龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究
作者：郭美锦 涂国全 曹秀香
单位：江西农业大学生物技术研究开发中心，南昌 330045
关键词：龟裂链霉菌；原生质体；定向推理诱变；土霉素
中国抗生素杂志000405 摘要：采用定向推理筛选方法对龟裂链霉菌原生质体进行诱变筛选得到346#菌株，其复筛时比对照产量高7%，而在60吨大罐上连续发酵9批，发酵指数比对照高了13%。
中图分类号：Q933 文献标识码：A
文章编号：1001-8689(2000)04-0260-03
Studies on mutation and selection of protoplasts
, http://www.100md.com
from Streptomyces rimosus
Guo Mei-jin， Tu Guo-quan and Cao Xiu-xiang
(Research & Development Center for Biotechnology,Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045)
ABSTRACT Strain 346# was obtained from S.rimosus protoplast mutants by the target-directed rational selection. Its yield is 7% higher than CK' in the re-selection experiment, whereas its fermentation index of continuous nine batches in 60T fermentor has been increased by 13%.
, 百拇医药
KEY WORDS Streptomyces rimosus； Protoplast； Targe-directed rational mutation； Oxytetracycline
经典的诱变育种是菌种选育的基础方法，但其具有盲目性和随机性。利用推理选育，可定向地选出某些类型的突变株，从而筛选出高产菌株。袁丽蓉[1]、范铭琦等[2]用这种方法选育菌种取得了较好的效果。龟裂链霉菌发酵生产土霉素时，土霉素分泌到菌丝体外，当发酵液中土霉素达到一定浓度后因菌丝体自我调控而使效价难以提高，为此，采用诱变剂通过筛选耐高浓度的土霉素的菌株作为解除选育终产物的抑制的定向推理，获得了高产菌株346#，现报道该研究结果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌 Streptomyces rimosus(16-5#)由江西洪城制药厂提供。
, http://www.100md.com
1.1.2 培养基 S生长培养基[3]；R5再生培养基[3]。
斜面麸皮培养基(%)：麸皮7.5，琼脂2.2。
初筛摇瓶培养基(%)：玉米淀粉7，酵母粉3，黄豆粉6，CaCO3 1.4，NaCl 0.4，KH2PO4 0.15。
分离培养基、复筛摇瓶培养基及大罐发酵试验培养基与生产厂相同。
1.1.3 溶液 pH6.0，磷酸缓冲液；P溶液[4]，NTG诱变液[5]。
1.1.4 试剂及有关药品 TES：Merck公司产品(批号140 F265495)；NTG：Oxoid公司；溶菌酶：Sigma公司生产(进口分装)；土霉素标品(OTC)：卫生部药品司提供；硫酸链霉素(SM)：上海市第四制药厂生产(批号960630-2)；硫酸卡那霉素(KM)：湖南岳阳制药二厂生产(批号950624)；甘氨酸(Glycine)(B.R级)：中国科学院上海生化所生产(批号960826)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 龟裂链霉菌原生质体制备方法[6]
1.2.2 原生质体NTG诱变和抗药性突变株检测 将制备好的16-5#菌株原生质体5ml置于含有NTG(2mg/L)的5ml P溶液的100ml三角瓶中，30℃，220r/min摇瓶机上诱变处理30min，诱变原生质体液经P液适当稀释，各吸0.1ml原生质体诱变稀释液分别涂布于含有致死浓度抗生素的R5再生培养基上，34℃培养5～7d，分别计算再生菌落数。
