高效凝胶渗透色谱法在右旋糖酐铁质控中的应用
作者：范慧红 刘金秀 徐康森
单位：范慧红 刘金秀 徐康森(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
关键词：高效凝胶渗透色谱法；右旋糖酐铁；质量控制
药物分析杂志000413 摘要 目的：采用高效凝胶渗透色谱法对几种右旋糖酐铁样品进行质量分析。方法：色谱柱为Shodex Asahipak GF-510HQ(7.6 mm×300 mm)，以已知分子量的葡聚糖(Dextran)为标样，水为流动相；柱温35 ℃；流速0.5 mL.min-1；示差折光检测器。结果：样品经直接测定得到右旋糖酐铁特征HPGPC图谱和游离右旋糖酐含量；样品经酸水解，测得右旋糖酐铁中右旋糖酐的重均分子量和分子量分布。结论：该法操作简便、快速，可用于右旋糖酐铁的质量控制。
High Performance Gel Permeation Chromatography for
, http://www.100md.com
the Quality Control of Iron Dextran
Fan Huihong Liu Jinxiu Xu Kangsen
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Abstract Objective：Several kinds of samples of iron dextran were analyzed by HPGPC.Methods:The Shodex Asahipak GF-510 column was used with distilled water as mobile phase using dextrans with known molecular weights as calibration standards.The flow rate was 0.5 mL.min-1.The column temperature was 35 ℃ and RI detector was used.Results:The specific chromatograms of iron dextran and the contents of free dextran in the samples were obtained by detecting the samples directly.The average molecular weight and molecular weight distribution were determined with acid hydrolyzed iron dextran samples.Conclusion:The method is simple,rapid and convenient.It could be used in the quality control of iron dextran.
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Key words high performance gel permeation chromatography,iron dextran,quality control▲
右旋糖酐铁是一种常用抗贫血药，临床主要用于治疗缺铁性贫血症。国内外药典均有收载，各药典均指明本品是低分子右旋糖酐(平均分子量5 000～7 500)与铁的络合物，但在检测项目中缺乏本品大分子特征的定性鉴别和右旋糖酐的分子量控制。为保证右旋糖酐铁产品安全有效，有必要完善现有质量标准。
高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)具有简便、快速和重现性好等优点，已经广泛用于测定大分子物质的分子量及其分布[1，2]。英国药典和欧洲药典已收载此法，用于低分子肝素等药品的质量控制。本文首次报道将HPGPC法用于右旋糖酐铁的质量控制，对国内2个厂家和英国FISONS公司右旋糖酐铁产品进行HPGPC测定，试为右旋糖酐铁质量标准的提高提供依据。
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1 仪器与试药
高效液相色谱仪：日本岛津CLASS-LC10工作站系统和GPC应用软件，LC-10AT泵，RID-6A示差折光检测器，CBM-10A接口，DGU-4A脱气装置，CTO-10A恒温柱箱。Millipore超纯水器。Mettler AE163天平。
右旋糖酐铁样品来自国内2个厂家和英国FISONS公司，共有2批原料和3批注射液。已知分子量的葡聚糖(Dextran)标准品为Fluka产品，葡聚糖2000为Sigma产品，叠氮化钠(NaN3)为进口超纯试剂，葡萄糖、盐酸为国产分析纯试剂。
2 色谱条件
色谱柱为Shodex Asahipak GF-510HQ(300 mm×7.6 mm，硅胶，10 μm)，排阻范围：300 000；流动相为水；检测温度和柱温为35 ℃；流速0.5 mL.min-1；进样量25 μL。在该色谱条件下，理论塔板数按葡萄糖峰计算为15 206，葡萄糖保留时间tR为18.873 min，葡聚糖2000的tR为8.917 min，样品tR需在8.917～18.873 min之间，即样品分配系数Kd应在0～1之间，该色谱系统才能准确测定样品的分子量及其分布。
