中华大蟾蜍皮化学成分研究
作者：杨立宏 金向群 张薇
单位：杨立宏 张薇(深圳市南山医药公司，深圳 518051)；金向群(吉林省中医中药研究院，长春 130021)
关键词：中华大蟾蜍；蟾蜍毒素；蟾蜍噻咛；光色素；化学位移
沈阳药科大学学报000421 摘 要 从中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)皮水溶性部分应用制备型反相HPLC分离得到5个化合物，根据光谱分析、氨基酸分析及化学性质，确定为蟾蜍灵3-丁二酰精氨酸酯(Ⅰ)、华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯(Ⅱ)、脂蟾毒配基3-丁二酰精氨酸酯(Ⅲ)、蟾蜍噻咛(Ⅳ)、光色素(Ⅴ)；其中Ⅳ、Ⅴ为首次从该属动物中得到；并提出了蟾蜍毒素和蟾毒配基在13C-NMR谱中C-16位取代情况的化学位移特征.
分类号 R284.2
, 百拇医药
Studies on the Chemical Constituents from the Skin of Bufo bufo gargarizans Cantor
Yang Lihong,Jin Xiangqun,Zhang Wei
(Shenzhen Nanshan Medicine Company,Shenzhen 518051)
Abstract Five compounds were isolated from the aqueous extract of the skin of Bufo bufo gargarizans Cantor by means of preparative reversed phase HPLC. On the basis of their spectral data(UV,IR,1H-NMR,13C-NMR,EI-MS and FD-MS),amino acid analyses and chemical properties, they were identified as bufalin 3-succinoylarginine ester(Ⅰ),cinobufagin 3-succinoylarginine ester(Ⅱ), resibufogenin 3-succinoylarginine ester(Ⅲ),bufothionine(Ⅳ),lumichrome(Ⅴ).It is for the first time that compounds Ⅳand Ⅴwere isolated from B. b. gargarizans Cantor.
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Key words Bufo bufo gargarizans Cantor;bufotoxins;bufothionine;lumichrome;chemical shifts
作者对中华大蟾蜍皮的化学成分进行了研究，从水溶性部分得到并鉴定了5个化合物，其结构见图1.
Fig.1 Chemical constituents from the skin of B.b gargarizans Cantor
1 仪器与材料
Yanoco MP-S3显微熔点测定仪(温度计未校正)；中低压液相色谱仪(YZS-3型-天津科学仪器公司)；中低压液相色谱仪(ALPC-100型-日本应用分光机械株式会社)；HPLC仪(分析用Shimadzu LC-6A、Hitachi 9A型；制备用LC-10型)；Shimadzu UV-260型紫外分光光度计；Perkin-Elmer 599B和983G型红外分光光度计；FX-60Q和Bruker AM-250，AM-500型核磁共振仪；Hitachi 835型氨基酸自动分析仪.
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Amberlite XAD-2大孔树脂(Rohm ＆ Hass Co,Philadephia)；柱层析用硅胶H(青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20葡萄糖凝胶(进口分装).展开剂A为CHCl3-MeOH-H2O(体积比80∶20∶2.5)；B为n-BuOH-AcOH-H2O(体积比4∶1∶5)上层；C为AcOEt-MeOH(体积比3∶1).
中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)4 454只，冷冻处死，立即剥皮，用工业乙醇浸提.
2 提取与分离
蟾皮用工业乙醇30 kg 0～4℃冷浸4次，每次一个月，合并浸出液，回收乙醇，得乙醇粘稠液，先用乙醚-水萃取4次；再用乙酸乙酯-水萃取5次.上述残留水溶液50℃以下减压除去有机溶剂，加蒸馏水100 L稀释，流经Amberlite XAD-2大孔树脂，用蒸馏水20 L，12.06 mol/L甲醇1.5 L，17.32 mol/L甲醇5.0 L，19.18 mol/L甲醇5.0 L，22.28 mol/L甲醇5.0 L洗脱，再经硅胶柱层析，中低压液相层析(正相和反相)，HPLC分离及Sephadex LH-20纯化，得到化合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ.
