溴氰菊酯对大鼠脑组织细胞色素P450的影响
作者：严红 刘烈刚 石年 刘毓谷
单位：刘烈刚(同济医科大学营养与食品卫生学教研室)；严红 石年 刘毓谷(同济医科大学环境毒理学教研室，武汉 430030)
关键词：
卫生毒理学杂志000419 拟除虫菊酯是一类高效，广谱，低残留的杀虫剂，广泛用于农业害虫和家庭卫生害虫的防治[1]。它对哺乳动物的毒性主要表现在中枢神经系统，出现流涎，乱抓，旋转性抽搐，痉挛直至死亡等症状[2]。为了在实际生活中对其急性中毒的急救及慢性中毒的防治提供理论依据，国内外学者对其神经毒作用机制进行了较多的研究，但这些研究多集中在兴奋性神经递质影响等方面[3，4]。而对脑组织中对外来化合物代谢起重要作用的P450的研究较少。7-乙氧基试卤灵O-脱乙基酶(ethoxyresorufin O-deethylase EROD)是脑组织中分布较广，活性较高的一种P450代谢酶，它对进入脑组织的外来化合物的代谢起重要作用[5]，我们以常用的拟除虫菊酯-溴氰菊酯(Deltamethrin,DM)为代表，探讨DM对脑组织P450含量及脑组织中EROD的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 溴氰菊酯，质量分数为98.3%，法国Roussel-Uclaf公司产品；双光束双波长紫外分光光度计，日本岛津产品；RS-20型低温高速离心机，日本Tomy公司产品；L-M80型低温超速离心机，美国Beckman公司产品。
1.2 动物分组及处理 SD雄性大鼠体重(200±20)g；实验动物分两组：(1)DM处理组：DM用玉米油溶解，经腹腔注射连续5 d，剂量为12.5 mg*kg-1*d-1；(2)阴性对照组，等量玉米油腹腔注射连续5 d。动物处死后分离全脑，小脑和大脑皮层，用超速离心法制备微粒体[6]。
1.3 溴氰菊酯与脑微粒体细胞色素P450结合的差示光谱分析 用不同浓度的DM在体外与脑微粒体共同温育，用双光束双波长紫外分光光度计，扫描观察P450在350～500 nm吸收光谱的变化。
, 百拇医药
1.4 脑微粒体P450含量测定 在体内实验和体外实验中P450含量按Omura和Sato[7]方法测定。
1.5 EROD活性测定 采用荧光分光光度法测定[8，9]，反应总体积2 mL，恒温37℃，Ex=530 nm,Em=580 nm，基线稳定后由NADPH启动反应，记录3 min内荧光增值，用试卤灵(resorufin)做内标进行计算。
2 结果
2.1 溴氰菊酯与脑微粒体细胞色素P450结合的差示光谱 溴氰菊酯与脑微粒体细胞色素P450结合后，形成的差示光谱波峰为433 nm，波谷为398 nm，属于Ⅱ型差示光谱。图1为16 mmol/L的溴氰菊酯与脑微粒体细胞色素P450结合的差示光谱，此结果表明溴氰菊酯与脑微粒体P450结合部位在P450的血红素铁上。
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图1 溴氰菊酯与大鼠脑微粒体细胞色素P450结合形成的Ⅱ型差示光谱
2.2 溴氰菊酯对大鼠脑微粒体中P450含量的影响 DM进入脑组织后，可与脑微粒体细胞色素P450结合形成Ⅱ型差示光谱，为了探明这种结合是否能影响脑微粒体细胞色素P450含量的变化，我们从体内外两方面研究了溴氰菊酯对脑微粒体P450含量的影响。
2.2.1 溴氰菊酯在体内对细胞色素P450含量的影响 正常情况下脑微粒体P450含量较低，且经溴氰菊酯处理后，大脑皮层，小脑及全脑组织中P450含量明显降低(表1)。
表1 溴氰菊酯在体内对细胞色素P450含量的影响(pmol/mg prot,
±s) 组 别
全脑组织
, 百拇医药
大脑皮层
小 脑
溴氰菊酯组
29.6±4.8
34.6±3.1
43.8±5.3
对 照 组
35.5±3.2
40.5±4.2
52.3±6.6
与对照组相比，P<0.05；每组动物数=62.2.2 溴氰菊酯在体外对细胞色素P450含量的影响 在体外加入适量的溴氰菊酯于脑微粒体中，使其达到所需终浓度，37 ℃水浴30 min后，测定P450含量。由表2可知，在体外条件下，2×10-8-2×10-4mol/L的DM对全脑，大脑皮层及小脑微粒体P450含量无明显的影响。
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表2 溴氰菊酯在体外对细胞色素P450含量的影响(pmol/mg prot,±s) 剂量(mol/L)
全脑组织
大脑皮层
小 脑
0
35.5±3.3
40.5±4.2
52.3±6.6
2×10-8
