低聚氨基葡萄糖的吸湿、保湿和抑菌性质
作者：邵健 杨宇民 姚成
单位：邵健 杨宇民(江苏南通医学院化学教研究室，南通 226001)；姚成(南京化工大学应化系,南京 210009)
关键词：低聚氨基葡萄糖，吸湿性，保湿性，抑菌作用
中国海洋药物000407 摘要 采用双氧水在中性条件下对壳聚糖进行氧化降解，制备了低聚氨基葡萄糖。研究了它的吸湿性、保湿性及抗菌性能。结果表明，低聚氨基葡萄糖具有优良的水溶性、吸湿性、保湿性，并对大肠杆菌和绿脓杆菌有较强的抑菌作用。
HYGROSCOPICITY,MOISTURE RETENTION AND ANTI-MICROBIAL ACTIVITY OF OLIGO-GLUCOSAMINE
Shao Jian，Yang Yumin
, 百拇医药
(Nantong Medical College，Nantong 226001)
ABSTRACT Oligo-glucosamine was prepared by oxidative degradation of chitosan with hydroperoxide in the neutral condition.Its moisture re-tention,hygroscopicity and antimicrobial activity were investigated.The results Showed that oligo-glucosamine possess fine water solubility,moisture retention,hygroscopicity and strong inhibition to colonbacillus and pseudomonas aeruginosa.
KEY WORDS oligo-glucosamine,moisture retention,hygroscopicity,antimicrobial activity
, 百拇医药
甲壳素和壳聚糖降解主要是使其分子主链β-(1，4)糖苷键水解断裂，从而生成各种低分子量的多聚糖、葡胺糖的衍生物及葡胺糖。其中，最值得注意的降解产物就是低聚氨基葡萄糖[1]。低聚氨基葡萄糖是壳聚糖经降解后生成的一类低聚物，近年来，随着研究的深入，低聚氨基葡萄糖已被发现有许多独特的生理活性和功能性质。如：(1)分子量较小，易溶于水，进入人体后可被人体直接吸收利用。(2)可提高巨噬细胞的吞噬功能，抑制肿瘤细胞的生长和转移。(3)在人体肠道内活化增殖双歧杆菌、乳酸杆菌，调节肠道的微生物生态平衡，有益于健康。(4)可降低血压，吸附胆固醇，并具有中枢神经镇静作用。(5)在体外微酸环境中具有较强的抑菌抗菌作用，并有显著的保湿、吸湿能力，且稳定性好。(6)用于蔬菜的腌制、食品的保存、果汁和蔬菜汁的澄清。
已报道的壳聚糖降解方法有辐射法、高硼酸氧化法、酶解法及酸溶液回流法。然而，用辐射法降解壳聚糖时往往伴随着交联和支化反应。用高硼酸氧化法，则产品不易得到，且氧化产物复杂、不易提纯。而酸溶液回流法则速度太慢，并且会有交联产物生成。所以，如何方便地得到低聚氨基葡萄糖对拓宽其应用范围具有重要的意义。
, http://www.100md.com
作者选用双氧水在中性条件下对壳聚糖进行降解，克服了其他方法的不足，对产物的吸湿性、保湿性及抗菌活性进行了研究，成功地制备了相对分子质量在1000左右的低聚氨基葡萄糖。
1 实验材料和方法
1.1 实验材料
壳聚糖，购自南通市水产品研究所。
氨基葡萄糖盐酸盐，Sigma产品。
大肠杆菌、绿脓杆菌及营养琼脂培养基由本院微生物教研室提供。
其余试剂均为分析纯，双氧水。
1.2 实验方法
1.2.1 低聚氨基葡萄糖的制备[2]
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将10g壳聚糖(脱乙酰度为90%、平均分子量为4×105)加入500mL 6%的中性双氧水中，在60℃水浴下搅拌反应6h。停止反应后，滤去不溶性物质。将溶液在旋转蒸发仪上减压浓缩后，用乙醇沉淀，再水洗，如此3次，沉淀移入真空干燥器中常温干燥保存。