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3 结构鉴定
化合物Ⅰ：无色无定形粉末(甲醇-乙醚重结晶)；mp 238～240℃；TLC(硅胶G)单一斑点，Rf 0.18，展开剂A，HPLC：单峰，tR 45.0 min，流动相MeOH-H2O(体积比10∶7)，二级管阵列检测纯度>95%.Liebermann-Burchard反应阳性；Sakaguchi试验阳性；茚三酮试验阴性；提示为甾类化合物，结构中含精氨酸，其α-氨基不游离，盐酸水解后氨基酸自动分析仪测定含有精氨酸；盐酸水解反应薄层层析示含蟾毒灵和丁二酸.分子式C34H50O8N4，FD-MS(m/e)M+642.UVλMeOHmax297.8 nm(α-吡喃酮环).IRνKBrmaxcm-13 600～3 200(OH，NH)，1 158(OH)，2 930，1 350(-CH3)，2 870，1 445(-CH2-)，1 760～1 715(酯及内酯-C=O)，1 600，1 545(酰胺-C=O，α-吡喃酮共轭-C=O).1H-NMR(DMS O-d6)δ0.60(3H，s，18-CH3)，0.90(3H，S，19-CH3)，2.42(4H，m，-COCH2CH2CO-)，4.95(1H，bs，3α-H)，6.26(1H，d，J=9.6 Hz，23H)，7.49(1H，S，21-H)，7.93(1H，q，J=9.6,1.7 Hz，22-H).13C-NMR(DMSO-d6)δ16.41(C-18)，23.34(C-19)，53.30(Arg-CH)，69.71(C-3)，83.27(C-14)，113.92(C-23)，122.51(C-20)，147.14(C-21)，148.94(C-22)，157.22(Arg -C=NH)，161.02(C-24)，169.43( CONH-)，171.36(COO-)，175.28(-COOH).FD-MS(m/e)644(M+2H)；513.EI-MS(m/e)386(bufalin)，350(386-2H2O)，162，91，41.IR表明分子中具有酯羰基及共轭双健伸缩振动吸收峰，1H-NMR及13C-NMR证明分子中含α-吡喃酮环以及丁二酰基(-COCH2CH2CO-).上述分析表明化合物Ⅰ含有下列结构单元：蟾毒灵；(-COCH2CH2CO-)；精氨酸.13C-NMR中，C-3向低场位移约δ4，而C-14基本未变，因此，成酯应在C-3位上，茚三酮反应提示精氨酸α-氨基不游离，IR显示有酰胺吸收带，其酰胺应由精氨酸α-氨基提供氨基部分.化合物Ⅰ1H-NMR、熔点及分子量与蟾毒灵3-丁二酰精氨酸酯〔1〕一致；13C-NMR与蟾毒灵〔2〕和精氨酸〔3〕一致.鉴定化合物Ⅰ为蟾毒灵3-丁二酰精氨酸酯.
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化合物Ⅱ：无色无定形粉末(甲醇-乙醚重结晶)；mp 200～202℃；TLC(硅胶G)单一斑点，Rf 0.18，展开剂A，HPLC：单峰，tR 32.5 min，流动相MeOH-H2O(体积比10∶7)，二级管阵列检测纯度>95%.Liebermann-Burchard反应阳性；Sakaguchi试验阳性；茚三酮试验阴性.盐酸水解经氨基酸自动分析仪测定含精氨酸；盐酸水解反应薄层层析示含华蟾毒精和丁二酸.分子式C36H50O10N4，FD-MS(m/e)M+698.UVλMeOHmax294.2 nm(α-吡喃酮环).IRνKBrmaxcm-13 380，1 140(OH)，3 200(NH)，2 950，1 380(-CH3)，1 730～1 690(酯，羧酸 C=O)，1 640，1 550(酰胺 -C=O，α-吡喃酮环共轭 -C=O)，1 250(乙酰基 C-O).1H-NMR(CD3 OD)δ0.82(3H，S，18-CH3)，1.01(3H，S，19-CH3)，1.87(3H，S，16β-OCOCH3)，2.60(4H，m，COCH2CH2CO)，2.91(1H，d，J=9.3 Hz,17α-H)，3.73(1H，S，15α-H)，4.27(Arg-CH)，5.07(1H，bs，3α-H)，5.48(1H，d，J=9.3 Hz,16α-H)，6.23(1H，d，J=9.7 Hz,23-H)，7.36(1H，S，21-H)，8.00(1H，bd，22-H).13C-NMR(CD3OD)δ17.50(C-18)，20.35(-OCOCH3)，22.12(C-19)，40.42(C-9)，40.68(C-12)，46.37(C-13)，51.52(C-17)，55.22(Arg-CH)，60.61(C-15)，72.36(C-3)，73.42(C-14)，76.62(C-16)，114.10(C-23)，118.31(C-20)，150.76(C-21)，153.51(C-22)，158.60(Arg-C=NH)，163.92(C-24)，171.60(C=O，16 β-OAC)，173.46(CONH-)，173.81(COO-)，177.93(-COOH).FD-MS(m/e)699(M++H)，655(M-COCH3).EI-MS(m/e)442(cinobufagin)，399(442-COCH3)，233，215，43(+COCH3).据IR、UV、1H-NMR及13C-NMR推测该化合物为蟾毒素类化合物. 盐酸水解反应薄层层析示含有华蟾毒精；EI-MS(m/e)有442碎片与华蟾毒精分子量(442)一致；215，233示C14和C15具有三元氧环结构.氨基酸分析及13C-NMR证实分子中含精氨酸.FD-MS(m/e)699(M++1).13C-NMR给出了36个碳信号，并证实成酯在C-3位上，IR及茚三酮反应证实分子中所形成的酰胺结构由精氨酸提供α-氨基.1H-NMR和盐酸水解反应薄层层析证实有-CO(CH2)2CO-存在. 化合物Ⅱ1H-NMR、熔点及分子量与华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯〔1〕一致. EI-MS与13C-NMR分别与文献〔3，4〕中的华蟾毒精和精氨酸一致，鉴定化合物Ⅱ 为华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯.