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3 标准曲线的绘制
根据待测样品的分子量估算，本文选用重均分子量为1 270，5 220，11 600，23 800，48 600的5个葡聚糖标样制作标准曲线。分别取标样适量，加水制成10 mg.mL-1内含0.02%叠氮化钠的标准溶液，分别进样，记录色谱图，应用GPC软件绘制标准曲线。线性回归方程为：
logMw=8.647-0.310tR r=0.998 n=5
4 样品测定
4.1 样品直接测定
原料：精密称取样品约100 mg于试管中，加水20 mL，振摇，水浴加热10 min，放冷，室温放置24 h，滤过。进样，记录色谱图。
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注射液：精密量取规格为50 mg.mL-1(Fe)的注射液1 mL加水9 mL，或规格为25 mg.mL-1(Fe)的注射液1 mL加水4 mL，摇匀，同原料方法测定。
4.2 样品酸水解后测定
原料：精密称取样品约100 mg，置试管中，加水15 mL，盐酸50 μL，振摇，水浴加热30 min，放冷。同“4.1”方法测定。
注射液：精密量取规格50 mg.mL-1(Fe)注射液1.5 mL，或取规格25 mg.mL-1(Fe)注射液3.0 mL，加水稀释至15 mL，同原料方法测定。
5 结果与讨论
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5.1 样品直接测定 各产品HPGPC分析表明图谱中峰数、峰形和相对含量不同(图1，表1)，说明各产品内在质量不一样。但各图谱也有相似之处：(1)在13 min之前均有2～3个峰，按线性回归方程计算，其分子量在50 000以上，这与实际不相符。笔者认为它们是右旋糖酐铁组分，由于右旋糖酐铁是以络合物形式存在，其分子空间结构与标样葡聚糖是不相同的，其流体力学体积较大，所以不能以葡聚糖标定的线性方程计算右旋糖酐铁的分子量。在13 min之前出现2～3个峰是由于右旋糖酐与铁络合程度不同引起的。因此从HPGPC图谱可了解右旋糖酐铁组分和相对含量，从而了解各产品的质量和稳定性。(2)各图谱在15～16 min 均有1个峰，按线性方程计算峰位分子量为5 000～7 500，估计是游离右旋糖酐峰。游离右旋糖酐含量可以体现产品的纯度和稳定性。从表1可以得到各产品游离右旋糖酐含量，其中国内产品游离右旋糖酐在10%以下，英国FISONS产品游离右旋糖酐高达35.9%。
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图1 右旋糖酐铁HPGPC图谱(横坐标：t/min,纵坐标：U/mV
A.英国注射液 B.厂家1注射液 C.厂家2注射液 D.厂家1原料 E.厂家2原料表1 右旋糖酐铁HPGPC色谱图分析结果 供试品名称
峰号
tR/min
相对含量/%
英国注射液
1
8.549
11.4
2
, http://www.100md.com 9.730
5.6
3
10.917
47.1
4
15.523
35.9
厂家1注射液
1
8.291
85.5
2
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9.260
2.4
3
10.366
8.4
4
15.843
3.3
厂家2注射液
1
8.211
50.2
2
, 百拇医药
12.877
23.6
3
15.900
6.0
4
17.995
18.1
5
19.605
2.1
厂家1原料
1
, 百拇医药
8.187
72.8
2
9.623
0.7
3
10.903
19.9
4
15.478
6.6
厂家2原料
1
, 百拇医药
8.481
84.1
2
10.903
8.2
3
15.601
5.4
4
17.082
2.3
5.2 样品酸水解后测定 实验发现右旋糖酐铁溶液在pH 2～3酸性条件下易解离Fe3+。笔者通过对酸种类、pH、水浴加热时间、室温平衡时间和样品浓度的考察，得到酸水解条件使Fe3+完全解离而右旋糖酐本身不被破坏。各产品酸水解后HPGPC图谱均有3个峰(图2)，峰1按线性方程计算，峰位分子量为5 000～7 500，可见峰1为右旋糖酐，说明右旋糖酐铁组分已经消失。峰2和峰3为右旋糖酐铁酸水解后产生的小分子杂质。采用GPC软件对峰1进行计算，得到右旋糖酐峰位分子量、重均分子量和分子量分布见表2。由于右旋糖酐结构与标样葡聚糖一致，所以不必对标准曲线进行普适校正，测定结果是可靠的[3]。
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表2 右旋糖酐铁酸水解后HPGPC测定结果 供试品名称
tR/min
峰位分子量
重均分子量
分布宽度
英国注射液
15.891
5332
6152
1.47
厂家1注射液
15.926
, 百拇医药
5201
