血管内皮生长因子及其受体在人大肠癌组织中的分布、定量和意义
作者：陈 治 王晓莉 张 莉 黄宗海 潘玉先 曹长安
单位：陈 治 黄宗海 潘玉先 曹长安(中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科 广东省广州市 510282)；王晓莉 张 莉(华西医科大学附二院妇产科 四川省成都市)
关键词：肠肿瘤；内皮；血管；免疫组织化学反应；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体；肿瘤曲管靶向治疗
肿瘤的生长和转移与肿瘤区的血管密切相关 肿瘤的生长和转移与肿瘤区的血管密切相关，1971年Folkman首先提出抑制肿瘤血管形成可作为肿瘤治疗的一个途径，随后这种以肿瘤血管为靶的治疗策略--肿瘤血管靶向治疗(toumorvasculartargetingtherapy)日益受到重视，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是最重要的血管形成因子之一，VEGF及其受体(VEGFR)是肿瘤血管靶向治疗的理想靶点，以VEGF为靶点的治疗实验已有大量报道[1-3]，以VEGFR为靶点近期亦有较成功的尝试[4，5]，本实验旨在观察和比较大肠癌组织中VEGF及其受体KDR的表达差异，为确定以上VEGF及VEGFR作为肿瘤血管靶向治疗的靶点何者为优提供依据。1材料和方法1.1材料大肠癌组织标本80例来自珠江医院普通外科1992/1998年住院手术患者，年龄38岁～78岁(平均58.7岁)，男58例，女22例，所有患者术前均未接受化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗，标本按组织学Broder法分型分为四型：高分化强癌、中分化腺癌、低分化腺癌和粘液腺癌，正常大肠组织标本10例进行对照，所有标本均用100g/L甲醛固定24h，常规石蜡包埋，制备5μm厚的连续切片，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，主要试剂：小鼠抗人vEGF单克隆抗体(IgGI)购自美国Neuwork公司，小鼠抗人KDR单克隆抗体(IgGI)购自美国Sigma公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。1.2方法①邻片免疫组织化学双标记法：免疫组化染色采用SABC法，第一抗体为鼠抗人VEGF单克隆抗体和鼠抗人KDR单克隆抗体(工作浓度均为1：100)，正常鼠IgG作为阴性对照，PBS替代其一抗体作为空白对照，正常大肠组织切片作为正常对照，于每个标本的连续切片中选取相邻切片，分别以鼠抗VEGF抗体和鼠抗KDR抗体按SABC法进行邻片双标记研究，VEGF阳性染色以见到定位于肿瘤细胞胞质或胞膜的棕色染色为准，KDR阳性染色以见到定位于血管内皮细胞膜的棕色染色为准。②图象分析法定量：鉴于大肠癌组织学切片中细胞间的分界线往往不明确，采用MacintoshⅡ图象分析系统(Adobphotoshop5.0)按文献[6]提供的方法(公式11)计算待测切片上阳性反应程度的阳性单位(PU)，得到免疫组化显色反应的量化结果。统计学处理PU值以±5表示，邻片间VEGF与KDR的表达量比较采用配对资料的t检验，以上统计分析均在Spess8.0统计分析软件中进行。2结果2.1免疫组化染色结果①正常大肠组织及空白对照切片中均未见免疫反应阳性信号，在癌组织中，VEGF阳性物质主要位于癌细胞的胞膜和(或)胞质，血管内皮细胞上未见VEGF染色；KDR阳性物质主要位于癌组织的血管内皮细胞上，且新生血管内皮细胞的着色明显强于较大血管内皮细胞.部分无血管区域的癌细胞上也有弱的KDR染色.②VEGF和KDR的染色程度与肿瘤区域及病理分型有关，癌组织边缘区细胞的染色要强于中心区，桉病理分型恶性程度高者较恶性程度低者染色程度为强，③对比两张邻片，VEGF的阳性反应强度要明显强于KDR。2.2图象分析法定量结果80例大肠癌中，VEGF的阳性反应定量结果为19.2±9.5.KDR的阳性反应定量结果为10.5±7.1，二者间存在显著性差异(P<0.01)。3讨论