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化合物Ⅲ：无色无定形粉末(甲醇-乙醚重结晶)；mp 209～211℃；TLC(硅胶G)单一斑点，Rf 0.18，展开剂A，HPLC：单峰，tR 38.0 min，流动相MeOH-H2O(体积比10∶7)，二级管阵列检测纯度>95%.Liebermann-Burchard反应阳性；Sakaguchi试验阳性；茚三酮试验阴性.盐酸水解后经氨基酸自动分析仪测定含精氨酸；盐酸水解反应薄层层析示含华蟾毒精和丁二酸.分子式C34H48O8N4，FD-MS(m/e)M+640.UVλMeOHmax296.2 nm(α-吡喃酮环).IRνKBrmaxcm-13 400～3 200(OH，NH)，2 940，1 380(-CH3)，2 870，1 450(-CH2)，1 735～1 690(酯，羧酸C=O)，1 660，1 560(酰胺C=O)，1 630，1 538(α-吡喃酮环共轭 C=C )，1 210，1 185(环氧C-O)，955(C-C)，830(环氧C-O)〔5〕.1H-NMR(CD3 OD)δ0.82(3H，S，18-CH3)，1.05(3H，S，19-CH3)，2.65(4H，m，-COCH2CH2CO-)，3.65(1H，S，15α-H)；4.32(1H，m，Arg-CH)；5.11(1H，d，J=2.6 Hz,3α-H)，6.30(1H，d，J=9.8 Hz,23-H)，7.49(1H，d，J=2.6 Hz,21-H)，7.93(1H，q，J=9.8,2.6 Hz,22-H).13C-NMR(CD3OD)δ17.10(C-18)，20.26(C-19)，46.37(C-13)，49.84(C-17)，55.29(Arg-CH)，61.18(C-15)，72.42(C-3)，75.81(C-14)，115.35(C-23)，124.50(C-20)，149.48(C-21)，151.77(C-22)，158.74(Arg-C=NH)，164.39(C-24)，169.16(CONH)，173.62(COO-)，173.86(-COOH ).由上述分析推断该化合物为蟾蜍毒素类. 盐酸水解反应薄层层析和EI-MS证实有脂蟾毒配基和丁二酸，FD-MS(m/e)641(M++H)；13C-NMR给出34个碳信号，并证明在C3位上成酯、IR及茚三酮反应证实分子中酰胺由精氨酸提供α-氨基.1H-NMR和盐酸水解反应薄层层析证实有 -CO(CH2)2CO-存在.化合物Ⅲ熔点及光谱与文献〔1，3，4〕所记载脂蟾毒配基3-丁二酰精氨酸酯，脂蟾毒配基，精氨酸数据相符，鉴定为脂蟾毒配基3-丁二酰精氨酸酯.
