol/L)培养液中培养5天后作X-gal染色试验。结果0.015μg/ml及0.0015μg/ml的DAT及5μmol/LNa2SeO3均能明显减少蓝细胞的发生率，但是较低浓度即1μmol/LNa2SeO3却未见明显的作用(表3，表4)。
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表3 DAT对外源性(ca)14突变的影响 DAT(μg/ml)
蓝细胞数
细胞总数
蓝细胞率
0
676
6.6×105
0.10%
0.0015
320
7.2×105
0.044%*
, 百拇医药
0.015
180
8.0×105
0.023%*
*P〈0.01
表4 Na2SeO3对外源性(ca)14突变的影响 Na2SeO3(μmol/L)
实验次数
校正OD值*(
±s)0
, 百拇医药
3
0.25±0.03
1
3
0.22±0.08**
5
3
0.10±0.04***
*蓝细胞数超过103/孔，测定OD值估计蓝细胞的多少。
校正OD表示被测样品校正为2×105细胞/0.2ml所得的OD值。
, 百拇医药 **P>0.05;***P〈0.001
值得注意的是虽然低浓度的Na2SeO3作用5天对RKO-1D9蓝色细胞出现率没有明显影响，但是延长作用时间至5～6周，1μmol/LNa2SeO3则又能大大地降低蓝细胞的出现率(见图2)。
这些结果提示DAT，Na2SeO3均能抑制肿瘤细胞MI。当使用浓度较低时则需要延长作用时间，才能表现出相应的抑制作用。
3 讨论
DAT是大蒜中的一种成份，以前是用作抗感染的抗生素。Na2SeO3则是一种抗氧化剂。近年来有报告认为DAT有抗突变和抗癌变的作用,且能抑制某些突变剂诱导的突变作用[8]。而Na2SeO3则可增进培养细胞的活力及DNA的稳定性，因此具有预防癌变的作用[9];Na2SeO3的防癌作用可能与硒和谷胱苷肽(glutathione)反应，产生的活性O2有关[10],但是，至今尚未找到它们直接抑制DNA突变的证据。
, 百拇医药
最近，文献报道MS是某些致癌剂的直接作用环节，由杂环胺类诱导的动物肿瘤中出现有MS的改变[7]。我们建立的外源性MS质粒转染细胞克隆表明，在RER+细胞中，外源性(ca)14是不稳定的，直接反映了RER+细胞中MS的不稳定性。外源性(ca)14是理想的检测化合物对于癌细胞MI影响的靶序列。本研究观察到细胞受DAT和Na2SeO3作用5天，即能降低RKO-1H8或1D9的蓝细胞出现率。这说明它们能减少(ca)14重复序列的碱基插入或缺失的突变，因此证明它们对DNA突变和MI有直接的抑制作用。
值得注意的是Na2SeO31μmol/L低浓度下作用5天，对(ca)14突变无明显影响，但是，延长作用时间到5周以上，则能显著地降低RKO-1D9蓝细胞率，这一结果提示低浓度的突变抑制剂的长期作用也许是必要的。
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此外，应该强调，DNA突变这一非常复杂的过程可以通过本实验系统X-gal染色试验这一简单的方法揭示出来，而且因为本实验中使用人的细胞而不是动物细胞或细菌，因此其结果更能正确反映某些化合物对人细胞DNA突变的影响。由于MI被认为与癌变新机制有关，因此体外MI的抑制实验，对于预测DAT和Na2SeO3防癌作用是有价值的。
基金项目：本课题受国家自然科学基金(No.39670297)资助
通讯作者:汪承亚 Tel:86-25-3718836-6825 Fax:86-25-3724440 E-mail:wangcy@lib.njau.edu.cn
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收稿日期:1999-08-23
修回日期:1999-10-25, 百拇医药