砷对肝脏补体抑制活性的影响及硒的拮抗效应
作者：郑金平 祝寿芬 刘慧荣
单位：刘慧荣(山西医科大学生理教研室)；郑金平 祝寿芬(山西医科大学卫生毒理教研室，太原 030001)
关键词：
卫生毒理学杂志000411 资料表明，砷可影响机体的免疫系统，引起机体免疫功能紊乱，在肿瘤发生发展中起重要作用[1～4]。补体作为一重要的免疫因子，在肿瘤免疫中起着重要作用[5]。补体的激活过程，受补体抑制因子等调节因素的调节。目前，国内外研究焦点多集中在砷对机体特异性细胞免疫和体液免疫功能的影响，而在砷对非特异性免疫的主要因子补体及其抑制因子影响方面研究很少，本研究用砷中毒模型研究砷对肝脏匀浆补体抑制水平的影响，旨在进一步阐明砷的毒作用机制，为砷中毒的防治提供依据。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 主要试剂 三氧化二砷(As2O3)，分析纯，北京化工厂生产。康强硒，主要成分为有机硒，山西康强硒制药有限公司提供。
1.2 实验动物与分组 选用Wistar大鼠(由山西医科大学实验动物中心提供)32只，体重(170±20) g，每组8只，雌雄各半。随机分为(1)对照组(蒸馏水)；(2)染砷组(4.6 mgAs2O3/kg)；(3)砷+康强硒①组(4.6 mgAs2O3/kg+100 μgSe3+/kg)；(4)砷+康强硒②组(4.6 mgAs2O3/kg+200 μgSe3+/kg)。经口灌胃5周。
1.3 样品采集 断头处死动物，迅速取出肝脏，沾去血迹，称重，加等量生理盐水，制成匀浆，1 000 r/min离心10 min，取上清，-20 ℃保存，使用时按1∶10稀释。
, 百拇医药
1.4 补体抑制活性的测定 参照刘慧荣[5]介绍的方法制备致敏绵羊红细胞(SRBC)悬液、补体。应用Micro ELISA板作为标本载体进行操作，以75%溶血率(CH75)作为基础溶血率，在原有反应物中加入肝匀浆上清，参照刘慧荣[5]介绍方法进行加样。各反应物加完后充分混匀，37 ℃水浴60 min，2 000 r/min离心10 min，取上清100 μl 移于另一洁净的Micro EL1SA板中，用光密度仪在410 nm处测定每一孔的A值，实验孔的A值减去相应的空白对照及相应实验对照的A值，即为实验孔的实际A值。实验每次平行3孔，每份标本重复两次测定，结果取均值。根据公式(1)、(2)计算溶血率和补体抑制率。
溶血率%=(A(CH75对照孔或实验孔))/(A(CH100对照孔))×100
(1)
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抑制率%=[1-(溶血率%+(C+GSQ))/(溶血率%(CH75孔))]×100
(2)
*C=补体，GSQ=肝匀浆上清。
1.5 资料处理及结果分析 本研究数据为百分数，经平方根反正弦变换后进行方差分析和Q检验。
1.6 流式细胞仪检测肝细胞增殖周期 断头处死动物，取肝脏，体积分数为0.05%的胰蛋白酶(Sigma公司产品)消化制备肝细胞悬液(细胞数为2×106/ml)，50 μg/ml碘化丙啶(PI)4 ℃染色1 h，FACS Calibur流式细胞仪检测，Cellqust软件下收集10 000个细胞，在Midfit下分析数据，根据DNA含量进行细胞周期分析。
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2 结果