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化合物Ⅳ：无色针晶(CHCl3-MeOH-H2O重结晶)，mp 250～252℃(分解有异臭)；TLC(硅胶G)用A、B、C 3种溶剂系统展开，1.65 mol/L H2SO4乙醇溶液均显蓝紫色单一斑点，Rf分别为0.30、0.31、0.35.碘化铋钾反应阳性；FeCl3反应：酸水解前阴性，酸水解后阳性；AgNO3反应阴性；BaCl2反应：水解前阴性；水解后阳性.提示该化合物可能为生物碱，结构中不具有游离酚羟基，不具有卤素离子.分子式C12H14N2O4S，EI-MS(m/e)M+282.UVλMeOHmax225.2 nm，292.0 nm(芳香环).IRνKBrmaxcm-13 225(仲胺NH)，3 025(=CH)，1 500(芳环骨架)，1 452(-CH2-)，1 360，1 350(CH3-N+-CH3)〔6〕，1 228，1 040(SO2)，815(芳环二邻位氢).1H-NMR(DMSO-d6，250 MHz)δ3.25(2H,t,J=5.4 Hz, 3-H)，3.72(6H,s,CH3-N+-CH3)，4.05(2H,t,J=5.4 Hz,4-H)，7.33(1H,S,2-H)，7.34(1H,d,J=8.7 Hz,8-H)，7.45(1H,d,J=8.7 Hz,7-H)，11.36(1H,bs,1-H).13C-NMR(DMSO-d6 250 MHz)δ16.38(C-3)，54.14(CH3-N+-CH3)，67.88(C-4)，104.66(C-1a)，113.62(C-2)，118.82(C-8)，120.37(C-2b)，122.06(C-7)，125.04(C-5a)，131.77(C-1a)，137.02(C-6)〔7〕.EI-MS(m/e)282(M+)，202(M-SO3)，188,173,159,94,79,64,47.13C-NMR给出12个碳信号，其中有2个磁全同碳(δ54.14)，8个芳香烯碳；1H-NMR给出14个氢，δ3.72有6个磁全同氢核(两个甲基)，低场区(δ>7.0)有3个芳香氢和1个活泼氢.IR有仲胺N-H伸缩振动和烯H-C伸缩振动吸收及芳环骨架振动；有(-SO2)伸缩振动，BaCl2反应示结构中有结合型磺酸基(-SO3)，EI-MS(m/e)202(282 -SO3).鉴定化合物Ⅳ为蟾蜍噻咛.
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化合物Ⅴ：黄色粉末(环己烷-丙酮重结晶)，mp>300℃.FeCl3反应阴性.分子式C12H10N4O2.EI-MS(m/e)242(M+).UVλMeOHmax216.2 nm，246.4，333.6，382.4 nm(示有共轭芳香系统).紫外光(254 nm)下具蓝色荧光.IRνKBrmaxcm-13 210(NH)，3 100(=CH)，2 960，1 380(-CH3)，1 730～1 690(C=O)，1 590，1 490(芳环骨架).1H-NMR(DMSO-d6)δ2.48(6H)，7.70(1H,S,6-H)，7.90(1H,S,9-H)，11.64(1H,S,1-NH)，11.81(1H,S,3-NH)，示有2个芳香氢和2个活泼氢.1H-NMR(C5D5N，90 MHz)δ2.05～2.10(6H,d.7,8-二甲基)，7.65(1H,S,6-H)，7.85(1H,S,9H)，11.64(1H,S,3-H)，11.81(1H,S,1-H).1H-NMR(C5D5N，90 MHz)有两组化学环境相近的甲基氢，这两组氢在以DMSO作溶剂时，与溶剂峰重叠，而改用氘代吡啶时则很好地呈现，δ值向高场位移0.3，此系溶剂效应所致〔8，9〕.13C-NMR(DMSO-d6)δ19.33(7-CH3),19.96(8-CH3),92.00(C-7),95.28(C-8),125.69(C-6),128.53(C-9)，138.28(C-4a),138.61(C-9a),141.52(C-5a),144.40(C-1a),149.73(C-2),160.28(C-4).化合物Ⅴ熔点、IR、UV、MS与光色素基本一致，鉴定为光色素.化学名为7,8-dimethylalloxazine.
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4 讨论
a.作者对中华大蟾蜍皮的化学成分进行了系统的研究.分离并鉴定了其中5个化合物，化合物Ⅳ，Ⅴ为首次从该属动物中得到.
b.反相制备高效液相层析在水溶性化合物的分离方面，显示了极大的优越性，不仅可以使结构很相近的化合物得以分离，而且速度快. 对于流动相的应用，作者采用了甲醇-水梯度洗脱方法，进一步提高了分离效率.
c.根据蟾蜍配基及蟾蜍毒素类化合物的核磁共振碳谱测定发现，可以根据C-20和C-23的化学位移来初步确定甾体母核上C-16的取代情况，结果见表1.