6727
1.32
厂家2注射液
15.731
5977
6948
1.40
厂家1原料
15.337
7915
8306
1.35
, 百拇医药
厂家2原料
15.669
6247
7328
1.48
图2 酸水解后右旋糖酐铁HPGPC图谱(横坐标：t/min,纵坐标：U/mV
A.英国注射液 B.厂家1注射液 C.厂家2注射液 D.厂家1原料 E.厂家2原料
6 小结
本文采用HPGPC法直接测定右旋糖酐铁得到特征HPGPC图谱，可以了解该样品大分子特征和纯度，从而确保本品是有机络合铁易被人体吸收。由于缺少右旋糖酐铁结构和临床疗效关系研究数据，目前还不能判定哪种产品质量好，本文给出的5种产品的HPGPC图谱，只能说明现有右旋糖酐铁产品的质量现状，制订右旋糖酐铁本身的分子量指标有待于进一步研究。右旋糖酐铁经酸水解后用HPGPC测定，可准确测得右旋糖酐各种平均分子量和分布宽度，以保证右旋糖酐铁生产原料为低分子右旋糖酐。实验结果表明本文HPGPC法操作简便、快速，可用于该产品质量控制。本文方法拟增订到该品种2000版中国药典中。■
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参考文献
1.Dreher T W,Hawthorne D B,Grant B R.Comparison of open column and high performance gel permeation chromatography in the separation and molecular weight estimation of polysaccharides.J Chromatogr,1979,174:443
2.Aslop R M,Vlachogiannis G J.Determination of the molecular weight of clinical dextrans by gel permeation chromatography on TSK PW type columns.J Chromatogr,1982,246:227
3.施良和.凝胶色谱法.北京：科学出版社，1980.208
(本文于2000年3月17日修改回), 百拇医药
单位：范慧红 刘金秀 徐康森(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
关键词：高效凝胶渗透色谱法；右旋糖酐铁；质量控制
药物分析杂志000413 摘要 目的：采用高效凝胶渗透色谱法对几种右旋糖酐铁样品进行质量分析。方法：色谱柱为Shodex Asahipak GF-510HQ(7.6 mm×300 mm)，以已知分子量的葡聚糖(Dextran)为标样，水为流动相；柱温35 ℃；流速0.5 mL.min-1；示差折光检测器。结果：样品经直接测定得到右旋糖酐铁特征HPGPC图谱和游离右旋糖酐含量；样品经酸水解，测得右旋糖酐铁中右旋糖酐的重均分子量和分子量分布。结论：该法操作简便、快速，可用于右旋糖酐铁的质量控制。
High Performance Gel Permeation Chromatography for
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the Quality Control of Iron Dextran
Fan Huihong Liu Jinxiu Xu Kangsen
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Abstract Objective：Several kinds of samples of iron dextran were analyzed by HPGPC.Methods:The Shodex Asahipak GF-510 column was used with distilled water as mobile phase using dextrans with known molecular weights as calibration standards.The flow rate was 0.5 mL.min-1.The column temperature was 35 ℃ and RI detector was used.Results:The specific chromatograms of iron dextran and the contents of free dextran in the samples were obtained by detecting the samples directly.The average molecular weight and molecular weight distribution were determined with acid hydrolyzed iron dextran samples.Conclusion:The method is simple,rapid and convenient.It could be used in the quality control of iron dextran.