35.8±3.1
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38.5±3.8
52.6±7.2
2×10-7
33.6±3.2
37.6±5.8
51.5±7.2
2×10-6
34.1±3.2
39.5±5.9
54.8±6.4
2×10-5
, 百拇医药
37.5±4.7
43.3±6.4
55.6±5.7
2×10-4
36.0±2.9
42.3±4.1
50.6±5.6
每组动物数=62.3 溴氰菊酯在大鼠体内对脑微粒体EROD活性的影响 表3结果表明，在DM作用下，全脑及大脑皮层EROD活性明显被抑制，差异有显著性。
表3 溴氰菊酯在体内对脑微粒体EROD活性的影响(pmol.mg-1.prot.min-1,±s) 脑 区
, 百拇医药
对照组
DM 组
全 脑
0.50±0.05
0.34±0.07
小 脑
0.30±0.04
0.27±0.03
大脑皮层
0.61±0.08
0.38±0.06
P<0.05；每组动物数=62.4 溴氰菊酯在体外条件下对EROD活性的影响 由表4可知，在体外条件下，不同剂量DM处理脑微粒体后EROD活性均无明显变化，表明DM不能在体外直接抑制EROD的活性。
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表4 溴氰菊酯在体外对脑微粒体EROD活性的影响(±s) 浓度(mol/L)
EROD活性(pmol.mg-1.prot.min-1)
全 脑
小 脑
大脑皮层
0
0.52±0.044
0.32±0.053
0.64±0.074
, 百拇医药 2×10-4
0.50±0.053
0.31±0.038
0.63±0.070
2×10-5
0.53±0.055
0.33±0.054
0.61±0.071
2×10-6
0.51±0.051
0.34±0.036
, http://www.100md.com
0.66±0.054
2×10-7
0.54±0.050
0.33±0.048
0.64±0.054
2×10-8
0.51±0.049
0.31±0.047
0.65±0.081
每组动物数=63 讨论
许多外来化合物能与细胞色素P450结合，可使细胞色素P450原有的特征性吸收光谱发生变化，这种变化称为差示光谱。借此可以定量测定外来化合物与P450相结合的情况，不同物质与细胞色素P450结合后形成的光谱变化可分成3种类型[10]。本研究结果表明DM能与脑微粒体结合形成Ⅱ型差示光谱，此结果提示DM能与脑微粒体相结合，且结合部位在细胞色素P450血红素铁上，并对P450代谢酶有抑制作用。这种抑制作用可能与下列因素有关：(1)DM改变P450代谢酶的构型或构像，从而影响酶的活性中心，(2)DM干扰微粒体P450代谢酶蛋白合成，使酶蛋白含量减少而使酶活性降低。通过进一步研究发现DM在体内明显减少大鼠脑微粒体细胞色素P450含量及抑制EROD活性，但在体外则作用不明显，这种体内外作用差异可能由DM在体内诸多因素如神经，激素等体外不具备的条件作用下抑制蛋白合成，使酶活性降低所致，而不是通过直接改变酶结构抑制酶活性，但其机制尚需进一步探讨。
, 百拇医药
大多数外来化合物是由肝微粒体P450进行代谢转化，但DM是一种脂溶性化合物，易通过血脑屏障进入脑组织，脑微粒体P450对进入脑组织的外来化合物的代谢起重要作用，但由于脑组织P450含量及酶活性较低，并且脑组织的再生能力有限，因此，脑组织P450的轻度变化，将较大程度影响它对外来化合物的代谢[11]。DM对脑微粒体P450抑制，将使DM在脑内代谢减慢，代谢半减期延长，从而增强其神经毒作用。因此，DM导致机体的神经毒作用，除与兴奋性氨基酸所致的信号转导系统发生改变有关外，对脑组织P450的抑制亦是一个不可忽视的方面。
此外，在实际工作中，由于农业及家庭卫生害虫耐药性的出现，需不断更新杀虫剂，除了生产新的杀虫剂外，杀虫剂的复配使用占很大的比例，因此，在实际使用DM和其它杀虫剂复配时，务必考虑DM对脑微粒体P450的抑制作用，从而使复配剂杀虫效应达到最大，同时对人畜的危害减到最低程度。
本课题受国家自然科学基金资助重点项目(39430110)
, http://www.100md.com
参考文献
[1] Casida JE,Gammon,DE,Glickman,AH,et al.Mechanism of selective action of pyrethroids insecticide. Ann Rev Pharmacol Toxicol,1983,23:413-418.