同时各吸0.1ml未诱变处理的原生质体稀释液分别涂布在未含药物的R5再生培养基上和分别含OTC、LiCl和KM的R5再生培养基上以分别作为CK1，CK2，CK3和CK4。
, http://www.100md.com
1.2.3 自然分离选育方法[7]
1.2.4 筛选方法 初筛为一级摇瓶筛选，复筛为二级摇瓶筛选。
1.2.5 代谢试验方法 复筛方法，每隔12h取二瓶发酵液测定其总糖、氨基氮、溶磷、pH、效价。
1.2.6 大罐试验方法 采用三级发酵法。
1.2.7 测定方法 初筛化学效价为改良法即反应体系中0.27mol/L HCl为4.9ml，吸样0.1ml，加显色液0.5% FeCl3 5ml混匀，在室温下反应20min后于波长500nm比色。复筛化学效价为化学比色法。
总糖 斐林氏法；NH+4-N 甲醛滴定法；溶磷 钼兰比色法；组分测定HPLC法。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 16-5#菌株原生质体诱变和抗药性突变株检测
16-5#菌株原生质体的诱变和抗药性突变株的检测结果见表1。16-5#原生质体经NTG处理后分别在OTC(2500mg/L)，LiCl(6000mg/L)，OTC(2500 mg/L)+LiCl(6000mg/L)和KM(120mg/L)平板上抗药突变率依次为0.008%、0.0011%、0.00033%和0.0006%。
表1 NTG诱变16-5#原生质体诱变效果 试验处理
药物浓度
(mg/L)
再生菌落数
, 百拇医药
(个/ml)
抗药突变率
(%)
未经NTG处
CK1
6.3×106
0
理原生质体
CK2
0
0
(OTC 2500)
, 百拇医药
CK3
0
0
(LiCl 6000)
CK4
0
0
(KM 120)
NTG处理原
OTC(2500)
51
0.0008
, 百拇医药
生质体
LiCl(6000)
69
0.0011
OTC(2500)+
21
0.00033
LiCl(6000)
KM(120)
42
0.0006
2.2 高产菌株摇瓶筛选结果
, 百拇医药
2.2.1 16-5#菌株原生质体诱变突变株初筛结果 以对照菌株平均产量为100%，初筛分析统计结果见表2。16-5#原生质体对OTC、LiCl、LiCl+OTC、KM抗药性突变株其产抗生素能力正突变频率较大(80%以上)，根据初筛结果相对产量在120%以上作为初筛入选标准。表2 16-5#菌株原生质体不同诱变剂处理抗药性突变株摇瓶初筛统计结果 相对产量
组距
90%以下
90%～100%
100%～110%
110%～120%
120%～130%
, 百拇医药
130%～140%
140%以上
总计
平均
产量
(X)
标准
方差
(S)
16-5#自然分离
菌株数
6
26
, 百拇医药
42
74
100.0
10.42
分布频率
8.11
35.14
56.75
原生质体
再生
菌株数
4
8
, 百拇医药
18
18
12
60
129.9
11.74
分布频率
6.67
13.33
30
30
20
100
, http://www.100md.com
P165-OTC
菌株数
2
0
2
12
24
8
48
131.5
11.32
分布频率
4.17
, http://www.100md.com
0
4.17
25
50
16.7
100
P165-LiCl
菌株数
4
2
6
18
8
, 百拇医药
8
4
50
116.9
19.92
分布频率
8
4
12
36
16
16
8
100
, 百拇医药
P165-OTC-LiCl
菌株数
2
4
6
12
6
30
120.9
11.16
分布频率
6.67
13.33
, 百拇医药
20
40
20
100
PKM
菌株数
2
2
6
8
6
6
30
, 百拇医药 127.9
18.15
分布频率
6.66
6.67
20
26.67
20
20
100
总计
菌株数
10
