锰纹状体内染毒对多巴胺及其代谢产物的影响
作者：邓一夫 王悦 段春礼 王元身 苏忆兰 李国君 Zheng W 徐群渊
单位：Zheng W(Columbia University School of Public Health)；徐群渊(首都医科大学神经科学研究所)；段春礼 王元身(首都医科大学神经科学研究所)；邓一夫 王悦 苏忆兰 李国君(首都医科大学预防医学系，100054)
关键词：
卫生毒理学杂志000417 锰中毒主要表现为锥体外系神经障碍，并可出现类似帕金森氏综合征的临床表现。近年来由于作为汽油抗爆剂的四乙基铅逐渐被三羰基甲基环戊二烯合锰(methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl,MMT)替代，造成环境中锰的含量逐渐升高，锰对健康的影响更加引起人们关注[1]。但迄今为止锰中毒的机制仍不十分清楚。目前采用动物实验进行的锰中毒研究中，染毒途径主要为腹腔注射或饮水中加入方式，由于血脑屏障的存在，锰通过转铁蛋白作为载体穿过血脑屏障的速度很慢[2]，且动物之间存在个体差异，实际作用于靶器官的浓度很难确定，从而在一定程度上影响了研究结果的推断。我们首次采用锰脑纹状体内注射染毒方式观察了大鼠染毒后纹状体内多巴胺及其代谢产物含量的变化。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂 氯化锰(MnCl2*4H2O)，AR级，上海金山试剂厂生产；多巴胺(DA)、3，4-双羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)标准品，Sigma公司产品。
1.2 动物分组与处理 雌性SD大鼠(首都医科大学实验动物中心提供)18只，体重200～260 g，随机分为染毒组和对照组，每组9只。水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位仪上，根据大鼠脑立体定位图谱，确定大鼠纹状体坐标[3]。以1 μl/min速度用微量注射器对染毒组大鼠脑一侧纹状体内注射0.4 μmol MnCl26 μl，对照组注射生理盐水(NaCl) 6 μl，术后自由进食饮水。
1.3 观察指标与方法 检测指标为单胺类递质多巴胺(DA)及其代谢产物DOPAC、HVA、5-HIAA。脑内注射染毒后第4、7、10、20天，将动物麻醉后固定于脑立体定位仪上，将同一微透析探针先后插入左、右侧纹状体，用人工脑脊液以1 μl/min 的速度灌流，灌流稳定60 min 后，冰浴条件下每25 min收集一份透析液样品待测。脑内注射20 d后断头处死大鼠，冰浴中迅速分离出左、右纹状体，精确称量后，加入0.4 mol 高氯酸0.4 ml制备匀浆，台式低温冷冻离心机(1～4 ℃)12 000 g离心10 min,取上清液400 μl,加入钾盐溶液300 μl 后待测。采用高压液相色谱-电化学检测器检测。色谱条件：色谱柱为PhaseⅡTM(ODS,3.2×10 mm,Φ3 μm)，流动相(新鲜配制并经0.22 μm的滤膜过滤)为0.05 mol柠檬酸-0.05 mol醋酸钠-1.0 mmol辛烷基磺酸钠-5 mmol三乙胺-0.2 mol Na2-EDTA-10%甲醇，pH3.6，流量0.5 ml/min，检测器工作电压0.70 V，灵敏度5 nA，频率1.0 Hz，压力2 100±10 pa[4]。分别用DA、DOPAC、HAV、5-HIAA标准品绘制标准曲线。取样品液20 μl进样分析，CHEM-WIN软件自动测定DA、DOPAC、HAV、5-HIAA的含量。
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2 结果
对照组大鼠脑纹状体NaCl注射侧与注射对侧相比，第4、7、10、20天纹状体透析液及匀浆中DA、DOPAC、HVA、5-HIAA含量差异均无显著性。
染毒组大鼠脑纹状体MnCl2注射侧与注射对侧相比，第4、7、10、20天透析液中DA的含量分别降低了34.7%、43.3%、30.0%、44.1%；DOPAC的含量分别降低了86.2%、67.7%、77.7%、73.1%；HVA的含量分别降低了85.0%、67.1%、61.8%、58.7%；5-HIAA的含量分别降低了60.9%、13.2%、50.1%、9.4%。
给大鼠脑纹状体内注射MnCl2染毒20 d后，纹状体内多巴胺及其代谢产物含量测定结果见表1。注射侧与注射对侧相比，纹状体匀浆DA、DOPAC、HVA、5-HIAA的含量分别降低了15.5%、57.5%、53.1%、34.5%，统计学检验均有显著意义。
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表1 锰大鼠脑内注射染毒20 d后纹状体内多巴胺
及其代谢产物含量(nmol/g组织)
DA
DOPAC
HVA
5-HIAA
注射侧
3.33±0.11*
1.36±0.13**
1.12±0.11**
6.52±0.52**
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注射对侧
3.94±0.18
3.20±0.28
