镉与细胞凋亡
作者：吴训伟 金泰廙 李秋云
单位：金泰廙(上海医科大学劳动卫生教研室)；吴训伟 李秋云(上海市静安区卫生防疫站，200041)
关键词：
卫生毒理学杂志000424 镉是重要的工业和环境污染物，主要来源于冶炼厂、电镀、蓄电池、采矿等工业中。人类对镉的研究已有100多年的历史，表明长期低剂量接触镉主要引起以近曲小管损害为主要特征的肾脏损害[1]。研究也显示，镉接触与生殖损害、肿瘤和衰老等有一定的关系[2，3，4]。由于镉在工业上应用广泛，在土壤、植物中有蓄积作用，在人体的半衰期达10～30年，因此镉显然存在着对人类潜在的危害。再加上镉慢性毒作用如致癌、致衰老等机制尚未清楚。所以，人类持续对镉的毒性进行研究已进入分子水平。80年代末至90年代初，开始有文献报道由镉造成细胞凋亡，随后此方面的报道逐渐增多。近几年该研究成为各国学者对镉分子毒理学研究的一个热点。但在国内尚未见到有关的文献报道。凋亡(apoptosis)是1972年Kerr等[5]首先提出的一种细胞死亡形式，它是机体调节细胞数目及生命活动的一个积极主动而且是必要的过程，能清除受伤细胞并维持细胞结构功能的完整性，因而它具有广泛的生理和病理作用[6]。凋亡可发生在正常胚胎和胎儿发育，正常组织的细胞转换、正常发育和病理萎缩等过程中。离体和整体研究都表明镉能引起细胞凋亡。目前主要用酶联免疫法、流式细胞分析法、DNA的电泳和原位末端标记法(In Situ End Labeling,ISEL)等来观察凋亡现象。阐明镉与凋亡的关系有助于对镉致肿瘤、衰老等分子毒理学机制的理解。
1 离体研究
离体研究镉引起细胞凋亡，主要集中在免疫细胞与肾细胞上。Azzouzi等[7](1994)研究镉浓度为6 μmol和15 μmol，时间在6 h和18 h，可导致人类T细胞系CEM-C12细胞活力下降，出现凋亡小体及DNA片断。而当镉浓度为50 μmol，6 h和18 h时，却未观察到凋亡细胞，而坏死细胞增多明显。可见镉在低浓度时通过凋亡引起CEM-C12细胞的死亡，而高浓度则通过坏死引起CEM-C12的死亡。最近，Tsangaris等[8](1998)对3种T细胞CCRF-CEM、B细胞Raji和成淋巴细胞Molt-3、人类免疫细胞进行研究，其中，当镉的浓度为5 μmol时，Raji细胞组中就可被探测到凋亡现象，凋亡细胞占总细胞数的16%，而后随着浓度增高，凋亡数量上升明显，浓度为20 μmol和30 μmol时，达到平台，所占比例分别为65%和61%。随后凋亡细胞数量逐渐减少，相反坏死细胞在镉浓度为25 μmol开始上升，100 μmol时，达到平台。在CCRF-CEM细胞组中和Molt-3细胞组中，当镉的浓度为10 μmol时，凋亡细胞明显增多，此时，凋亡细胞占细胞总数的比例分别为17%、14%。镉浓度为30 μmol时，CCRF-CEM细胞组中，凋亡细胞数上升到最高(70%)，然后开始下降。Molt-3细胞组，镉在30 μmol和50 μmol时，凋亡细胞的比例分别为64%和68%，随后开始下降。
Hamada等[9]体外培养转化人类肾脏细胞(293细胞)，在介质中加入12.5～37.5 μmol氯化镉，凋亡细胞明显增多并有剂量-反应关系。在25 μmol时，提取293细胞中的DNA，在琼脂凝胶电泳仪上，呈现典型的梯形状图谱。当氯化镉浓度大于37.5 μmol时，凋亡发生明显减少。在100 μmol，抽取NDA进行电泳，未呈特征性的梯状图谱。Ishido等[10]体外培养肾小管上皮细胞(LLC-PK1)，加入10 μmol镉，培育7 h，就明显可见DNA片断。
另外，McCabe等[11]研究也表明镉在体外培养能诱导胸腺细胞的凋亡。从各研究来看，体外培养细胞，镉诱导细胞凋亡浓度在10～30 μmol之间，高于此浓度则坏死细胞增多，而凋亡减少。
2 整体研究
整体研究主要集中在肝、肾、睾丸及前列腺组织中。
Habeebu等[12]给成年雄性小鼠注射氯化镉(30 μmol)，分别在1.5、3、6、9、14、24、48 h取肝脏进行观察，1.5 h时可见肝细胞肿胀，3 h时观察到凋亡的出现，9～14 h，凋亡出现高峰，凋亡指数(apoptotic index)是对照组的35倍，并呈现出显著的时间-效应关系。以后坏死细胞增多明显，凋亡细胞数量开始下降。Habeebu等也分别注射不同浓度(5、10、20、30、40、60 μmol)的氯化镉，9 h后取肝脏进行剂量反应的研究。结果显示，镉浓度为20 μmol时凋亡细胞开始增加，并呈现剂量-效应关系。Zhou等[13]用不同浓度(5、10、20 μmol)注射Wistar雄性大鼠，48、96 h取肝脏进行观察，肝细胞凋亡与对照组相比，有轻度增加，但不显著。这可能与注射镉的浓度有关，注射氯化镉浓度需在20 μmol/kg以上，方能诱导动物肝细胞发生凋亡。