, 百拇医药
34
58
40
58
62
30
292
2.2.2 高产菌株的摇瓶复筛结果 初筛入选菌株进行二级摇瓶复筛，试验结果进行方差分析(见表3)可知：各菌株之间与对照相比差异显著。筛选得到P165-48、P165-OTC-13、P165-KM-10、NTGO-8 4菌株分别比对照的产抗生素水平提高了19%、19%、17%和16%(数据未列)。表3 高产菌株摇瓶产量方差分析表 变异
来源
, 百拇医药
自由度
DF
平方和
SS
均方
MS
F值
F.05(13，28)
F.01(13，28)
处理
13
47081
, 百拇医药 3621.6
54.49**
2.09
2.85
误差
28
1861
66.5
总和
41
48942
2.2.3 高产菌株稳定性试验和产量分布参数评价 根据刘垂于研究文献[8]认为优良的生产菌株应具有高产、稳产、不易蜕变的特征，用产势A=x(Ct/6)(1/6)(1+Cs/8)(1/2)的数值来评价生产菌株，产势A愈大，菌株愈优。由表4参数分析可知：P165-OXY-13，P165-KM-10和P165-OTC-8 3个高产菌株自然分离菌株的产势A值分别比对照16-5#菌株提高了29.72%、26.1%和19.98%，说明这3个菌株均具有比对照菌株更高的产抗生素潜力。
, 百拇医药
通过诱变突变菌株产势参数分析，以比对照提高15%为入选标准，从P165-OTC-8的自然分离株中进行复筛得到346#菌株，3次复筛平均摇瓶产量分别比对照提高了8.1%、7.3%和7.0%，因此，346#菌株比较稳定，且产量比对照平均提高了7%。表4 高产菌株产势参数分析 菌株
参数
NTGO-8
P165-OXY-13
P165-KM-10
16-5(Ck)
n
67
48
, http://www.100md.com
89
37
x
99.07
98.77
101.37
100
S
7.00
5.44
5.79
10.27
Ct
, http://www.100md.com
14.14
18.18
17.52
9.61
Cs
-0.38
0.31
-0.46
-2.13
A
111.54
121.28
117.66
, http://www.100md.com
91.56
X：相对产量的平均值；S：相对产量的标准差；Ct：产量分布的稳度(X/S)；Cs：产量的偏度Σ(Xi-
i)3/n/S3； 产势A=x(Ct/6)(1/6)(1+Cs/8)(1/2)
2.3 346#菌株传代试验结果
346#连续六代摇瓶发酵各代产量经方差分析它们之间无显著差异，说明346#菌株有较稳定的产抗生素遗传特性。但从试验结果看，346#一至三代产量明显高于四、五、六代菌种，因此最好用前三代菌种进行发酵。
2.4 高产菌株摇瓶发酵代谢试验结果
, 百拇医药
从346#和16-5#代谢曲线看，346#起步产量比对照低3.62%，这可能主要是其糖代谢速率较慢造成的，30h后糖耗加快，效价同时提高加快，最终放瓶产量比对照高7%左右。
2.5 346#菌株大罐发酵结果
346#菌株大罐试验连续发酵9罐批(以16-5#为对照发酵)，其平均放罐总亿和发酵指数比16-5#平均放罐总亿和平均发酵指数均提高了13%以上。按1993年英国药典HPLC条件，以甲醇为流动相测定试验产品，对照产品和OTC标品组分，其主要组分完全一致。
3 结论与讨论
通过对16-5#菌株的原生质体进行强诱变剂诱变和复合诱变处理得到了高产抗生素的346#菌株，其连续9批60T大罐发酵指数比对照提高了13%。抗生素产生菌的抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁，当抗药性基因发生突变时，其抗生素合成的相关基因也相应发生突变。因此，这种抗药性突变标记的推理性筛选土霉素高产菌株效率高且行之有效。
, http://www.100md.com
致谢：本试验得到本研究室叶亚建高级实验师，龚霞实习研究员和张宝实习研究员的有益帮助。在大罐发酵期间得到江西洪城制药厂刘琪厂长和李本堂总工的大力帮助，特此向他们表示衷心的感谢。同时，本文得到华东理工大学生物化工研究所储炬博士的指正，特此谢忱!