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实体瘤的生长和转移需要新生血管生成，肿瘤血管形成受肿瘤细胞分泌的上管形成因子调节，目前，已经发现的血管形成因子较多，VEGF是其中最重要的，它即可直接作用于血管内皮细胞，刺激其有丝分裂的发生，从而促进新生血管的生长，也可通过增加上管通透性，使包括许多基质形成重要因子的血浆蛋白外渗，为血管内皮细胞的迁移及肿瘤细胞的转移提供基质，VEGF是通过作用子内反细胞上的VEGF受体来发挥其生物学作用的，已发现的VEGF受体有三种：FLK-1(KDR)，FLT-1，FLT-4，已知与内皮细胞的增殖和血管生成有关的只有FLK-1(KDR)[7]。目前关于VEGF及其受体在肿瘤组织由的表达部位及作用方式认识不一，Wizigmannetal[8]认为VEGF主要表达于肿瘤细胞，Brownetal[9]研究发现VEGF仅表达于肿瘤细胞，血管内皮细胞也可表达，而FLK-1(FDR)仅表达于肿瘤血管内皮细胞，在肿瘤上皮细胞中不表达.Boococketal[10]则发现FLK-1(KDR)不仅可在肿瘤间质的血管内皮细胞中表达，而且在肿瘤上皮中亦有表达，我们的矿究发观，VEGF主要表达于大肠癌细胞中，在肿瘤血管内皮细胞中无表达；FLK-l(KDR)主要表达于肿瘤血管内皮细胞，部分大肠癌细胞中亦有较弱表达、这表明VEGF主要是通过旁分泌作用机制诱导肿瘤血管形成，从而促进肿瘤细胞的生长，同时可能作为一种自分泌生长调节因子直接促进肿瘤细胞的生长。本研究结果说明：①作为一种分泌的蛋白，VEGF主要分布于肿瘤细胞中，而KDR主要位于血管内皮细胞上，这样药物入血后可直接作用于KDR，而作作于VEGF则需穿透血管；②虽然二者在恶性肿瘤中都有表达，但KDR相比VEGF的表达量明显低，由此推测，使用较小的药量作用于KDR就可能达到较好的治疗效果，由此预测，在肿瘤血管的靶向治疗中，VEGF受体作为靶点可能比以VEGF更有效。
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参考文献：
[1]王贵齐，王耐勤，刘彤，徐光炜，董志伟，血管内皮生长因子抗体对实验性肿瘤的抑制作用，中华肿瘤杂志，1997；19：163-166
[2] 董凡，许新，景乃禾，金由辛，反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞表达VEGF的研究，肿瘤1997；17：65-66
[3]董凡，金由辛，VEGF反义核酸抑制肿瘤血管形成的研究，中华肿瘤杂志，1997；19：264-266
[4]Zhu ZP，Rockwell P,Lu D,Kotanides H,Pytowski B,Hicklin DJ,Bohlen P,Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced receptor activation with anti-kinase insert domain-containing receptor single-chain antibodies from a phage display library,Cancer Res,1998;58:3209-3214
, http://www.100md.com
[5]李晓明，汤刈猷，陈方国，突变型flk-1基因转染抑制肝癌在裸鼠体内血管形成，生长和转移，中国肿瘤生物治疗杂志，1998；5：160-162
[6]申洪，陆药丹，免疫组织化学染色的定量方法研究，生物医学工程学杂志，1993；10：281-284
[7] Witte L,Hicklin DJ,Zhu ZP,Pytowski B,Kotanides H,Rockwell P,Bohlen P.Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2(Fllk1/KDR)as an anti-angiogenic therapeutic strategy,Cancer And Metastasis Reviews,1998;17:155-161
[8]Wizigmann-Voos S,Breier G,Risau W,Plate KH.Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.Cancer Res,1995;55:1358-1364
, 百拇医药
[9] Brown LF,Berse B,Jackman RW,Tognazzi K,Manseau EJ,Kvorak HF,Senger DR.Increased expression of vascular permeability factor and its receptors in kidney and bladder carcinomas.Am J Pathol,1993;143:1255-1262
[10]Boocock CA,Charnock-Jones DS,Sharkey AM,McLaren J,Barker PJ,Wright KA,Twentyman PR,Smith SK.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR in ovarian carcinoma.J Natl Cancer Inst,1995;87:506-516