Tab.1 13CNMR chemical shifts(δ)of C-20，C-23 Substituent of
C-16/Chemical shifts
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C-20
C-23
Occupied
116.2～118.3
111.5～114.1
Non-occupied
122.5～124.5
113.7～115.3
参考文献
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, 百拇医药
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3，沈其丰.核磁共振碳谱.北京：北京大学出版社,1988.270～279
4，丛浦珠.质谱学在天然有机化学中的应用.北京：科学出版社,1987.805～810
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6，洪山海.光谱解析法在有机化学中的应用.北京：科学出版社,1980.23～28
7，于德泉.分析化学手册：第五分册.北京：化学工业出版社,1989.619～623
8，梁晓天.核磁共振.北京：科学出版社,1976.263
9，赵天增.核磁共振氢谱.北京：北京大学出版社,1983.151～155
收稿日期:2000-01-19
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单位：杨立宏 张薇(深圳市南山医药公司，深圳 518051)；金向群(吉林省中医中药研究院，长春 130021)
关键词：中华大蟾蜍；蟾蜍毒素；蟾蜍噻咛；光色素；化学位移
沈阳药科大学学报000421 摘 要 从中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)皮水溶性部分应用制备型反相HPLC分离得到5个化合物，根据光谱分析、氨基酸分析及化学性质，确定为蟾蜍灵3-丁二酰精氨酸酯(Ⅰ)、华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯(Ⅱ)、脂蟾毒配基3-丁二酰精氨酸酯(Ⅲ)、蟾蜍噻咛(Ⅳ)、光色素(Ⅴ)；其中Ⅳ、Ⅴ为首次从该属动物中得到；并提出了蟾蜍毒素和蟾毒配基在13C-NMR谱中C-16位取代情况的化学位移特征.
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Yang Lihong,Jin Xiangqun,Zhang Wei
(Shenzhen Nanshan Medicine Company,Shenzhen 518051)
Abstract Five compounds were isolated from the aqueous extract of the skin of Bufo bufo gargarizans Cantor by means of preparative reversed phase HPLC. On the basis of their spectral data(UV,IR,1H-NMR,13C-NMR,EI-MS and FD-MS),amino acid analyses and chemical properties, they were identified as bufalin 3-succinoylarginine ester(Ⅰ),cinobufagin 3-succinoylarginine ester(Ⅱ), resibufogenin 3-succinoylarginine ester(Ⅲ),bufothionine(Ⅳ),lumichrome(Ⅴ).It is for the first time that compounds Ⅳand Ⅴwere isolated from B. b. gargarizans Cantor.
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作者对中华大蟾蜍皮的化学成分进行了研究，从水溶性部分得到并鉴定了5个化合物，其结构见图1.
Fig.1 Chemical constituents from the skin of B.b gargarizans Cantor
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Yanoco MP-S3显微熔点测定仪(温度计未校正)；中低压液相色谱仪(YZS-3型-天津科学仪器公司)；中低压液相色谱仪(ALPC-100型-日本应用分光机械株式会社)；HPLC仪(分析用Shimadzu LC-6A、Hitachi 9A型；制备用LC-10型)；Shimadzu UV-260型紫外分光光度计；Perkin-Elmer 599B和983G型红外分光光度计；FX-60Q和Bruker AM-250，AM-500型核磁共振仪；Hitachi 835型氨基酸自动分析仪.
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中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)4 454只，冷冻处死，立即剥皮，用工业乙醇浸提.
2 提取与分离
蟾皮用工业乙醇30 kg 0～4℃冷浸4次，每次一个月，合并浸出液，回收乙醇，得乙醇粘稠液，先用乙醚-水萃取4次；再用乙酸乙酯-水萃取5次.上述残留水溶液50℃以下减压除去有机溶剂，加蒸馏水100 L稀释，流经Amberlite XAD-2大孔树脂，用蒸馏水20 L，12.06 mol/L甲醇1.5 L，17.32 mol/L甲醇5.0 L，19.18 mol/L甲醇5.0 L，22.28 mol/L甲醇5.0 L洗脱，再经硅胶柱层析，中低压液相层析(正相和反相)，HPLC分离及Sephadex LH-20纯化，得到化合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ.