2.39±0.33
9.96±0.66
P<0.05，P<0.01；每组动物数=93 讨论
70年代起美国、加拿大开始使用有机锰化合物MMT替代四乙基铅作为汽油抗爆剂，我国近年来无铅汽油的应用亦越来越广泛，对环境锰暴露增加的潜在作用研究日益引起重视。锰对线粒体有特殊的亲和力，在富有线粒体的神经细胞和神经突触中，锰可抑制线粒体内三磷酸腺苷酶和溶酶体中的酸性磷酸酶活力，从而影响神经突触的传导能力。Zheng等[5]用MnCl2处理大鼠脑线粒体片段后发现锰可显著降低线粒体乌头酸酶活力；连续30 d腹腔注射染毒后，导致区域性乌头酸酶活力下降，其中前叶、纹状体、黑质的该酶活力分别降低48.5%、33.7%、20.6%；提示锰通过改变脑组织乌头酸酶活力，损害线粒体能量产生。Shen等[6]研究表明，锰可引起神经递质多巴胺自氧化并可选择性地引起黑质纹状体多巴胺能神经元变性，线粒体复合物Ⅰ功能缺陷，促进了多巴胺能神经元死亡。Chang等[7]应用N9细胞发现锰增加了具有神经毒性的NO生成，其原因为锰促进可诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA转录，使iNOS合成增加，神经毒性NO可损害神经元[7]；国内张本延等[8]的研究结果也支持这一观点。锰中毒死亡病例的苍白球和黑质纹状体内可见变性与死亡的神经细胞。本研究首次采用锰脑内注射染毒方式观察了大鼠染毒后纹状体内多巴胺及其代谢产物含量的变化。注射侧与注射对侧相比，纹状体匀浆DA、DOPAC、HVA、5-HIAA的含量均有显著降低。Desole等[9]认为酪氨酸在酪氨酸羟化酶作用下生成左旋多巴，左旋多巴在左旋多巴脱羧酶作用下生成多巴胺，多巴胺在单胺氧化酶作用下代谢成DOPAC，DOPAC在儿茶酚甲基转移酶作用下生成HVA。Sloot等[10]报道锰染毒可抑制酪氨酸羟化酶作用，减少左旋多巴的生成。Cuesta[11]报道锰可抑制NMDA-谷氨酸受体介导的突触前对多巴胺释放的调控。
, 百拇医药
本研究观察到的纹状体内DA、DOPAC、HVA、5-HIAA的含量显著降低可能与线粒体能量产生减弱、多巴胺能神经元变性与死亡、酪氨酸羟化酶作用受抑、突触前释放的调控改变有关。
本课题受北京市科技新星计划专项基金、北京市“跨世纪人才”计划专项基金、北京市卫生局科研基金、北京市卫生局首都医科大学“基础-临床合作”研究基金资助(95386499)
参考文献
[1] Mcmillan DE.A brief history of the neurobehavioral toxicity of manganese:some unanswered questions.Neurotoxicology,1999，20:499-507.
[2] Aschner M,Vrana KE,Zheng W.Manganese uptake and distribution in the central nervous system(CNS).Neurotoxicology,1999，20:173-180.
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[3] 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.北京：人民卫生出版社，1991.25-27.
[4] 叶惟玲.快速、灵敏检测生物样本中单胺类递质及其代谢产物的方法—反相色谱法-电化学分析法.色谱，1990，8：159-162.
[5] Zheng W,Ren S,Graziano JH.Manganese inhibits mitochondrial aconitase:a mechanism of manganese neurotoxicity.Brain Res,1998，799:334-342.
[6] Shen XM,Dryhurst G.Iron and manganese catalyzed autoxidation of dopamine in the presence of L-cysteine:possible insights into iron and manganese mediated dopaminergic neurotoxicity.Chem Res Toxicol,1998，11:824-837.
, http://www.100md.com
[7] Chang JY,Liu LZ.Manganese potentiates nitric oxide production by microglia.Brain Res Mol Brain Res,1999，68:22-28.
[8] 张本延，朱长才，叶方立，等.锰对仔鼠脑组织一氧化氮合酶活性的影响.卫生毒理学杂志，1999，13；255-257.
[9] Desole MS,Esposito G,Migheli R,et al.Glutathione deficiency potentiates manganese toxicity in rat striatum and brainstem and in PC12 cells.Pharmacol Res,1997，36:285-292.