收稿日期：2000-01-14, 百拇医药
单位：陈 治 黄宗海 潘玉先 曹长安(中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科 广东省广州市 510282)；王晓莉 张 莉(华西医科大学附二院妇产科 四川省成都市)
关键词：肠肿瘤；内皮；血管；免疫组织化学反应；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体；肿瘤曲管靶向治疗
肿瘤的生长和转移与肿瘤区的血管密切相关 肿瘤的生长和转移与肿瘤区的血管密切相关，1971年Folkman首先提出抑制肿瘤血管形成可作为肿瘤治疗的一个途径，随后这种以肿瘤血管为靶的治疗策略--肿瘤血管靶向治疗(toumorvasculartargetingtherapy)日益受到重视，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是最重要的血管形成因子之一，VEGF及其受体(VEGFR)是肿瘤血管靶向治疗的理想靶点，以VEGF为靶点的治疗实验已有大量报道[1-3]，以VEGFR为靶点近期亦有较成功的尝试[4，5]，本实验旨在观察和比较大肠癌组织中VEGF及其受体KDR的表达差异，为确定以上VEGF及VEGFR作为肿瘤血管靶向治疗的靶点何者为优提供依据。1材料和方法1.1材料大肠癌组织标本80例来自珠江医院普通外科1992/1998年住院手术患者，年龄38岁～78岁(平均58.7岁)，男58例，女22例，所有患者术前均未接受化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗，标本按组织学Broder法分型分为四型：高分化强癌、中分化腺癌、低分化腺癌和粘液腺癌，正常大肠组织标本10例进行对照，所有标本均用100g/L甲醛固定24h，常规石蜡包埋，制备5μm厚的连续切片，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，主要试剂：小鼠抗人vEGF单克隆抗体(IgGI)购自美国Neuwork公司，小鼠抗人KDR单克隆抗体(IgGI)购自美国Sigma公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。1.2方法①邻片免疫组织化学双标记法：免疫组化染色采用SABC法，第一抗体为鼠抗人VEGF单克隆抗体和鼠抗人KDR单克隆抗体(工作浓度均为1：100)，正常鼠IgG作为阴性对照，PBS替代其一抗体作为空白对照，正常大肠组织切片作为正常对照，于每个标本的连续切片中选取相邻切片，分别以鼠抗VEGF抗体和鼠抗KDR抗体按SABC法进行邻片双标记研究，VEGF阳性染色以见到定位于肿瘤细胞胞质或胞膜的棕色染色为准，KDR阳性染色以见到定位于血管内皮细胞膜的棕色染色为准。②图象分析法定量：鉴于大肠癌组织学切片中细胞间的分界线往往不明确，采用MacintoshⅡ图象分析系统(Adobphotoshop5.0)按文献[6]提供的方法(公式11)计算待测切片上阳性反应程度的阳性单位(PU)，得到免疫组化显色反应的量化结果。统计学处理PU值以±5表示，邻片间VEGF与KDR的表达量比较采用配对资料的t检验，以上统计分析均在Spess8.0统计分析软件中进行。2结果2.1免疫组化染色结果①正常大肠组织及空白对照切片中均未见免疫反应阳性信号，在癌组织中，VEGF阳性物质主要位于癌细胞的胞膜和(或)胞质，血管内皮细胞上未见VEGF染色；KDR阳性物质主要位于癌组织的血管内皮细胞上，且新生血管内皮细胞的着色明显强于较大血管内皮细胞.部分无血管区域的癌细胞上也有弱的KDR染色.②VEGF和KDR的染色程度与肿瘤区域及病理分型有关，癌组织边缘区细胞的染色要强于中心区，桉病理分型恶性程度高者较恶性程度低者染色程度为强，③对比两张邻片，VEGF的阳性反应强度要明显强于KDR。2.2图象分析法定量结果80例大肠癌中，VEGF的阳性反应定量结果为19.2±9.5.KDR的阳性反应定量结果为10.5±7.1，二者间存在显著性差异(P<0.01)。3讨论