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3 结构鉴定
化合物Ⅰ：无色无定形粉末(甲醇-乙醚重结晶)；mp 238～240℃；TLC(硅胶G)单一斑点，Rf 0.18，展开剂A，HPLC：单峰，tR 45.0 min，流动相MeOH-H2O(体积比10∶7)，二级管阵列检测纯度>95%.Liebermann-Burchard反应阳性；Sakaguchi试验阳性；茚三酮试验阴性；提示为甾类化合物，结构中含精氨酸，其α-氨基不游离，盐酸水解后氨基酸自动分析仪测定含有精氨酸；盐酸水解反应薄层层析示含蟾毒灵和丁二酸.分子式C34H50O8N4，FD-MS(m/e)M+642.UVλMeOHmax297.8 nm(α-吡喃酮环).IRνKBrmaxcm-13 600～3 200(OH，NH)，1 158(OH)，2 930，1 350(-CH3)，2 870，1 445(-CH2-)，1 760～1 715(酯及内酯-C=O)，1 600，1 545(酰胺-C=O，α-吡喃酮共轭-C=O).1H-NMR(DMS O-d6)δ0.60(3H，s，18-CH3)，0.90(3H，S，19-CH3)，2.42(4H，m，-COCH2CH2CO-)，4.95(1H，bs，3α-H)，6.26(1H，d，J=9.6 Hz，23H)，7.49(1H，S，21-H)，7.93(1H，q，J=9.6,1.7 Hz，22-H).13C-NMR(DMSO-d6)δ16.41(C-18)，23.34(C-19)，53.30(Arg-CH)，69.71(C-3)，83.27(C-14)，113.92(C-23)，122.51(C-20)，147.14(C-21)，148.94(C-22)，157.22(Arg -C=NH)，161.02(C-24)，169.43( CONH-)，171.36(COO-)，175.28(-COOH).FD-MS(m/e)644(M+2H)；513.EI-MS(m/e)386(bufalin)，350(386-2H2O)，162，91，41.IR表明分子中具有酯羰基及共轭双健伸缩振动吸收峰，1H-NMR及13C-NMR证明分子中含α-吡喃酮环以及丁二酰基(-COCH2CH2CO-).上述分析表明化合物Ⅰ含有下列结构单元：蟾毒灵；(-COCH2CH2CO-)；精氨酸.13C-NMR中，C-3向低场位移约δ4，而C-14基本未变，因此，成酯应在C-3位上，茚三酮反应提示精氨酸α-氨基不游离，IR显示有酰胺吸收带，其酰胺应由精氨酸α-氨基提供氨基部分.化合物Ⅰ1H-NMR、熔点及分子量与蟾毒灵3-丁二酰精氨酸酯〔1〕一致；13C-NMR与蟾毒灵〔2〕和精氨酸〔3〕一致.鉴定化合物Ⅰ为蟾毒灵3-丁二酰精氨酸酯.
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化合物Ⅱ：无色无定形粉末(甲醇-乙醚重结晶)；mp 200～202℃；TLC(硅胶G)单一斑点，Rf 0.18，展开剂A，HPLC：单峰，tR 32.5 min，流动相MeOH-H2O(体积比10∶7)，二级管阵列检测纯度>95%.Liebermann-Burchard反应阳性；Sakaguchi试验阳性；茚三酮试验阴性.盐酸水解经氨基酸自动分析仪测定含精氨酸；盐酸水解反应薄层层析示含华蟾毒精和丁二酸.分子式C36H50O10N4，FD-MS(m/e)M+698.UVλMeOHmax294.2 nm(α-吡喃酮环).IRνKBrmaxcm-13 380，1 140(OH)，3 200(NH)，2 950，1 380(-CH3)，1 730～1 690(酯，羧酸 C=O)，1 640，1 550(酰胺 -C=O，α-吡喃酮环共轭 -C=O)，1 250(乙酰基 C-O).1H-NMR(CD3 OD)δ0.82(3H，S，18-CH3)，1.01(3H，S，19-CH3)，1.87(3H，S，16β-OCOCH3)，2.60(4H，m，COCH2CH2CO)，2.91(1H，d，J=9.3 Hz,17α-H)，3.73(1H，S，15α-H)，4.27(Arg-CH)，5.07(1H，bs，3α-H)，5.48(1H，d，J=9.3 Hz,16α-H)，6.23(1H，d，J=9.7 Hz,23-H)，7.36(1H，S，21-H)，8.00(1H，bd，22-H).13C-NMR(CD3OD)δ17.50(C-18)，20.35(-OCOCH3)，22.12(C-19)，40.42(C-9)，40.68(C-12)，46.37(C-13)，51.52(C-17)，55.22(Arg-CH)，60.61(C-15)，72.36(C-3)，73.42(C-14)，76.62(C-16)，114.10(C-23)，118.31(C-20)，150.76(C-21)，153.51(C-22)，158.60(Arg-C=NH)，163.92(C-24)，171.60(C=O，16 β-OAC)，173.46(CONH-)，173.81(COO-)，177.93(-COOH).FD-MS(m/e)699(M++H)，655(M-COCH3).EI-MS(m/e)442(cinobufagin)，399(442-COCH3)，233，215，43(+COCH3).据IR、UV、1H-NMR及13C-NMR推测该化合物为蟾毒素类化合物. 盐酸水解反应薄层层析示含有华蟾毒精；EI-MS(m/e)有442碎片与华蟾毒精分子量(442)一致；215，233示C14和C15具有三元氧环结构.氨基酸分析及13C-NMR证实分子中含精氨酸.FD-MS(m/e)699(M++1).13C-NMR给出了36个碳信号，并证实成酯在C-3位上，IR及茚三酮反应证实分子中所形成的酰胺结构由精氨酸提供α-氨基.1H-NMR和盐酸水解反应薄层层析证实有-CO(CH2)2CO-存在. 化合物Ⅱ1H-NMR、熔点及分子量与华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯〔1〕一致. EI-MS与13C-NMR分别与文献〔3，4〕中的华蟾毒精和精氨酸一致，鉴定化合物Ⅱ 为华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯.
