反流性肾病患儿T淋巴细胞免疫活性的变化及其意义

http://www.100md.com 《中国现代医学杂志》 2000年第4期

     作者：纪泽泉 柳文鉴 殷光真 黄翠雯

    单位：广州医学院第二附属医院儿科 510260

    关键词：反流性肾病；T淋巴细胞亚群；淋巴细胞活化

    中国现代医学杂志000413目的：探讨细胞免疫在反返流性肾病(RN)发病中的作用。方法：通过流式细胞仪(FCM)，应用单标和双标免疫荧光法，利用单克隆抗体测定12例RN患儿外周血单个核细胞(PBMC)表面膜抗原，从而分析RN患者T淋巴亚群及其活化情况。结果：T淋巴细胞亚群CD⁺₃、CD⁺₄与正常组相仿，CD⁺₈增高，CD⁺₄/CD⁺₈比值低于正常(P<0.01)；T细胞CD⁺₂₅表达高于正常，T细胞亚群活化表达CD⁺₃CD⁺₂₅、CD⁺₄CD⁺₂₅、CD⁺₈CD⁺₂₅分别较正常组高 (P<0.01)；活性化抗原CD⁺₆₉，CD⁺₇₁均高于正常组(P<0.01)；相关分析显示CD⁺₄/CD⁺₈比值与CD⁺₈、CD⁺₂₅、CD⁺₃、CD⁺₂₅均存在负相关(P<0.05)。结论：T细胞异常活化在RN发病机制中起重要作用，T细胞功能紊乱与本病关系密切。
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    分类号 R692

    THE CHANGE AND SIGNIFCANCE OF REFLUX INFANTILE

    NEPHROTIC T LYMPHOCYTIC IMMUNOCOMPETENCE

    Ji Zequan Liu Wenjian Yin Guangzhen Huang Cuiwen

    (Department of Pediatrics, Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260)

    Objective: To investigate the role of cellular immunity in the pathogenesis of reflux nephropathy (RN). Methods: The flowcytometer was used to study the changes of T lymphocyte subsets from peripheral blood mononuclear cell of 12 cases RN patients through one or two colors immunofluorescence staining and a series of monoclonal antibodies. Results: There were no remarkable differences of the CD⁺₃, CD⁺₄ subsets between the patients and the normal, the CD⁺₈ was much higher than that of the normal, and CD⁺₄/CD⁺₈ ratio decreased (P<0.01). The CD⁺₂₅ cells was significantly elevated, and the activation of T lymphocyte subpopulations CD⁺₃CD⁺₂₅, CD⁺₄CD⁺₂₅, CD⁺₈CD⁺₂₅ increased accordingly (P<0.01). Lymphocyte ativation antigens CD⁺₆₉, CD⁺₇₁ were significantly improved in RN (P<0.01). The CD⁺₄/CD⁺₈ ratio has negative correlation with CD⁺₈, CD⁺₂₅, CD⁺₃CD⁺₂₅(P<0.05). Conclusions: An aberrant activation of T lymphocytes might play an important role in the pathogenesis of RN, and disorder of T lymphocyte was relevant to the process of RN.
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    Key words: Reflux nephropathy; T lymphocyte subset; Lymphocyte activation.

    本实验通过流式细胞仪，应用单标和双标免疫荧光法，利用单克隆抗体测定外周血单个核细胞表面膜抗原，从而分析反流性肾病(RN)患儿T细胞亚群及其活化表达，旨在进一步探讨细胞免疫在该病发病中的作用。

    1 对象和方法

    1.1 研究对象

    病例组：12例，男8例，女4例，年龄1～13岁，病程0.5～3.5年，经X线排尿期膀胱尿道造影确诊VUR，伴有下述指标任何一个：尿β₂-M和(或)BUN、Scr升高；肾瘢痕或萎缩。其中尿β₂-M升高10例，BUN、Scr升高8例，肾瘢痕8例，肾萎缩1例。
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    对照组：10例，男5例，女5例，均为年龄相仿健康儿童。

    1.2 研究方法

    肝素抗凝(25 u/ml)静脉血各取50 μl，单标法：分别与单克隆抗体CD₃、CD₄、CD₈、CD₂₅、CD₆₉、CD₇₁10 μl混合，二抗为IgG^.FITC；双标法：CD₃^.FITC、CD₄^.FITC、CD₈^.FITC分别与CD₂₅^.PE同时加入血标本中混合。室温孵育30 min后用红细胞裂解液裂解红细胞。用PBS缓冲液洗涤，固定后通过流式细胞仪分析，在细胞点状图中，划出淋巴细胞区，设定荧光强度标记，以确定单阳性区，双阳性区^[1，2]。红细胞裂解液(0.155M NH₄Cl，0.01M KHCO₃，0.1mM EDTA,pH7.4)，固定液(1%多聚甲醛^.BPS)，单克隆抗体购自军事医学科学院。
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    1.3 统计学方法