[10] Sloot WN,van der Sluijs-Gelling AJ,Gramsbergen JB.Selective lesions by manganese and extensive damage by iron after injection into rat striatum or hippocampus.J Neurochem,1994，62:205-216.
[11] Cuesta MC.Autoreceptor presynaptic control of dopamine release from striatum is lost at early stages of manganese poisoning.Life Sci,1995，56:1857-1864.
(收稿日期：1999-11-04)
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单位：Zheng W(Columbia University School of Public Health)；徐群渊(首都医科大学神经科学研究所)；段春礼 王元身(首都医科大学神经科学研究所)；邓一夫 王悦 苏忆兰 李国君(首都医科大学预防医学系，100054)
关键词：
卫生毒理学杂志000417 锰中毒主要表现为锥体外系神经障碍，并可出现类似帕金森氏综合征的临床表现。近年来由于作为汽油抗爆剂的四乙基铅逐渐被三羰基甲基环戊二烯合锰(methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl,MMT)替代，造成环境中锰的含量逐渐升高，锰对健康的影响更加引起人们关注[1]。但迄今为止锰中毒的机制仍不十分清楚。目前采用动物实验进行的锰中毒研究中，染毒途径主要为腹腔注射或饮水中加入方式，由于血脑屏障的存在，锰通过转铁蛋白作为载体穿过血脑屏障的速度很慢[2]，且动物之间存在个体差异，实际作用于靶器官的浓度很难确定，从而在一定程度上影响了研究结果的推断。我们首次采用锰脑纹状体内注射染毒方式观察了大鼠染毒后纹状体内多巴胺及其代谢产物含量的变化。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 氯化锰(MnCl2*4H2O)，AR级，上海金山试剂厂生产；多巴胺(DA)、3，4-双羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)标准品，Sigma公司产品。
1.2 动物分组与处理 雌性SD大鼠(首都医科大学实验动物中心提供)18只，体重200～260 g，随机分为染毒组和对照组，每组9只。水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位仪上，根据大鼠脑立体定位图谱，确定大鼠纹状体坐标[3]。以1 μl/min速度用微量注射器对染毒组大鼠脑一侧纹状体内注射0.4 μmol MnCl26 μl，对照组注射生理盐水(NaCl) 6 μl，术后自由进食饮水。
1.3 观察指标与方法 检测指标为单胺类递质多巴胺(DA)及其代谢产物DOPAC、HVA、5-HIAA。脑内注射染毒后第4、7、10、20天，将动物麻醉后固定于脑立体定位仪上，将同一微透析探针先后插入左、右侧纹状体，用人工脑脊液以1 μl/min 的速度灌流，灌流稳定60 min 后，冰浴条件下每25 min收集一份透析液样品待测。脑内注射20 d后断头处死大鼠，冰浴中迅速分离出左、右纹状体，精确称量后，加入0.4 mol 高氯酸0.4 ml制备匀浆，台式低温冷冻离心机(1～4 ℃)12 000 g离心10 min,取上清液400 μl,加入钾盐溶液300 μl 后待测。采用高压液相色谱-电化学检测器检测。色谱条件：色谱柱为PhaseⅡTM(ODS,3.2×10 mm,Φ3 μm)，流动相(新鲜配制并经0.22 μm的滤膜过滤)为0.05 mol柠檬酸-0.05 mol醋酸钠-1.0 mmol辛烷基磺酸钠-5 mmol三乙胺-0.2 mol Na2-EDTA-10%甲醇，pH3.6，流量0.5 ml/min，检测器工作电压0.70 V，灵敏度5 nA，频率1.0 Hz，压力2 100±10 pa[4]。分别用DA、DOPAC、HAV、5-HIAA标准品绘制标准曲线。取样品液20 μl进样分析，CHEM-WIN软件自动测定DA、DOPAC、HAV、5-HIAA的含量。
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2 结果
对照组大鼠脑纹状体NaCl注射侧与注射对侧相比，第4、7、10、20天纹状体透析液及匀浆中DA、DOPAC、HVA、5-HIAA含量差异均无显著性。
染毒组大鼠脑纹状体MnCl2注射侧与注射对侧相比，第4、7、10、20天透析液中DA的含量分别降低了34.7%、43.3%、30.0%、44.1%；DOPAC的含量分别降低了86.2%、67.7%、77.7%、73.1%；HVA的含量分别降低了85.0%、67.1%、61.8%、58.7%；5-HIAA的含量分别降低了60.9%、13.2%、50.1%、9.4%。
给大鼠脑纹状体内注射MnCl2染毒20 d后，纹状体内多巴胺及其代谢产物含量测定结果见表1。注射侧与注射对侧相比，纹状体匀浆DA、DOPAC、HVA、5-HIAA的含量分别降低了15.5%、57.5%、53.1%、34.5%，统计学检验均有显著意义。
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表1 锰大鼠脑内注射染毒20 d后纹状体内多巴胺