2.1 砷及砷硒对肝脏补体抑制率的影响 染砷组肝细胞匀浆上清(1∶10)补体抑制率为(47.74±3.56)%，显著高于对照组(P<0.05)；砷+硒②组则比砷组显著下降(P<0.05)，与对照组比，差异无显著性(P>0.05)。结果表明，砷可导致肝匀浆上清补体抑制率升高，200 μg/kg硒对此毒性有拮抗作用。
表1 砷及砷硒对肝脏补体抑制率的影响(x±s) 组 别
剂 量
补体抑制率
(%)
对照组
1 ml/kg
16.25±0.75
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砷组
4.6 mg/kg
47.74±3.56a
砷+硒①组
4.6 mg/kg+100 μg/kg
50.94±4.34a
砷+硒②组
4.6 mg/kg+200 μg/kg
20.47±5.09b,c
a：与对照组差异有显著性，P<0.05；b:与砷组差异有显著性，P<0.05；c：与砷+硒1组差异有显著性，P<0.05
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2.2 砷对肝脏细胞增殖周期的影响 染砷组肝脏G0/G1期细胞比对照组显著减少，S、G2-M期细胞显著增多(P<0.05)，显示肝细胞增生。而100、200 μg/kg硒均可使染砷大鼠肝脏G0/G1期细胞显著增多，S、G2-M期细胞显著减少(P<0.05)，呈现拮抗效应，其中200 μg/kg硒组G0/G1期、S期比100 μg/kg 组变化更明显，二者差异有显著性。
3 讨论
3.1 砷对肝匀浆上清补体抑制率的影响及机制 研究表明，砷的潜在致癌机制是多方面的，砷的致突变作用、促癌效
表2 砷染毒和补硒对肝脏细胞增殖周期的影响 组别
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剂量
G0/G1期
S期
G2-M期
对照组
1 ml/kg
93.57±4.22
2.34±1.81
4.62±4.52
砷组
4.6 mg/kg
55.26±3.96a
, 百拇医药
10.28±4.37a
34.46±5.93a
砷+硒①组
4.6 mg/kg+100 μg/kg
69.45±8.21a、b
10.16±3.85a
16.25±2.80a、b
砷+硒②组
4.6 mg/kg+200 μg/kg
81.28±8.91a、b、c
, http://www.100md.com
4.34±2.18b、c
10.92±4.66b
a:与对照组差异有显著性，P<0.05；b：与砷组差异有显著性，P<0.05；C：与砷+硒①组差异有显著性，P<0.05
应及砷对免疫功能的影响，都与砷的致癌机制有关[1～4]。补体是机体中一类重要的免疫反应因子，具有酶的活性，一旦激活即可产生一系列的连锁反应，最终形成大分子攻膜复合物(MAC)，从而引起相应靶细胞的溶解。它们与免疫系统中体液和细胞成分相互作用，以排除外来异物和自身的突变细胞。在肿瘤免疫中，补体可介导细胞毒抗体直接杀伤肿瘤细胞。MAC在补体的细胞溶解作用中起着决定性作用，体内存在着许多调节因子，对补体反应的前端和终末阶段严密调控，以维持补体的自稳状态。调节因子数量和活性的改变均可造成自稳状态的破坏，从而影响补体的作用，甚至起到严重结果。补体抑制因子主要由肝脏细胞产生[6]，当肝细胞受到砷毒性作用时，其功能势必产生改变。