1.2.2 低聚氨基葡萄糖分子量的测定[3]
精确称取 0.5g 铁氰化钾，溶解于 1L 0.5mol/L 的Na2CO3溶液中，贮藏于棕色试剂瓶，作为显色剂。另准确称取1g氨基葡萄糖盐酸盐，配成100mL水溶液作为标准溶液。
进行还原糖分析时，在10mL具塞比色管中加入2mL显色剂和一定量的标准溶液，定容至5mL。塞上塞子，在沸水浴中反应15min，冷水冷却，在420nm处，以蒸馏水做空白，测定各管吸收光度值A。以A对相应的浓度绘制工作曲线。
, 百拇医药
准确称取低聚氨基葡萄糖粉末，用少量水溶解，以下步骤同上。
在工作曲线上查出所对应的氨基葡萄糖的量，计算出低聚氨基葡萄糖的平均分子量。
经测定，本降解方法所说的低聚氨基葡萄糖的平均分子量在1000左右。
1.2.3 吸湿性和保湿性测定
根据文献[4]进行低聚氨基葡萄糖的吸湿性和保湿性测定。室温下，将低聚氨基葡萄糖样品在干燥器中用五氧化二磷真空干燥12h。吸湿性试验直接用该干燥样品。而保湿性试验则在干燥样品中加入其质量10%的去离子水。
1.2.3.1 吸湿性测定 室温水，精确称取1g样品两份，分别加入直径3cm的称量瓶中，将称量瓶分别放置在两个干燥器中，一个干燥器内放有硫酸铵饱和溶液(相对湿度RH=8%)，另一个干燥器内放有饱和碳酸钠溶液(RH=43%)，放置时间为12、24、48h，分别称量样品放置前质量(Wo)和放置后质量(Wn)根据下式计算吸湿率：
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吸湿率(%)=100(Wn-Wo)/Wo
1.2.3.2 保湿性测定 室温下，精确称取1g样品两份，分别加入直径3cm的称量瓶中，加入质量分数为样品量10%的水。一个称量瓶放置在预先装有饱和碳酸钠溶液(RH=43%)的干燥器内，另一个放入装有干硅胶的干燥器内。放置时间为12、24、48h，分别称量样品放置后水份量Hn和添加水份量Ho。根据下式计算水份残存率：
水份残存率(%)=100Hn/Ho
1.2.4 抑菌活性测定[5]
取培养18h的大肠杆菌和绿脓杆菌菌液0.2ml于无菌平皿内，倒入已融化并冷至45℃左右的营养琼脂培养基，充分摇匀，水平放置特凝。以0.5%的醋酸水溶液作为空白，并将低聚氨基葡萄糖溶解于0.5%的醋酸水溶液中，配成100ppm的溶液(壳聚糖和氨基葡萄糖盐酸盐的溶液同法配制)，灭菌处理。用无菌镊子将小圆形滤纸片(直径0.05cm)浸入上述溶液中，取出并在试管内壁上除去多余溶液后，以无菌操作将纸片放入培养皿中。将培养皿倒置，于37℃培养24h，取出观察抑菌圈大小，确定抑菌效果。
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2 结果与讨论
2.1 低聚氨基葡萄糖的水溶性
由于-O-H-O-型及-O-H-N-型氢键的存在，使得甲壳素分子内具有强烈的氢键作用及晶型结构，导致了甲壳素不溶于水及一般溶剂，只溶于强无机酸及含5%氯化铝的N，N-二甲基乙酰胺。壳聚糖经脱乙酰化反应后，游离氨基含量增加，晶体结构受到破坏，但也只能溶于稀酸溶液，这在很大程度上限制了它们的应用。壳聚糖经双氧水氧化降解后，分子链长度减短，分子量下降。这样，在水溶液中，分子链之间的运动变得无序，分子链上游离氨基的水合作用增强，有助于提高其水溶性。
我们用中性双氧水氧化降解壳聚糖，得到平均分子量在1000左右的低聚氨基葡萄糖，具有优良的水溶性。
2.2 低聚氨基葡萄糖的吸湿性和保湿性
低聚氨基葡萄糖的吸湿性和保湿性测定结果见表1。
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表1 低聚氨基葡萄糖的吸湿性和保湿性
干样品的吸湿率(%)
湿样品的水份残存率(%)
相对湿度
43%
81%
43%
硅胶干燥器
时间
(h)
12
24
48
, 百拇医药
9.4
20.5
30.3
20.7
34.0
51.4
134.0
129.8
117.2
80.7
75.1
65.9