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Key words high performance gel permeation chromatography,iron dextran,quality control▲
右旋糖酐铁是一种常用抗贫血药，临床主要用于治疗缺铁性贫血症。国内外药典均有收载，各药典均指明本品是低分子右旋糖酐(平均分子量5 000～7 500)与铁的络合物，但在检测项目中缺乏本品大分子特征的定性鉴别和右旋糖酐的分子量控制。为保证右旋糖酐铁产品安全有效，有必要完善现有质量标准。
高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)具有简便、快速和重现性好等优点，已经广泛用于测定大分子物质的分子量及其分布[1，2]。英国药典和欧洲药典已收载此法，用于低分子肝素等药品的质量控制。本文首次报道将HPGPC法用于右旋糖酐铁的质量控制，对国内2个厂家和英国FISONS公司右旋糖酐铁产品进行HPGPC测定，试为右旋糖酐铁质量标准的提高提供依据。
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1 仪器与试药
高效液相色谱仪：日本岛津CLASS-LC10工作站系统和GPC应用软件，LC-10AT泵，RID-6A示差折光检测器，CBM-10A接口，DGU-4A脱气装置，CTO-10A恒温柱箱。Millipore超纯水器。Mettler AE163天平。
右旋糖酐铁样品来自国内2个厂家和英国FISONS公司，共有2批原料和3批注射液。已知分子量的葡聚糖(Dextran)标准品为Fluka产品，葡聚糖2000为Sigma产品，叠氮化钠(NaN3)为进口超纯试剂，葡萄糖、盐酸为国产分析纯试剂。
2 色谱条件
色谱柱为Shodex Asahipak GF-510HQ(300 mm×7.6 mm，硅胶，10 μm)，排阻范围：300 000；流动相为水；检测温度和柱温为35 ℃；流速0.5 mL.min-1；进样量25 μL。在该色谱条件下，理论塔板数按葡萄糖峰计算为15 206，葡萄糖保留时间tR为18.873 min，葡聚糖2000的tR为8.917 min，样品tR需在8.917～18.873 min之间，即样品分配系数Kd应在0～1之间，该色谱系统才能准确测定样品的分子量及其分布。
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3 标准曲线的绘制
根据待测样品的分子量估算，本文选用重均分子量为1 270，5 220，11 600，23 800，48 600的5个葡聚糖标样制作标准曲线。分别取标样适量，加水制成10 mg.mL-1内含0.02%叠氮化钠的标准溶液，分别进样，记录色谱图，应用GPC软件绘制标准曲线。线性回归方程为：
logMw=8.647-0.310tR r=0.998 n=5
4 样品测定
4.1 样品直接测定
原料：精密称取样品约100 mg于试管中，加水20 mL，振摇，水浴加热10 min，放冷，室温放置24 h，滤过。进样，记录色谱图。
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注射液：精密量取规格为50 mg.mL-1(Fe)的注射液1 mL加水9 mL，或规格为25 mg.mL-1(Fe)的注射液1 mL加水4 mL，摇匀，同原料方法测定。
4.2 样品酸水解后测定
原料：精密称取样品约100 mg，置试管中，加水15 mL，盐酸50 μL，振摇，水浴加热30 min，放冷。同“4.1”方法测定。
注射液：精密量取规格50 mg.mL-1(Fe)注射液1.5 mL，或取规格25 mg.mL-1(Fe)注射液3.0 mL，加水稀释至15 mL，同原料方法测定。
5 结果与讨论
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5.1 样品直接测定 各产品HPGPC分析表明图谱中峰数、峰形和相对含量不同(图1，表1)，说明各产品内在质量不一样。但各图谱也有相似之处：(1)在13 min之前均有2～3个峰，按线性回归方程计算，其分子量在50 000以上，这与实际不相符。笔者认为它们是右旋糖酐铁组分，由于右旋糖酐铁是以络合物形式存在，其分子空间结构与标样葡聚糖是不相同的，其流体力学体积较大，所以不能以葡聚糖标定的线性方程计算右旋糖酐铁的分子量。在13 min之前出现2～3个峰是由于右旋糖酐与铁络合程度不同引起的。因此从HPGPC图谱可了解右旋糖酐铁组分和相对含量，从而了解各产品的质量和稳定性。(2)各图谱在15～16 min 均有1个峰，按线性方程计算峰位分子量为5 000～7 500，估计是游离右旋糖酐峰。游离右旋糖酐含量可以体现产品的纯度和稳定性。从表1可以得到各产品游离右旋糖酐含量，其中国内产品游离右旋糖酐在10%以下，英国FISONS产品游离右旋糖酐高达35.9%。