[2] Ali SF. Neurotoxic agents:pesticide in:Neurotoxicology,Abou-Domia MD ed,LRL Press,1992.4360-462.
[3] 赵西龙，朱晓峰，刘毓谷.溴氰菊酯对大鼠脑片谷氨酸递质释放的影响.中国环境科学，1996，16：258-260.
[4] 牛玉杰，石年，刘毓谷.溴氰菊酯对大鼠中枢神经系统一氧化氮合酶活性的影响.卫生毒理学杂志，1997，11：75-77.
, 百拇医药
[5] Komori M. A novel P450 expressed at high level in rat brain. Biochem Biophys Res Commun,1993,162:721-728.
[6] 刘毓谷，主编.卫生毒理学基础.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.209-212.
[7] Omura T,Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes.l.Evidence for its hemoprotein nature.J Biol Chem,1964,239,2370-2378.
[8] Jung G,Strobel HW. Indentification of inducible mixed function oxidase system in rat glioma C6 cell line. J Neurochem,1995,65:554-563.
, http://www.100md.com
[9] Burke MD,Thomson S,Weaver RJ,et al. Cytochrome P450 specifities of alkoxyresorufin o-deelkxylation in human and rat liver. Biochem Pharmacol,1994,48:923-936.
[10] 张铣，刘毓谷，主编.毒理学.中国协和医科大学北京医科大学联合出版社，1997.128-129.
[11] Warner M,Gustafasson JA. Cytochrome P-450 in the brain,neuroendocrine functions,Frontiers. Neuroendocrinol,1995,16:224-236.
(收稿日期：1999-06-18), http://www.100md.com
单位：刘烈刚(同济医科大学营养与食品卫生学教研室)；严红 石年 刘毓谷(同济医科大学环境毒理学教研室，武汉 430030)
关键词：
卫生毒理学杂志000419 拟除虫菊酯是一类高效，广谱，低残留的杀虫剂，广泛用于农业害虫和家庭卫生害虫的防治[1]。它对哺乳动物的毒性主要表现在中枢神经系统，出现流涎，乱抓，旋转性抽搐，痉挛直至死亡等症状[2]。为了在实际生活中对其急性中毒的急救及慢性中毒的防治提供理论依据，国内外学者对其神经毒作用机制进行了较多的研究，但这些研究多集中在兴奋性神经递质影响等方面[3，4]。而对脑组织中对外来化合物代谢起重要作用的P450的研究较少。7-乙氧基试卤灵O-脱乙基酶(ethoxyresorufin O-deethylase EROD)是脑组织中分布较广，活性较高的一种P450代谢酶，它对进入脑组织的外来化合物的代谢起重要作用[5]，我们以常用的拟除虫菊酯-溴氰菊酯(Deltamethrin,DM)为代表，探讨DM对脑组织P450含量及脑组织中EROD的影响。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 溴氰菊酯，质量分数为98.3%，法国Roussel-Uclaf公司产品；双光束双波长紫外分光光度计，日本岛津产品；RS-20型低温高速离心机，日本Tomy公司产品；L-M80型低温超速离心机，美国Beckman公司产品。
1.2 动物分组及处理 SD雄性大鼠体重(200±20)g；实验动物分两组：(1)DM处理组：DM用玉米油溶解，经腹腔注射连续5 d，剂量为12.5 mg*kg-1*d-1；(2)阴性对照组，等量玉米油腹腔注射连续5 d。动物处死后分离全脑，小脑和大脑皮层，用超速离心法制备微粒体[6]。
1.3 溴氰菊酯与脑微粒体细胞色素P450结合的差示光谱分析 用不同浓度的DM在体外与脑微粒体共同温育，用双光束双波长紫外分光光度计，扫描观察P450在350～500 nm吸收光谱的变化。
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1.4 脑微粒体P450含量测定 在体内实验和体外实验中P450含量按Omura和Sato[7]方法测定。