Xu等[14]对大鼠分别注射浓度为2.5、5、10 μmol/kg氯化镉，在48、72 h后取睾丸和前列腺组织。5、10 μmol/kg两剂量组，睾丸组织中出现凋亡细胞，72 h10 μmol/kg的组织，DNA片断数量增加显著。而各剂量组中前列腺组织中均未出现凋亡细胞。Zhou等[13]的研究，与此结果基本一致，Zhou等发现，注射浓度5 μmol/kg的氯化镉，大鼠睾丸组织在48 h出现凋亡细胞，96 h时，增加明显，凋亡指数为12.7%。剂量在10 μmol/kg和20 μmol/kg组中，12 h就可见凋亡细胞数量的增加。而前列腺组织中，各剂量组凋亡细胞数量有所上升，但不显著，凋亡指数最高为2.21%。其实，Xu等[15](1996)在大鼠研究中就观察到镉诱导睾丸细胞的凋亡。
Hamada等[16](1991)给Beagle狗长期注射镉，发现肾小管上皮细胞可出现凋亡。同样，Tanimoto等[17](1993)给大鼠皮下注射氯化镉，也可见近曲小管上皮细胞出现凋亡现象，而且在凋亡的细胞中含有大量的镉。
从上述研究来看，睾丸组织对镉诱导凋亡较敏感。有趣的是，研究表明凋亡仅在睾丸生殖细胞发生，未出现在间质细胞中，间质细胞被认为对镉细胞毒性、致癌毒作用最为敏感。表明有机体有能力通过细胞凋亡来清除损伤的生殖细胞，从而保持基因的稳定性，预防错误的DNA复制到下一代。而间质细胞不经历凋亡的过程，易被镉诱导发生肿瘤。
3 镉引起凋亡的可能机制
DNA损伤被认为是细胞发生凋亡的主要原因。Corcoran等[18]研究提出DNA损伤是引发细胞凋亡的开始。整体动物研究表明，镉是一弱的诱变剂，能直接引起DNA的损伤，包括DNA单链的断裂、移码突变及染色体的畸变。目前对镉引起凋亡的机制观点很多，但主要有以下几种：
一种是钙通道学说。凋亡细胞中染色质浓缩、DNA的断裂与内源性核酸内切酶的活性有关，有活性的核酸内切酶能将细胞核的DNA在核间小体处断裂成200碱基大小的核苷酸片断[19]。核酸内切酶的活性是钙依赖性的，钙离子能激活核酸内切酶。研究显示，胞液内水平持续增高，则DNA片断增多，引起细胞的死亡。目前认为，镉一方面能通过钙能道进入细胞内，替代钙发出信号，发挥Ca2+的作用，激活胞液的核酸内切酶，因为有研究表明钙的受体也是镉的靶位点；而另一方面进入细胞内的镉，能引起细胞内钙的增加，这可能是两价镉离子可刺激细胞内钙的移动，从而诱导或激活已经存在的核酸内切酶[19]。研究显示，加入锌(Ca2+依赖的核酸内切酶的阻断剂)或钙/钾通道阻断剂Verapamil都能预防镉诱导细胞凋亡[7，19]。
另一种观点是，一些原癌基因如c-jun,c-fos,c-myc等及抑癌基因p53在镉引起细胞凋亡中起着重要作用[12，13]。Evan等[20]证明c-myc基因是大鼠成纤维细胞发生凋亡的必要条件，认为c-myc基因是凋亡的关键基因。Matsuoka等证实镉能激活肾上皮LLC-PK1细胞c-myc基因的转录，认为c-myc基因是镉诱导凋亡必需的成分。然而Ishido等[10]研究显示镉诱导凋亡不受c-myc基因表达的调节。Clarke等[21]研究认为引起细胞凋亡是通过p53依赖性或非p53依赖性的两种途径。研究表明，p53的作用是通过编码一种潜在的转录活化因子，使细胞终止增殖而代之启动细胞进入分化状态，触发细胞凋亡而发展至死亡。p53基因是通过引入凋亡机制而对肿瘤生长起抑制作用。Zhou等[13]研究表明，镉能抑制大鼠睾丸组织p53基因的表达，而能加强前列腺素p53基因表达，提出镉诱导凋亡不仅仅通过p53依赖性的途径，同时也存在着非p53依赖性的途径。
Hamada等[9]发现金属硫蛋白(MT)能诱导人类肾脏293细胞的凋亡并有剂量反应的关系。而且活体研究中也证明，镉金属硫蛋白(Cd-MT)复合物能引起DNA链的断裂。作者认为Cd-MT能激活核酸内切酶，从而导致DNA的断裂。因而MT对镉引起细胞凋亡起着重要的作用。
Koizumi等认为镉干扰线粒体功能，并引起脂质过氧化作用，从而导致对细胞氧化的作用，最后导致细胞凋亡[22]。
总之，有关镉引起细胞凋亡机制的观点很多，但至今，尚未完全清楚。从以上研究来看，有一点是肯定的：镉是通过多途径引起细胞的凋亡，而且在不同的组织中，引起凋亡的机制及其具体过程，不完全一致。对于镉在机体内诱导细胞凋亡在其分子毒理学中的作用，还有待进一步研究。
本课题受上海区县卫生系统百人培养计划资助
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(收稿日期：1999-03-29)