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图1 右旋糖酐铁HPGPC图谱(横坐标：t/min,纵坐标：U/mV
A.英国注射液 B.厂家1注射液 C.厂家2注射液 D.厂家1原料 E.厂家2原料表1 右旋糖酐铁HPGPC色谱图分析结果 供试品名称
峰号
tR/min
相对含量/%
英国注射液
1
8.549
11.4
2
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5.6
3
10.917
47.1
4
15.523
35.9
厂家1注射液
1
8.291
85.5
2
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9.260
2.4
3
10.366
8.4
4
15.843
3.3
厂家2注射液
1
8.211
50.2
2
, 百拇医药
12.877
23.6
3
15.900
6.0
4
17.995
18.1
5
19.605
2.1
厂家1原料
1
, 百拇医药
8.187
72.8
2
9.623
0.7
3
10.903
19.9
4
15.478
6.6
厂家2原料
1
, 百拇医药
8.481
84.1
2
10.903
8.2
3
15.601
5.4
4
17.082
2.3
5.2 样品酸水解后测定 实验发现右旋糖酐铁溶液在pH 2～3酸性条件下易解离Fe3+。笔者通过对酸种类、pH、水浴加热时间、室温平衡时间和样品浓度的考察，得到酸水解条件使Fe3+完全解离而右旋糖酐本身不被破坏。各产品酸水解后HPGPC图谱均有3个峰(图2)，峰1按线性方程计算，峰位分子量为5 000～7 500，可见峰1为右旋糖酐，说明右旋糖酐铁组分已经消失。峰2和峰3为右旋糖酐铁酸水解后产生的小分子杂质。采用GPC软件对峰1进行计算，得到右旋糖酐峰位分子量、重均分子量和分子量分布见表2。由于右旋糖酐结构与标样葡聚糖一致，所以不必对标准曲线进行普适校正，测定结果是可靠的[3]。
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表2 右旋糖酐铁酸水解后HPGPC测定结果 供试品名称
tR/min
峰位分子量
重均分子量
分布宽度
英国注射液
15.891
5332
6152
1.47
厂家1注射液
15.926
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5201
6727
1.32
厂家2注射液
15.731
5977
6948
1.40
厂家1原料
15.337
7915
8306
1.35
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厂家2原料
15.669
6247
7328
1.48
图2 酸水解后右旋糖酐铁HPGPC图谱(横坐标：t/min,纵坐标：U/mV
A.英国注射液 B.厂家1注射液 C.厂家2注射液 D.厂家1原料 E.厂家2原料
6 小结
本文采用HPGPC法直接测定右旋糖酐铁得到特征HPGPC图谱，可以了解该样品大分子特征和纯度，从而确保本品是有机络合铁易被人体吸收。由于缺少右旋糖酐铁结构和临床疗效关系研究数据，目前还不能判定哪种产品质量好，本文给出的5种产品的HPGPC图谱，只能说明现有右旋糖酐铁产品的质量现状，制订右旋糖酐铁本身的分子量指标有待于进一步研究。右旋糖酐铁经酸水解后用HPGPC测定，可准确测得右旋糖酐各种平均分子量和分布宽度，以保证右旋糖酐铁生产原料为低分子右旋糖酐。实验结果表明本文HPGPC法操作简便、快速，可用于该产品质量控制。本文方法拟增订到该品种2000版中国药典中。■
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参考文献
1.Dreher T W,Hawthorne D B,Grant B R.Comparison of open column and high performance gel permeation chromatography in the separation and molecular weight estimation of polysaccharides.J Chromatogr,1979,174:443
2.Aslop R M,Vlachogiannis G J.Determination of the molecular weight of clinical dextrans by gel permeation chromatography on TSK PW type columns.J Chromatogr,1982,246:227
3.施良和.凝胶色谱法.北京：科学出版社，1980.208
(本文于2000年3月17日修改回), 百拇医药