1.5 EROD活性测定 采用荧光分光光度法测定[8，9]，反应总体积2 mL，恒温37℃，Ex=530 nm,Em=580 nm，基线稳定后由NADPH启动反应，记录3 min内荧光增值，用试卤灵(resorufin)做内标进行计算。
2 结果
2.1 溴氰菊酯与脑微粒体细胞色素P450结合的差示光谱 溴氰菊酯与脑微粒体细胞色素P450结合后，形成的差示光谱波峰为433 nm，波谷为398 nm，属于Ⅱ型差示光谱。图1为16 mmol/L的溴氰菊酯与脑微粒体细胞色素P450结合的差示光谱，此结果表明溴氰菊酯与脑微粒体P450结合部位在P450的血红素铁上。
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图1 溴氰菊酯与大鼠脑微粒体细胞色素P450结合形成的Ⅱ型差示光谱
2.2 溴氰菊酯对大鼠脑微粒体中P450含量的影响 DM进入脑组织后，可与脑微粒体细胞色素P450结合形成Ⅱ型差示光谱，为了探明这种结合是否能影响脑微粒体细胞色素P450含量的变化，我们从体内外两方面研究了溴氰菊酯对脑微粒体P450含量的影响。
2.2.1 溴氰菊酯在体内对细胞色素P450含量的影响 正常情况下脑微粒体P450含量较低，且经溴氰菊酯处理后，大脑皮层，小脑及全脑组织中P450含量明显降低(表1)。
表1 溴氰菊酯在体内对细胞色素P450含量的影响(pmol/mg prot,
±s) 组 别全脑组织
, 百拇医药
大脑皮层
小 脑
溴氰菊酯组
29.6±4.8
34.6±3.1
43.8±5.3
对 照 组
35.5±3.2
40.5±4.2
52.3±6.6
与对照组相比，P<0.05；每组动物数=62.2.2 溴氰菊酯在体外对细胞色素P450含量的影响 在体外加入适量的溴氰菊酯于脑微粒体中，使其达到所需终浓度，37 ℃水浴30 min后，测定P450含量。由表2可知，在体外条件下，2×10-8-2×10-4mol/L的DM对全脑，大脑皮层及小脑微粒体P450含量无明显的影响。
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表2 溴氰菊酯在体外对细胞色素P450含量的影响(pmol/mg prot,
±s) 剂量(mol/L)全脑组织
大脑皮层
小 脑
0
35.5±3.3
40.5±4.2
52.3±6.6
2×10-8
35.8±3.1
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38.5±3.8
52.6±7.2
2×10-7
33.6±3.2
37.6±5.8
51.5±7.2
2×10-6
34.1±3.2
39.5±5.9
54.8±6.4
2×10-5
, 百拇医药
37.5±4.7
43.3±6.4
55.6±5.7
2×10-4
36.0±2.9
42.3±4.1
50.6±5.6
每组动物数=62.3 溴氰菊酯在大鼠体内对脑微粒体EROD活性的影响 表3结果表明，在DM作用下，全脑及大脑皮层EROD活性明显被抑制，差异有显著性。
表3 溴氰菊酯在体内对脑微粒体EROD活性的影响(pmol.mg-1.prot.min-1,
±s) 脑 区, 百拇医药
对照组
DM 组
全 脑
0.50±0.05
0.34±0.07
小 脑
0.30±0.04
0.27±0.03
大脑皮层
0.61±0.08
0.38±0.06
P<0.05；每组动物数=62.4 溴氰菊酯在体外条件下对EROD活性的影响 由表4可知，在体外条件下，不同剂量DM处理脑微粒体后EROD活性均无明显变化，表明DM不能在体外直接抑制EROD的活性。
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表4 溴氰菊酯在体外对脑微粒体EROD活性的影响(
±s) 浓度(mol/L)EROD活性(pmol.mg-1.prot.min-1)
全 脑
小 脑
大脑皮层
0
0.52±0.044
0.32±0.053
0.64±0.074
, 百拇医药 2×10-4
0.50±0.053
0.31±0.038
0.63±0.070
2×10-5
0.53±0.055
0.33±0.054
0.61±0.071
2×10-6
0.51±0.051
0.34±0.036
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0.66±0.054
2×10-7
0.54±0.050
0.33±0.048
0.64±0.054
2×10-8
0.51±0.049
0.31±0.047
0.65±0.081
每组动物数=63 讨论