及其代谢产物含量(nmol/g组织)
DA
DOPAC
HVA
5-HIAA
注射侧
3.33±0.11*
1.36±0.13**
1.12±0.11**
6.52±0.52**
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注射对侧
3.94±0.18
3.20±0.28
2.39±0.33
9.96±0.66
P<0.05，P<0.01；每组动物数=93 讨论
70年代起美国、加拿大开始使用有机锰化合物MMT替代四乙基铅作为汽油抗爆剂，我国近年来无铅汽油的应用亦越来越广泛，对环境锰暴露增加的潜在作用研究日益引起重视。锰对线粒体有特殊的亲和力，在富有线粒体的神经细胞和神经突触中，锰可抑制线粒体内三磷酸腺苷酶和溶酶体中的酸性磷酸酶活力，从而影响神经突触的传导能力。Zheng等[5]用MnCl2处理大鼠脑线粒体片段后发现锰可显著降低线粒体乌头酸酶活力；连续30 d腹腔注射染毒后，导致区域性乌头酸酶活力下降，其中前叶、纹状体、黑质的该酶活力分别降低48.5%、33.7%、20.6%；提示锰通过改变脑组织乌头酸酶活力，损害线粒体能量产生。Shen等[6]研究表明，锰可引起神经递质多巴胺自氧化并可选择性地引起黑质纹状体多巴胺能神经元变性，线粒体复合物Ⅰ功能缺陷，促进了多巴胺能神经元死亡。Chang等[7]应用N9细胞发现锰增加了具有神经毒性的NO生成，其原因为锰促进可诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA转录，使iNOS合成增加，神经毒性NO可损害神经元[7]；国内张本延等[8]的研究结果也支持这一观点。锰中毒死亡病例的苍白球和黑质纹状体内可见变性与死亡的神经细胞。本研究首次采用锰脑内注射染毒方式观察了大鼠染毒后纹状体内多巴胺及其代谢产物含量的变化。注射侧与注射对侧相比，纹状体匀浆DA、DOPAC、HVA、5-HIAA的含量均有显著降低。Desole等[9]认为酪氨酸在酪氨酸羟化酶作用下生成左旋多巴，左旋多巴在左旋多巴脱羧酶作用下生成多巴胺，多巴胺在单胺氧化酶作用下代谢成DOPAC，DOPAC在儿茶酚甲基转移酶作用下生成HVA。Sloot等[10]报道锰染毒可抑制酪氨酸羟化酶作用，减少左旋多巴的生成。Cuesta[11]报道锰可抑制NMDA-谷氨酸受体介导的突触前对多巴胺释放的调控。
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本研究观察到的纹状体内DA、DOPAC、HVA、5-HIAA的含量显著降低可能与线粒体能量产生减弱、多巴胺能神经元变性与死亡、酪氨酸羟化酶作用受抑、突触前释放的调控改变有关。
本课题受北京市科技新星计划专项基金、北京市“跨世纪人才”计划专项基金、北京市卫生局科研基金、北京市卫生局首都医科大学“基础-临床合作”研究基金资助(95386499)
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[5] Zheng W,Ren S,Graziano JH.Manganese inhibits mitochondrial aconitase:a mechanism of manganese neurotoxicity.Brain Res,1998，799:334-342.
[6] Shen XM,Dryhurst G.Iron and manganese catalyzed autoxidation of dopamine in the presence of L-cysteine:possible insights into iron and manganese mediated dopaminergic neurotoxicity.Chem Res Toxicol,1998，11:824-837.
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[7] Chang JY,Liu LZ.Manganese potentiates nitric oxide production by microglia.Brain Res Mol Brain Res,1999，68:22-28.
[8] 张本延，朱长才，叶方立，等.锰对仔鼠脑组织一氧化氮合酶活性的影响.卫生毒理学杂志，1999，13；255-257.
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[10] Sloot WN,van der Sluijs-Gelling AJ,Gramsbergen JB.Selective lesions by manganese and extensive damage by iron after injection into rat striatum or hippocampus.J Neurochem,1994，62:205-216.
[11] Cuesta MC.Autoreceptor presynaptic control of dopamine release from striatum is lost at early stages of manganese poisoning.Life Sci,1995，56:1857-1864.
(收稿日期：1999-11-04)
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