将所得结果与甘油的吸湿率及保湿率相比，两者相当[4]。
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由表1的数据可知，当相对湿度为43%时，低聚氨基葡萄糖仍能吸水，而只有在相对湿度很小时(如在硅胶干燥器中)，低聚氨基葡萄糖才释放出所吸收的水。这可归结为：当壳聚糖分子被降解后，其晶体结构受到破坏，分子呈松散的状态。这样，低聚氨基葡萄糖分子中的一些可与水分子很好亲合的极性基团，如：羟基、氨基等完全游离，从而使它们可方便地和水分子相互作用形成氢键，故低聚氨基葡萄糖分子可滞留住较多的水。
2.3 低聚氨基葡萄糖的抑菌性抑菌试验结果见表2。表2 低聚氨基葡萄糖的抑菌试验结果
(1×10-4mg.L-1,溶剂为0.5%的醋酸溶液) 样 品
大肠杆菌
绿脓杆菌
氨基葡萄糖盐酸盐
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低聚氨基葡萄糖
壳聚糖
空白
+
+++
++
-
-
++
+
-
很明显，低聚氨基葡萄糖对大肠杆菌和绿脓杆菌有较强的抑制作用，且抑菌效果比壳聚糖和氨基葡萄糖盐酸盐要好。
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实验中还发现，如在低聚氨基葡萄糖溶液中不加入醋酸，则所配溶液无抑菌性能。这说明了低聚氨基葡萄糖分子中，起抑菌作用的可能是氨基，即氨基与酸形成铵盐后而显示出抑菌性。但具体的抑菌机理尚待进一步研究。
3 结论
用中性双氧水对壳聚糖进行氧化降解而得到的低聚氨基葡萄糖可完全溶于水中，具有较好的保湿、吸湿性能，并有显著的抑菌作用，这也预示出低聚氨基葡萄糖将在食品、化妆品和医药等行业中具有极其美好的应用前景。
参考文献
[1]陈西广，刘万顺，刘晨光.几丁质的研究与进展.生物工程进展，1997，17(3)：5
[2]邵健，杨宇民.低聚氨基葡萄糖的研制.中国医药工业杂志，1999，30(11)：481
[3]Imoto T.Agr Biol Chem,1977,35(7):1154
[4]Shuichi M,Hanching C,et al.油化学(日文)，1989，38(6)：492
[5]范秀容，李广武，沈萍.微生物学试验.高等教育出版社，1994
(收稿日期：2000-04-08), 百拇医药
单位：邵健 杨宇民(江苏南通医学院化学教研究室，南通 226001)；姚成(南京化工大学应化系,南京 210009)
关键词：低聚氨基葡萄糖，吸湿性，保湿性，抑菌作用
中国海洋药物000407 摘要 采用双氧水在中性条件下对壳聚糖进行氧化降解，制备了低聚氨基葡萄糖。研究了它的吸湿性、保湿性及抗菌性能。结果表明，低聚氨基葡萄糖具有优良的水溶性、吸湿性、保湿性，并对大肠杆菌和绿脓杆菌有较强的抑菌作用。
HYGROSCOPICITY,MOISTURE RETENTION AND ANTI-MICROBIAL ACTIVITY OF OLIGO-GLUCOSAMINE
Shao Jian，Yang Yumin
, 百拇医药
(Nantong Medical College，Nantong 226001)
ABSTRACT Oligo-glucosamine was prepared by oxidative degradation of chitosan with hydroperoxide in the neutral condition.Its moisture re-tention,hygroscopicity and antimicrobial activity were investigated.The results Showed that oligo-glucosamine possess fine water solubility,moisture retention,hygroscopicity and strong inhibition to colonbacillus and pseudomonas aeruginosa.