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本研究表明，砷使肝匀浆上清的补体抑制水平显著升高，其意义可能有助于砷导致的肝细胞增生时，突变细胞的免疫逃避。我们用流式细胞技术对染砷大鼠肝细胞增殖周期进行了测定，发现，G0/G1期细胞比对照组显著减少，S期G2-M期细胞显著增多，显示肝脏处于增生状态。也有人研究表明，长期低剂量砷可促进T淋巴细胞和皮肤组织的增生作用[4，7]。增殖反应可能是癌前病变发生和发展的基础。机体的免疫系统会针对突变细胞产生免疫反应以达到生理自稳，其主要方式是产生针对突变细胞的抗体，并在补体和巨噬细胞的协助下达到清除的目的。但由于砷可诱导补体抑制水平的升高，会使免疫反应脱偶联，最终使机体消灭突变细胞的能力大大下降。
砷导致肝脏匀浆上清补体抑制率升高的机制尚不清楚。有研究表明，砷对DNA和蛋白质的合成呈双向作用，大剂量砷可抑制DNA和蛋白质的合成，而小剂量砷则有促进作用[2]。在同一剂量下，也可表现出对某些蛋白质的合成有促进作用，而对另一些则有抑制作用。砷可能促进某些因子在肝脏的合成，从而表现出肝匀浆上清补体抑制率的升高。另外，某些突变细胞或早期肿瘤细胞也可表达补体抑制因子。Kumar等[8]在研究肿瘤对补体的杀伤作用时发现，肿瘤细胞对补体杀伤有着天然抵抗力，原因之一是某些肿瘤细胞可以产生一系列灭活补体物质(CD59)，同时可过度表达补体抑制因子DAF和SP40/40。还有研究表明[9]，肿瘤细胞还可表达膜C3b裂解蛋白酶P65，造成C5转化酶不能形成，从而抑制补体攻膜复合物(MAC)的组装，这可能是肿瘤细胞逃避补体防御机制的主要原因。补体抑制率的升高可能部分来源于肝突变细胞的表达，而砷又可诱导细胞增生，促进某些补体抑制因子的合成，而后者又可使突变细胞免于免疫损伤，二者在砷的致癌过程中起着重要作用。
, 百拇医药
3.2 硒对砷的拮抗效应 染砷大鼠同时给予100-200 μg Se3+/kg，可使肝脏G0/G1期细胞比染砷组显著增多，S期和G2-M期显著减少，肝细胞增生被抑制。同时，肝细胞匀浆上清补体抑制率也显著下降，二者趋势是一致的。表明硒可有效拮抗砷对肝细胞增生和补体抑制率的影响，这种拮抗效应为砷中毒的防治提供了依据。
参考文献
[1] 张波，孟紫强.砷的致癌、致畸及致突变作用研究进展.癌变*畸变*突变.1997，9：封二、封三.
[2] 孟紫强.砷的分子毒理学研究进展.癌变*畸变*突变，1997，9：324-326.
[3] 夏雅娟，丁士辉.地方性砷中毒的远期致癌效应.内蒙古地方病防治研究，1995，20：183-185.
, 百拇医药
[4] 刘佳，吴克枫，俞江.三氧化二砷对小鼠免疫功能的影响.中国地方病学杂志，1998，17：281-283.
[5] 刘慧荣，郑振群，马爱英.人精浆补体抑制作用及其意义研究.中华流行病学杂志，1998，10：414-418.
[6] 赵修竹，主编.补体学.武汉：湖北科学技术出版社，1998.170-172.
[7] 乌日娜，朱学骏，郑风兰.地方性砷中毒皮肤损害的表皮细胞DNA含量的流式细胞光度分析.内蒙古地方病防治研究，1994，19(增刊)：27-29.
[8] Sanjay Kumar,James M Vinci,Barbara A Pytel,et al.Expression of messenger RNAS for complement inhibitory in human tissues and tumors.Cancer Res,1993,53:348-353.
[9] Markus W Ollert,Joseph V kadlec,Eugene C Petrella,et al.Molecular basis of complement resistance of human melanoma cell expressing the C3-cleaning membrance protease P65.Cancer Res,1993,53:592-599.