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化合物Ⅲ：无色无定形粉末(甲醇-乙醚重结晶)；mp 209～211℃；TLC(硅胶G)单一斑点，Rf 0.18，展开剂A，HPLC：单峰，tR 38.0 min，流动相MeOH-H2O(体积比10∶7)，二级管阵列检测纯度>95%.Liebermann-Burchard反应阳性；Sakaguchi试验阳性；茚三酮试验阴性.盐酸水解后经氨基酸自动分析仪测定含精氨酸；盐酸水解反应薄层层析示含华蟾毒精和丁二酸.分子式C34H48O8N4，FD-MS(m/e)M+640.UVλMeOHmax296.2 nm(α-吡喃酮环).IRνKBrmaxcm-13 400～3 200(OH，NH)，2 940，1 380(-CH3)，2 870，1 450(-CH2)，1 735～1 690(酯，羧酸C=O)，1 660，1 560(酰胺C=O)，1 630，1 538(α-吡喃酮环共轭 C=C )，1 210，1 185(环氧C-O)，955(C-C)，830(环氧C-O)〔5〕.1H-NMR(CD3 OD)δ0.82(3H，S，18-CH3)，1.05(3H，S，19-CH3)，2.65(4H，m，-COCH2CH2CO-)，3.65(1H，S，15α-H)；4.32(1H，m，Arg-CH)；5.11(1H，d，J=2.6 Hz,3α-H)，6.30(1H，d，J=9.8 Hz,23-H)，7.49(1H，d，J=2.6 Hz,21-H)，7.93(1H，q，J=9.8,2.6 Hz,22-H).13C-NMR(CD3OD)δ17.10(C-18)，20.26(C-19)，46.37(C-13)，49.84(C-17)，55.29(Arg-CH)，61.18(C-15)，72.42(C-3)，75.81(C-14)，115.35(C-23)，124.50(C-20)，149.48(C-21)，151.77(C-22)，158.74(Arg-C=NH)，164.39(C-24)，169.16(CONH)，173.62(COO-)，173.86(-COOH ).由上述分析推断该化合物为蟾蜍毒素类. 盐酸水解反应薄层层析和EI-MS证实有脂蟾毒配基和丁二酸，FD-MS(m/e)641(M++H)；13C-NMR给出34个碳信号，并证明在C3位上成酯、IR及茚三酮反应证实分子中酰胺由精氨酸提供α-氨基.1H-NMR和盐酸水解反应薄层层析证实有 -CO(CH2)2CO-存在.化合物Ⅲ熔点及光谱与文献〔1，3，4〕所记载脂蟾毒配基3-丁二酰精氨酸酯，脂蟾毒配基，精氨酸数据相符，鉴定为脂蟾毒配基3-丁二酰精氨酸酯.