作者简介：郭美锦：男，生于1969年，华东理工大学在读博士生，助理研究员。
参考文献
[1] 袁丽容，吴立奋，潘家林，等. 头孢霉素C产生菌顶头孢霉理性化筛选研究[J]. 中国抗生素杂志，1988；13(4)：262
[2] 范铭琦，赵敏，卜华祥，等. 庆大霉素C1a高产菌株的推理育种研究[J]. 中国抗生素杂志，1998；23(6)：410
[3] Hopwood D A, Wright H M. Factors affecting recombinant frequency in protoplast fusion of Streptomyces coelicolor [J]. J Gen Microbiol，1979；111：137
, 百拇医药
[4] Okanishi M, Suzuki K, Elander P. Formation and reversion of Streptomycete Protoplasts: cultural conditions and morphological study [J]. J Gen Microbiol，1974；80：389
[5] 罗鹏主编. 遗传学应用[M]. 北京：高等教育出版社1994：231
[6] 郭美锦，涂国全. 龟裂链霉菌原生质体制备与再生条件研究[J]. 江西农业大学学报，1999；20(3)：233
[7] 吴松刚，等主编. 工业微生物育种学[J]. 福州：福建科学技术出版社，1988：278
[8] 刘垂于. 微生物菌株的参数分析[J]. 微生物学报，1980；20(2)：166
收稿日期：1999-07-22, 百拇医药
单位：江西农业大学生物技术研究开发中心，南昌 330045
关键词：龟裂链霉菌；原生质体；定向推理诱变；土霉素
中国抗生素杂志000405 摘要：采用定向推理筛选方法对龟裂链霉菌原生质体进行诱变筛选得到346#菌株，其复筛时比对照产量高7%，而在60吨大罐上连续发酵9批，发酵指数比对照高了13%。
中图分类号：Q933 文献标识码：A
文章编号：1001-8689(2000)04-0260-03
Studies on mutation and selection of protoplasts
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from Streptomyces rimosus
Guo Mei-jin， Tu Guo-quan and Cao Xiu-xiang
(Research & Development Center for Biotechnology,Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045)
ABSTRACT Strain 346# was obtained from S.rimosus protoplast mutants by the target-directed rational selection. Its yield is 7% higher than CK' in the re-selection experiment, whereas its fermentation index of continuous nine batches in 60T fermentor has been increased by 13%.
, 百拇医药
KEY WORDS Streptomyces rimosus； Protoplast； Targe-directed rational mutation； Oxytetracycline
经典的诱变育种是菌种选育的基础方法，但其具有盲目性和随机性。利用推理选育，可定向地选出某些类型的突变株，从而筛选出高产菌株。袁丽蓉[1]、范铭琦等[2]用这种方法选育菌种取得了较好的效果。龟裂链霉菌发酵生产土霉素时，土霉素分泌到菌丝体外，当发酵液中土霉素达到一定浓度后因菌丝体自我调控而使效价难以提高，为此，采用诱变剂通过筛选耐高浓度的土霉素的菌株作为解除选育终产物的抑制的定向推理，获得了高产菌株346#，现报道该研究结果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌 Streptomyces rimosus(16-5#)由江西洪城制药厂提供。
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1.1.2 培养基 S生长培养基[3]；R5再生培养基[3]。
斜面麸皮培养基(%)：麸皮7.5，琼脂2.2。
初筛摇瓶培养基(%)：玉米淀粉7，酵母粉3，黄豆粉6，CaCO3 1.4，NaCl 0.4，KH2PO4 0.15。
分离培养基、复筛摇瓶培养基及大罐发酵试验培养基与生产厂相同。
1.1.3 溶液 pH6.0，磷酸缓冲液；P溶液[4]，NTG诱变液[5]。