许多外来化合物能与细胞色素P450结合，可使细胞色素P450原有的特征性吸收光谱发生变化，这种变化称为差示光谱。借此可以定量测定外来化合物与P450相结合的情况，不同物质与细胞色素P450结合后形成的光谱变化可分成3种类型[10]。本研究结果表明DM能与脑微粒体结合形成Ⅱ型差示光谱，此结果提示DM能与脑微粒体相结合，且结合部位在细胞色素P450血红素铁上，并对P450代谢酶有抑制作用。这种抑制作用可能与下列因素有关：(1)DM改变P450代谢酶的构型或构像，从而影响酶的活性中心，(2)DM干扰微粒体P450代谢酶蛋白合成，使酶蛋白含量减少而使酶活性降低。通过进一步研究发现DM在体内明显减少大鼠脑微粒体细胞色素P450含量及抑制EROD活性，但在体外则作用不明显，这种体内外作用差异可能由DM在体内诸多因素如神经，激素等体外不具备的条件作用下抑制蛋白合成，使酶活性降低所致，而不是通过直接改变酶结构抑制酶活性，但其机制尚需进一步探讨。
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大多数外来化合物是由肝微粒体P450进行代谢转化，但DM是一种脂溶性化合物，易通过血脑屏障进入脑组织，脑微粒体P450对进入脑组织的外来化合物的代谢起重要作用，但由于脑组织P450含量及酶活性较低，并且脑组织的再生能力有限，因此，脑组织P450的轻度变化，将较大程度影响它对外来化合物的代谢[11]。DM对脑微粒体P450抑制，将使DM在脑内代谢减慢，代谢半减期延长，从而增强其神经毒作用。因此，DM导致机体的神经毒作用，除与兴奋性氨基酸所致的信号转导系统发生改变有关外，对脑组织P450的抑制亦是一个不可忽视的方面。
此外，在实际工作中，由于农业及家庭卫生害虫耐药性的出现，需不断更新杀虫剂，除了生产新的杀虫剂外，杀虫剂的复配使用占很大的比例，因此，在实际使用DM和其它杀虫剂复配时，务必考虑DM对脑微粒体P450的抑制作用，从而使复配剂杀虫效应达到最大，同时对人畜的危害减到最低程度。
本课题受国家自然科学基金资助重点项目(39430110)
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参考文献
[1] Casida JE,Gammon,DE,Glickman,AH,et al.Mechanism of selective action of pyrethroids insecticide. Ann Rev Pharmacol Toxicol,1983,23:413-418.
[2] Ali SF. Neurotoxic agents:pesticide in:Neurotoxicology,Abou-Domia MD ed,LRL Press,1992.4360-462.
[3] 赵西龙，朱晓峰，刘毓谷.溴氰菊酯对大鼠脑片谷氨酸递质释放的影响.中国环境科学，1996，16：258-260.
[4] 牛玉杰，石年，刘毓谷.溴氰菊酯对大鼠中枢神经系统一氧化氮合酶活性的影响.卫生毒理学杂志，1997，11：75-77.
, 百拇医药
[5] Komori M. A novel P450 expressed at high level in rat brain. Biochem Biophys Res Commun,1993,162:721-728.
[6] 刘毓谷，主编.卫生毒理学基础.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.209-212.
[7] Omura T,Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes.l.Evidence for its hemoprotein nature.J Biol Chem,1964,239,2370-2378.
[8] Jung G,Strobel HW. Indentification of inducible mixed function oxidase system in rat glioma C6 cell line. J Neurochem,1995,65:554-563.
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[9] Burke MD,Thomson S,Weaver RJ,et al. Cytochrome P450 specifities of alkoxyresorufin o-deelkxylation in human and rat liver. Biochem Pharmacol,1994,48:923-936.
[10] 张铣，刘毓谷，主编.毒理学.中国协和医科大学北京医科大学联合出版社，1997.128-129.
[11] Warner M,Gustafasson JA. Cytochrome P-450 in the brain,neuroendocrine functions,Frontiers. Neuroendocrinol,1995,16:224-236.
(收稿日期：1999-06-18), http://www.100md.com