KEY WORDS oligo-glucosamine,moisture retention,hygroscopicity,antimicrobial activity
, 百拇医药
甲壳素和壳聚糖降解主要是使其分子主链β-(1，4)糖苷键水解断裂，从而生成各种低分子量的多聚糖、葡胺糖的衍生物及葡胺糖。其中，最值得注意的降解产物就是低聚氨基葡萄糖[1]。低聚氨基葡萄糖是壳聚糖经降解后生成的一类低聚物，近年来，随着研究的深入，低聚氨基葡萄糖已被发现有许多独特的生理活性和功能性质。如：(1)分子量较小，易溶于水，进入人体后可被人体直接吸收利用。(2)可提高巨噬细胞的吞噬功能，抑制肿瘤细胞的生长和转移。(3)在人体肠道内活化增殖双歧杆菌、乳酸杆菌，调节肠道的微生物生态平衡，有益于健康。(4)可降低血压，吸附胆固醇，并具有中枢神经镇静作用。(5)在体外微酸环境中具有较强的抑菌抗菌作用，并有显著的保湿、吸湿能力，且稳定性好。(6)用于蔬菜的腌制、食品的保存、果汁和蔬菜汁的澄清。
已报道的壳聚糖降解方法有辐射法、高硼酸氧化法、酶解法及酸溶液回流法。然而，用辐射法降解壳聚糖时往往伴随着交联和支化反应。用高硼酸氧化法，则产品不易得到，且氧化产物复杂、不易提纯。而酸溶液回流法则速度太慢，并且会有交联产物生成。所以，如何方便地得到低聚氨基葡萄糖对拓宽其应用范围具有重要的意义。
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作者选用双氧水在中性条件下对壳聚糖进行降解，克服了其他方法的不足，对产物的吸湿性、保湿性及抗菌活性进行了研究，成功地制备了相对分子质量在1000左右的低聚氨基葡萄糖。
1 实验材料和方法
1.1 实验材料
壳聚糖，购自南通市水产品研究所。
氨基葡萄糖盐酸盐，Sigma产品。
大肠杆菌、绿脓杆菌及营养琼脂培养基由本院微生物教研室提供。
其余试剂均为分析纯，双氧水。
1.2 实验方法
1.2.1 低聚氨基葡萄糖的制备[2]
, http://www.100md.com
将10g壳聚糖(脱乙酰度为90%、平均分子量为4×105)加入500mL 6%的中性双氧水中，在60℃水浴下搅拌反应6h。停止反应后，滤去不溶性物质。将溶液在旋转蒸发仪上减压浓缩后，用乙醇沉淀，再水洗，如此3次，沉淀移入真空干燥器中常温干燥保存。
1.2.2 低聚氨基葡萄糖分子量的测定[3]
精确称取 0.5g 铁氰化钾，溶解于 1L 0.5mol/L 的Na2CO3溶液中，贮藏于棕色试剂瓶，作为显色剂。另准确称取1g氨基葡萄糖盐酸盐，配成100mL水溶液作为标准溶液。
进行还原糖分析时，在10mL具塞比色管中加入2mL显色剂和一定量的标准溶液，定容至5mL。塞上塞子，在沸水浴中反应15min，冷水冷却，在420nm处，以蒸馏水做空白，测定各管吸收光度值A。以A对相应的浓度绘制工作曲线。
, 百拇医药
准确称取低聚氨基葡萄糖粉末，用少量水溶解，以下步骤同上。
在工作曲线上查出所对应的氨基葡萄糖的量，计算出低聚氨基葡萄糖的平均分子量。
经测定，本降解方法所说的低聚氨基葡萄糖的平均分子量在1000左右。
1.2.3 吸湿性和保湿性测定
根据文献[4]进行低聚氨基葡萄糖的吸湿性和保湿性测定。室温下，将低聚氨基葡萄糖样品在干燥器中用五氧化二磷真空干燥12h。吸湿性试验直接用该干燥样品。而保湿性试验则在干燥样品中加入其质量10%的去离子水。
1.2.3.1 吸湿性测定 室温水，精确称取1g样品两份，分别加入直径3cm的称量瓶中，将称量瓶分别放置在两个干燥器中，一个干燥器内放有硫酸铵饱和溶液(相对湿度RH=8%)，另一个干燥器内放有饱和碳酸钠溶液(RH=43%)，放置时间为12、24、48h，分别称量样品放置前质量(Wo)和放置后质量(Wn)根据下式计算吸湿率：
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吸湿率(%)=100(Wn-Wo)/Wo
1.2.3.2 保湿性测定 室温下，精确称取1g样品两份，分别加入直径3cm的称量瓶中，加入质量分数为样品量10%的水。一个称量瓶放置在预先装有饱和碳酸钠溶液(RH=43%)的干燥器内，另一个放入装有干硅胶的干燥器内。放置时间为12、24、48h，分别称量样品放置后水份量Hn和添加水份量Ho。根据下式计算水份残存率：
水份残存率(%)=100Hn/Ho