1.1.4 试剂及有关药品 TES：Merck公司产品(批号140 F265495)；NTG：Oxoid公司；溶菌酶：Sigma公司生产(进口分装)；土霉素标品(OTC)：卫生部药品司提供；硫酸链霉素(SM)：上海市第四制药厂生产(批号960630-2)；硫酸卡那霉素(KM)：湖南岳阳制药二厂生产(批号950624)；甘氨酸(Glycine)(B.R级)：中国科学院上海生化所生产(批号960826)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 龟裂链霉菌原生质体制备方法[6]
1.2.2 原生质体NTG诱变和抗药性突变株检测 将制备好的16-5#菌株原生质体5ml置于含有NTG(2mg/L)的5ml P溶液的100ml三角瓶中，30℃，220r/min摇瓶机上诱变处理30min，诱变原生质体液经P液适当稀释，各吸0.1ml原生质体诱变稀释液分别涂布于含有致死浓度抗生素的R5再生培养基上，34℃培养5～7d，分别计算再生菌落数。
同时各吸0.1ml未诱变处理的原生质体稀释液分别涂布在未含药物的R5再生培养基上和分别含OTC、LiCl和KM的R5再生培养基上以分别作为CK1，CK2，CK3和CK4。
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1.2.3 自然分离选育方法[7]
1.2.4 筛选方法 初筛为一级摇瓶筛选，复筛为二级摇瓶筛选。
1.2.5 代谢试验方法 复筛方法，每隔12h取二瓶发酵液测定其总糖、氨基氮、溶磷、pH、效价。
1.2.6 大罐试验方法 采用三级发酵法。
1.2.7 测定方法 初筛化学效价为改良法即反应体系中0.27mol/L HCl为4.9ml，吸样0.1ml，加显色液0.5% FeCl3 5ml混匀，在室温下反应20min后于波长500nm比色。复筛化学效价为化学比色法。
总糖 斐林氏法；NH+4-N 甲醛滴定法；溶磷 钼兰比色法；组分测定HPLC法。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 16-5#菌株原生质体诱变和抗药性突变株检测
16-5#菌株原生质体的诱变和抗药性突变株的检测结果见表1。16-5#原生质体经NTG处理后分别在OTC(2500mg/L)，LiCl(6000mg/L)，OTC(2500 mg/L)+LiCl(6000mg/L)和KM(120mg/L)平板上抗药突变率依次为0.008%、0.0011%、0.00033%和0.0006%。
表1 NTG诱变16-5#原生质体诱变效果 试验处理
药物浓度
(mg/L)
再生菌落数
, 百拇医药
(个/ml)
抗药突变率
(%)
未经NTG处
CK1
6.3×106
0
理原生质体
CK2
0
0
(OTC 2500)
, 百拇医药
CK3
0
0
(LiCl 6000)
CK4
0
0
(KM 120)
NTG处理原
OTC(2500)
51
0.0008
, 百拇医药
生质体
LiCl(6000)
69
0.0011
OTC(2500)+
21
0.00033
LiCl(6000)
KM(120)
42
0.0006
2.2 高产菌株摇瓶筛选结果
, 百拇医药
2.2.1 16-5#菌株原生质体诱变突变株初筛结果 以对照菌株平均产量为100%，初筛分析统计结果见表2。16-5#原生质体对OTC、LiCl、LiCl+OTC、KM抗药性突变株其产抗生素能力正突变频率较大(80%以上)，根据初筛结果相对产量在120%以上作为初筛入选标准。表2 16-5#菌株原生质体不同诱变剂处理抗药性突变株摇瓶初筛统计结果 相对产量
组距
90%以下
90%～100%
100%～110%
110%～120%
120%～130%
, 百拇医药
130%～140%
140%以上
总计
平均
产量
(X)
标准
方差
(S)
16-5#自然分离
菌株数
6
26
, 百拇医药
42
74
100.0
10.42
分布频率
8.11
35.14
56.75
原生质体
再生
菌株数
4
8
, 百拇医药
18
18
12
60
129.9
11.74
分布频率
6.67
13.33
30
30
20
100
, http://www.100md.com
P165-OTC
菌株数
2
0
2
12
24
8
48
131.5
11.32
分布频率
4.17
, http://www.100md.com
0
4.17
25
50
16.7
100
P165-LiCl
菌株数
4
2
6
18
8
, 百拇医药
8
4
50
116.9
19.92
分布频率
8
4
12
36
16
16
8
100
, 百拇医药
P165-OTC-LiCl
菌株数
2
4
6
12
6
30
120.9
11.16
分布频率
6.67
13.33
, 百拇医药
20
40
20
100
PKM
菌株数
2
2
6
8
6
6
30
, 百拇医药 127.9
18.15
分布频率
6.66
6.67
20
26.67
20
20
100
总计
菌株数
10
, 百拇医药