    文中资料以±s表示，使用t检验及直线相关分析，显著性判断标准P<0.05。

    2 结果

    2.1 T淋巴细胞亚群结果

    病例组CD⁺₃、CD⁺₄与正常组比较，变化不大(P>0.05)，CD⁺₈明显增高，CD⁺₄/CD⁺₈比值显著低于正常(P<0.01)。

    2.2 反流性肾病T淋巴细胞CD⁺₂₅表达
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    正常组外周血CD⁺₂₅淋巴细胞为14.03%，病例组为26.8%，明显高于正常(P<0.01)，通过双标法测得病例组CD⁺₃CD⁺₂₅、CD⁺₄CD⁺₂₅、CD⁺₈CD⁺₂₅分别较正常组高，显示RN患者T淋巴细胞及其亚群CD⁺₂₅表达均高于正常人。

    2.3 活性化抗原CD⁺₆₉，CD⁺₇₁结果

    返流性肾病组外周血CD⁺₆₉、CD⁺₇₁分别为1.60±0.43、2.87±0.65,均高于正常组。
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    2.4 相关分析

    RN患儿CD⁺₄/CD⁺₈细胞比值与CD⁺₈、CD⁺₂₅、CD⁺₃、CD⁺₂₅均存在直线负相关(r＝-0.735，P<0.01；r＝-0.648，P<0.05；r＝-0.587，P<0.05)。

    3 讨论

    结果显示RN患者T细胞亚群CD⁺₃、CD⁺₄无明显变化，CD⁺₈细胞增多，CD⁺₄/CD⁺₈细胞比值下降，实验测得正常组CD⁺₄/CD⁺₈比值为1.54，与临床正常值基本一致，而RN组为0.89，提示体内T淋巴细胞免疫调节功能紊乱。
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    CD⁺₂₅百分率反映淋巴细胞膜IL-2R，为淋巴细胞激活状态，能进一步了解免疫细胞功能情况。结果显示正常组外周血单个核细胞CD⁺₂₅为14.03%，其结果与Ohashi基本一致^[3]，表明正常人外周血存在一定量活化淋巴细胞，RN组26.8%，显著高于正常组，通过双色荧光标记进一步分析，测得T淋巴细胞亚群活化细胞CD⁺₃CD⁺₂₅、CD⁺₄CD⁺₂₅、CD⁺₈CD⁺₂₅均高于正常组，说明外周血T细胞及其亚群均出现过度活化现象。

    CD₆₉和CD₇₁均为淋巴细胞活化增殖表达的分子抗原，CD₆₉为活化诱导分子，在淋巴细胞受刺激后最早出现的活性化抗原^[4]，CD₇₁为转铁蛋白受体，反映了细胞活化增殖中铁基础代谢的需要，结果显示RN组CD⁺₆₉、CD⁺₇₁均高于正常组，表明体内淋巴细胞存在异常活化状态。
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    相关分析表明RN组CD⁺₄/CD⁺₈比值与CD⁺₈、CD⁺₂₅、CD⁺₃CD⁺₂₅均直线负相关，表明过度活化T细胞在该病发病机制中起重要作用，而CD8细胞可能起关键作用，是否分化为效应细胞介导细胞毒作用造成肾脏免疫损伤，仍有待进一步研究。

    参 考 文 献

    1，Gee AP.Preparation of Samples for flow cytometric analysis.J Hematotherapy,1993；2:413

    2，Terstappen LWMM.Assessment of hematopoietic cell differentiation by multidimensional flow cytometry.J.Hematotherapy,1993；2:431
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    3，Ohashi Y,Differential expression of the IL-2 receptor subunits,p55 and p75 on various populations of primary peripheral blood mononuclear cells.J Immunol,1989；143(11):3548

    4，Yacyshyn MB,Poppema S.Berg A,et al.CD⁺₆₉ and HLA DR⁺ activation antigens on peripheral blood Iymphocyte populations in metastatic breast and ovarian cancer patients.Int J Cancer,1995；61(4):470

    收稿1999-08-16, 百拇医药

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