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实体瘤的生长和转移需要新生血管生成，肿瘤血管形成受肿瘤细胞分泌的上管形成因子调节，目前，已经发现的血管形成因子较多，VEGF是其中最重要的，它即可直接作用于血管内皮细胞，刺激其有丝分裂的发生，从而促进新生血管的生长，也可通过增加上管通透性，使包括许多基质形成重要因子的血浆蛋白外渗，为血管内皮细胞的迁移及肿瘤细胞的转移提供基质，VEGF是通过作用子内反细胞上的VEGF受体来发挥其生物学作用的，已发现的VEGF受体有三种：FLK-1(KDR)，FLT-1，FLT-4，已知与内皮细胞的增殖和血管生成有关的只有FLK-1(KDR)[7]。目前关于VEGF及其受体在肿瘤组织由的表达部位及作用方式认识不一，Wizigmannetal[8]认为VEGF主要表达于肿瘤细胞，Brownetal[9]研究发现VEGF仅表达于肿瘤细胞，血管内皮细胞也可表达，而FLK-1(FDR)仅表达于肿瘤血管内皮细胞，在肿瘤上皮细胞中不表达.Boococketal[10]则发现FLK-1(KDR)不仅可在肿瘤间质的血管内皮细胞中表达，而且在肿瘤上皮中亦有表达，我们的矿究发观，VEGF主要表达于大肠癌细胞中，在肿瘤血管内皮细胞中无表达；FLK-l(KDR)主要表达于肿瘤血管内皮细胞，部分大肠癌细胞中亦有较弱表达、这表明VEGF主要是通过旁分泌作用机制诱导肿瘤血管形成，从而促进肿瘤细胞的生长，同时可能作为一种自分泌生长调节因子直接促进肿瘤细胞的生长。本研究结果说明：①作为一种分泌的蛋白，VEGF主要分布于肿瘤细胞中，而KDR主要位于血管内皮细胞上，这样药物入血后可直接作用于KDR，而作作于VEGF则需穿透血管；②虽然二者在恶性肿瘤中都有表达，但KDR相比VEGF的表达量明显低，由此推测，使用较小的药量作用于KDR就可能达到较好的治疗效果，由此预测，在肿瘤血管的靶向治疗中，VEGF受体作为靶点可能比以VEGF更有效。
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参考文献：
[1]王贵齐，王耐勤，刘彤，徐光炜，董志伟，血管内皮生长因子抗体对实验性肿瘤的抑制作用，中华肿瘤杂志，1997；19：163-166
[2] 董凡，许新，景乃禾，金由辛，反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞表达VEGF的研究，肿瘤1997；17：65-66
[3]董凡，金由辛，VEGF反义核酸抑制肿瘤血管形成的研究，中华肿瘤杂志，1997；19：264-266
[4]Zhu ZP，Rockwell P,Lu D,Kotanides H,Pytowski B,Hicklin DJ,Bohlen P,Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced receptor activation with anti-kinase insert domain-containing receptor single-chain antibodies from a phage display library,Cancer Res,1998;58:3209-3214
, http://www.100md.com
[5]李晓明，汤刈猷，陈方国，突变型flk-1基因转染抑制肝癌在裸鼠体内血管形成，生长和转移，中国肿瘤生物治疗杂志，1998；5：160-162
[6]申洪，陆药丹，免疫组织化学染色的定量方法研究，生物医学工程学杂志，1993；10：281-284
[7] Witte L,Hicklin DJ,Zhu ZP,Pytowski B,Kotanides H,Rockwell P,Bohlen P.Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2(Fllk1/KDR)as an anti-angiogenic therapeutic strategy,Cancer And Metastasis Reviews,1998;17:155-161
[8]Wizigmann-Voos S,Breier G,Risau W,Plate KH.Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.Cancer Res,1995;55:1358-1364
, 百拇医药
[9] Brown LF,Berse B,Jackman RW,Tognazzi K,Manseau EJ,Kvorak HF,Senger DR.Increased expression of vascular permeability factor and its receptors in kidney and bladder carcinomas.Am J Pathol,1993;143:1255-1262
[10]Boocock CA,Charnock-Jones DS,Sharkey AM,McLaren J,Barker PJ,Wright KA,Twentyman PR,Smith SK.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR in ovarian carcinoma.J Natl Cancer Inst,1995;87:506-516
收稿日期：2000-01-14, 百拇医药