34
58
40
58
62
30
292
2.2.2 高产菌株的摇瓶复筛结果 初筛入选菌株进行二级摇瓶复筛，试验结果进行方差分析(见表3)可知：各菌株之间与对照相比差异显著。筛选得到P165-48、P165-OTC-13、P165-KM-10、NTGO-8 4菌株分别比对照的产抗生素水平提高了19%、19%、17%和16%(数据未列)。表3 高产菌株摇瓶产量方差分析表 变异
来源
, 百拇医药
自由度
DF
平方和
SS
均方
MS
F值
F.05(13，28)
F.01(13，28)
处理
13
47081
, 百拇医药 3621.6
54.49**
2.09
2.85
误差
28
1861
66.5
总和
41
48942
2.2.3 高产菌株稳定性试验和产量分布参数评价 根据刘垂于研究文献[8]认为优良的生产菌株应具有高产、稳产、不易蜕变的特征，用产势A=x(Ct/6)(1/6)(1+Cs/8)(1/2)的数值来评价生产菌株，产势A愈大，菌株愈优。由表4参数分析可知：P165-OXY-13，P165-KM-10和P165-OTC-8 3个高产菌株自然分离菌株的产势A值分别比对照16-5#菌株提高了29.72%、26.1%和19.98%，说明这3个菌株均具有比对照菌株更高的产抗生素潜力。
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通过诱变突变菌株产势参数分析，以比对照提高15%为入选标准，从P165-OTC-8的自然分离株中进行复筛得到346#菌株，3次复筛平均摇瓶产量分别比对照提高了8.1%、7.3%和7.0%，因此，346#菌株比较稳定，且产量比对照平均提高了7%。表4 高产菌株产势参数分析 菌株
参数
NTGO-8
P165-OXY-13
P165-KM-10
16-5(Ck)
n
67
48
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89
37
x
99.07
98.77
101.37
100
S
7.00
5.44
5.79
10.27
Ct
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14.14
18.18
17.52
9.61
Cs
-0.38
0.31
-0.46
-2.13
A
111.54
121.28
117.66
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91.56
X：相对产量的平均值；S：相对产量的标准差；Ct：产量分布的稳度(X/S)；Cs：产量的偏度Σ(Xi-
i)3/n/S3； 产势A=x(Ct/6)(1/6)(1+Cs/8)(1/2)2.3 346#菌株传代试验结果
346#连续六代摇瓶发酵各代产量经方差分析它们之间无显著差异，说明346#菌株有较稳定的产抗生素遗传特性。但从试验结果看，346#一至三代产量明显高于四、五、六代菌种，因此最好用前三代菌种进行发酵。
2.4 高产菌株摇瓶发酵代谢试验结果
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从346#和16-5#代谢曲线看，346#起步产量比对照低3.62%，这可能主要是其糖代谢速率较慢造成的，30h后糖耗加快，效价同时提高加快，最终放瓶产量比对照高7%左右。
2.5 346#菌株大罐发酵结果
346#菌株大罐试验连续发酵9罐批(以16-5#为对照发酵)，其平均放罐总亿和发酵指数比16-5#平均放罐总亿和平均发酵指数均提高了13%以上。按1993年英国药典HPLC条件，以甲醇为流动相测定试验产品，对照产品和OTC标品组分，其主要组分完全一致。
3 结论与讨论
通过对16-5#菌株的原生质体进行强诱变剂诱变和复合诱变处理得到了高产抗生素的346#菌株，其连续9批60T大罐发酵指数比对照提高了13%。抗生素产生菌的抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁，当抗药性基因发生突变时，其抗生素合成的相关基因也相应发生突变。因此，这种抗药性突变标记的推理性筛选土霉素高产菌株效率高且行之有效。
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致谢：本试验得到本研究室叶亚建高级实验师，龚霞实习研究员和张宝实习研究员的有益帮助。在大罐发酵期间得到江西洪城制药厂刘琪厂长和李本堂总工的大力帮助，特此向他们表示衷心的感谢。同时，本文得到华东理工大学生物化工研究所储炬博士的指正，特此谢忱!
作者简介：郭美锦：男，生于1969年，华东理工大学在读博士生，助理研究员。
参考文献
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[8] 刘垂于. 微生物菌株的参数分析[J]. 微生物学报，1980；20(2)：166
收稿日期：1999-07-22, 百拇医药