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化合物Ⅳ：无色针晶(CHCl3-MeOH-H2O重结晶)，mp 250～252℃(分解有异臭)；TLC(硅胶G)用A、B、C 3种溶剂系统展开，1.65 mol/L H2SO4乙醇溶液均显蓝紫色单一斑点，Rf分别为0.30、0.31、0.35.碘化铋钾反应阳性；FeCl3反应：酸水解前阴性，酸水解后阳性；AgNO3反应阴性；BaCl2反应：水解前阴性；水解后阳性.提示该化合物可能为生物碱，结构中不具有游离酚羟基，不具有卤素离子.分子式C12H14N2O4S，EI-MS(m/e)M+282.UVλMeOHmax225.2 nm，292.0 nm(芳香环).IRνKBrmaxcm-13 225(仲胺NH)，3 025(=CH)，1 500(芳环骨架)，1 452(-CH2-)，1 360，1 350(CH3-N+-CH3)〔6〕，1 228，1 040(SO2)，815(芳环二邻位氢).1H-NMR(DMSO-d6，250 MHz)δ3.25(2H,t,J=5.4 Hz, 3-H)，3.72(6H,s,CH3-N+-CH3)，4.05(2H,t,J=5.4 Hz,4-H)，7.33(1H,S,2-H)，7.34(1H,d,J=8.7 Hz,8-H)，7.45(1H,d,J=8.7 Hz,7-H)，11.36(1H,bs,1-H).13C-NMR(DMSO-d6 250 MHz)δ16.38(C-3)，54.14(CH3-N+-CH3)，67.88(C-4)，104.66(C-1a)，113.62(C-2)，118.82(C-8)，120.37(C-2b)，122.06(C-7)，125.04(C-5a)，131.77(C-1a)，137.02(C-6)〔7〕.EI-MS(m/e)282(M+)，202(M-SO3)，188,173,159,94,79,64,47.13C-NMR给出12个碳信号，其中有2个磁全同碳(δ54.14)，8个芳香烯碳；1H-NMR给出14个氢，δ3.72有6个磁全同氢核(两个甲基)，低场区(δ>7.0)有3个芳香氢和1个活泼氢.IR有仲胺N-H伸缩振动和烯H-C伸缩振动吸收及芳环骨架振动；有(-SO2)伸缩振动，BaCl2反应示结构中有结合型磺酸基(-SO3)，EI-MS(m/e)202(282 -SO3).鉴定化合物Ⅳ为蟾蜍噻咛.
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化合物Ⅴ：黄色粉末(环己烷-丙酮重结晶)，mp>300℃.FeCl3反应阴性.分子式C12H10N4O2.EI-MS(m/e)242(M+).UVλMeOHmax216.2 nm，246.4，333.6，382.4 nm(示有共轭芳香系统).紫外光(254 nm)下具蓝色荧光.IRνKBrmaxcm-13 210(NH)，3 100(=CH)，2 960，1 380(-CH3)，1 730～1 690(C=O)，1 590，1 490(芳环骨架).1H-NMR(DMSO-d6)δ2.48(6H)，7.70(1H,S,6-H)，7.90(1H,S,9-H)，11.64(1H,S,1-NH)，11.81(1H,S,3-NH)，示有2个芳香氢和2个活泼氢.1H-NMR(C5D5N，90 MHz)δ2.05～2.10(6H,d.7,8-二甲基)，7.65(1H,S,6-H)，7.85(1H,S,9H)，11.64(1H,S,3-H)，11.81(1H,S,1-H).1H-NMR(C5D5N，90 MHz)有两组化学环境相近的甲基氢，这两组氢在以DMSO作溶剂时，与溶剂峰重叠，而改用氘代吡啶时则很好地呈现，δ值向高场位移0.3，此系溶剂效应所致〔8，9〕.13C-NMR(DMSO-d6)δ19.33(7-CH3),19.96(8-CH3),92.00(C-7),95.28(C-8),125.69(C-6),128.53(C-9)，138.28(C-4a),138.61(C-9a),141.52(C-5a),144.40(C-1a),149.73(C-2),160.28(C-4).化合物Ⅴ熔点、IR、UV、MS与光色素基本一致，鉴定为光色素.化学名为7,8-dimethylalloxazine.
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4 讨论
a.作者对中华大蟾蜍皮的化学成分进行了系统的研究.分离并鉴定了其中5个化合物，化合物Ⅳ，Ⅴ为首次从该属动物中得到.
b.反相制备高效液相层析在水溶性化合物的分离方面，显示了极大的优越性，不仅可以使结构很相近的化合物得以分离，而且速度快. 对于流动相的应用，作者采用了甲醇-水梯度洗脱方法，进一步提高了分离效率.
c.根据蟾蜍配基及蟾蜍毒素类化合物的核磁共振碳谱测定发现，可以根据C-20和C-23的化学位移来初步确定甾体母核上C-16的取代情况，结果见表1.
Tab.1 13CNMR chemical shifts(δ)of C-20，C-23 Substituent of
C-16/Chemical shifts
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C-20
C-23
Occupied
116.2～118.3
111.5～114.1
Non-occupied
122.5～124.5
113.7～115.3
参考文献
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收稿日期:2000-01-19
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