1.2.4 抑菌活性测定[5]
取培养18h的大肠杆菌和绿脓杆菌菌液0.2ml于无菌平皿内，倒入已融化并冷至45℃左右的营养琼脂培养基，充分摇匀，水平放置特凝。以0.5%的醋酸水溶液作为空白，并将低聚氨基葡萄糖溶解于0.5%的醋酸水溶液中，配成100ppm的溶液(壳聚糖和氨基葡萄糖盐酸盐的溶液同法配制)，灭菌处理。用无菌镊子将小圆形滤纸片(直径0.05cm)浸入上述溶液中，取出并在试管内壁上除去多余溶液后，以无菌操作将纸片放入培养皿中。将培养皿倒置，于37℃培养24h，取出观察抑菌圈大小，确定抑菌效果。
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2 结果与讨论
2.1 低聚氨基葡萄糖的水溶性
由于-O-H-O-型及-O-H-N-型氢键的存在，使得甲壳素分子内具有强烈的氢键作用及晶型结构，导致了甲壳素不溶于水及一般溶剂，只溶于强无机酸及含5%氯化铝的N，N-二甲基乙酰胺。壳聚糖经脱乙酰化反应后，游离氨基含量增加，晶体结构受到破坏，但也只能溶于稀酸溶液，这在很大程度上限制了它们的应用。壳聚糖经双氧水氧化降解后，分子链长度减短，分子量下降。这样，在水溶液中，分子链之间的运动变得无序，分子链上游离氨基的水合作用增强，有助于提高其水溶性。
我们用中性双氧水氧化降解壳聚糖，得到平均分子量在1000左右的低聚氨基葡萄糖，具有优良的水溶性。
2.2 低聚氨基葡萄糖的吸湿性和保湿性
低聚氨基葡萄糖的吸湿性和保湿性测定结果见表1。
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表1 低聚氨基葡萄糖的吸湿性和保湿性
干样品的吸湿率(%)
湿样品的水份残存率(%)
相对湿度
43%
81%
43%
硅胶干燥器
时间
(h)
12
24
48
, 百拇医药
9.4
20.5
30.3
20.7
34.0
51.4
134.0
129.8
117.2
80.7
75.1
65.9
将所得结果与甘油的吸湿率及保湿率相比，两者相当[4]。
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由表1的数据可知，当相对湿度为43%时，低聚氨基葡萄糖仍能吸水，而只有在相对湿度很小时(如在硅胶干燥器中)，低聚氨基葡萄糖才释放出所吸收的水。这可归结为：当壳聚糖分子被降解后，其晶体结构受到破坏，分子呈松散的状态。这样，低聚氨基葡萄糖分子中的一些可与水分子很好亲合的极性基团，如：羟基、氨基等完全游离，从而使它们可方便地和水分子相互作用形成氢键，故低聚氨基葡萄糖分子可滞留住较多的水。
2.3 低聚氨基葡萄糖的抑菌性抑菌试验结果见表2。表2 低聚氨基葡萄糖的抑菌试验结果
(1×10-4mg.L-1,溶剂为0.5%的醋酸溶液) 样 品
大肠杆菌
绿脓杆菌
氨基葡萄糖盐酸盐
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低聚氨基葡萄糖
壳聚糖
空白
+
+++
++
-
-
++
+
-
很明显，低聚氨基葡萄糖对大肠杆菌和绿脓杆菌有较强的抑制作用，且抑菌效果比壳聚糖和氨基葡萄糖盐酸盐要好。
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实验中还发现，如在低聚氨基葡萄糖溶液中不加入醋酸，则所配溶液无抑菌性能。这说明了低聚氨基葡萄糖分子中，起抑菌作用的可能是氨基，即氨基与酸形成铵盐后而显示出抑菌性。但具体的抑菌机理尚待进一步研究。
3 结论
用中性双氧水对壳聚糖进行氧化降解而得到的低聚氨基葡萄糖可完全溶于水中，具有较好的保湿、吸湿性能，并有显著的抑菌作用，这也预示出低聚氨基葡萄糖将在食品、化妆品和医药等行业中具有极其美好的应用前景。
参考文献
[1]陈西广，刘万顺，刘晨光.几丁质的研究与进展.生物工程进展，1997，17(3)：5
[2]邵健，杨宇民.低聚氨基葡萄糖的研制.中国医药工业杂志，1999，30(11)：481
[3]Imoto T.Agr Biol Chem,1977,35(7):1154
[4]Shuichi M,Hanching C,et al.油化学(日文)，1989，38(6)：492
[5]范秀容，李广武，沈萍.微生物学试验.高等教育出版社，1994
(收稿日期：2000-04-08), 百拇医药