(修回日期：2000-01-25), 百拇医药
单位：刘慧荣(山西医科大学生理教研室)；郑金平 祝寿芬(山西医科大学卫生毒理教研室，太原 030001)
关键词：
卫生毒理学杂志000411 资料表明，砷可影响机体的免疫系统，引起机体免疫功能紊乱，在肿瘤发生发展中起重要作用[1～4]。补体作为一重要的免疫因子，在肿瘤免疫中起着重要作用[5]。补体的激活过程，受补体抑制因子等调节因素的调节。目前，国内外研究焦点多集中在砷对机体特异性细胞免疫和体液免疫功能的影响，而在砷对非特异性免疫的主要因子补体及其抑制因子影响方面研究很少，本研究用砷中毒模型研究砷对肝脏匀浆补体抑制水平的影响，旨在进一步阐明砷的毒作用机制，为砷中毒的防治提供依据。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 主要试剂 三氧化二砷(As2O3)，分析纯，北京化工厂生产。康强硒，主要成分为有机硒，山西康强硒制药有限公司提供。
1.2 实验动物与分组 选用Wistar大鼠(由山西医科大学实验动物中心提供)32只，体重(170±20) g，每组8只，雌雄各半。随机分为(1)对照组(蒸馏水)；(2)染砷组(4.6 mgAs2O3/kg)；(3)砷+康强硒①组(4.6 mgAs2O3/kg+100 μgSe3+/kg)；(4)砷+康强硒②组(4.6 mgAs2O3/kg+200 μgSe3+/kg)。经口灌胃5周。
1.3 样品采集 断头处死动物，迅速取出肝脏，沾去血迹，称重，加等量生理盐水，制成匀浆，1 000 r/min离心10 min，取上清，-20 ℃保存，使用时按1∶10稀释。
, 百拇医药
1.4 补体抑制活性的测定 参照刘慧荣[5]介绍的方法制备致敏绵羊红细胞(SRBC)悬液、补体。应用Micro ELISA板作为标本载体进行操作，以75%溶血率(CH75)作为基础溶血率，在原有反应物中加入肝匀浆上清，参照刘慧荣[5]介绍方法进行加样。各反应物加完后充分混匀，37 ℃水浴60 min，2 000 r/min离心10 min，取上清100 μl 移于另一洁净的Micro EL1SA板中，用光密度仪在410 nm处测定每一孔的A值，实验孔的A值减去相应的空白对照及相应实验对照的A值，即为实验孔的实际A值。实验每次平行3孔，每份标本重复两次测定，结果取均值。根据公式(1)、(2)计算溶血率和补体抑制率。
溶血率%=(A(CH75对照孔或实验孔))/(A(CH100对照孔))×100
(1)
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抑制率%=[1-(溶血率%+(C+GSQ))/(溶血率%(CH75孔))]×100
(2)
*C=补体，GSQ=肝匀浆上清。
1.5 资料处理及结果分析 本研究数据为百分数，经平方根反正弦变换后进行方差分析和Q检验。
1.6 流式细胞仪检测肝细胞增殖周期 断头处死动物，取肝脏，体积分数为0.05%的胰蛋白酶(Sigma公司产品)消化制备肝细胞悬液(细胞数为2×106/ml)，50 μg/ml碘化丙啶(PI)4 ℃染色1 h，FACS Calibur流式细胞仪检测，Cellqust软件下收集10 000个细胞，在Midfit下分析数据，根据DNA含量进行细胞周期分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 砷及砷硒对肝脏补体抑制率的影响 染砷组肝细胞匀浆上清(1∶10)补体抑制率为(47.74±3.56)%，显著高于对照组(P<0.05)；砷+硒②组则比砷组显著下降(P<0.05)，与对照组比，差异无显著性(P>0.05)。结果表明，砷可导致肝匀浆上清补体抑制率升高，200 μg/kg硒对此毒性有拮抗作用。
表1 砷及砷硒对肝脏补体抑制率的影响(x±s) 组 别
剂 量
补体抑制率
(%)
对照组
1 ml/kg
16.25±0.75
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砷组
4.6 mg/kg
47.74±3.56a
砷+硒①组
4.6 mg/kg+100 μg/kg
50.94±4.34a
砷+硒②组
4.6 mg/kg+200 μg/kg
20.47±5.09b,c
a：与对照组差异有显著性，P<0.05；b:与砷组差异有显著性，P<0.05；c：与砷+硒1组差异有显著性，P<0.05
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2.2 砷对肝脏细胞增殖周期的影响 染砷组肝脏G0/G1期细胞比对照组显著减少，S、G2-M期细胞显著增多(P<0.05)，显示肝细胞增生。而100、200 μg/kg硒均可使染砷大鼠肝脏G0/G1期细胞显著增多，S、G2-M期细胞显著减少(P<0.05)，呈现拮抗效应，其中200 μg/kg硒组G0/G1期、S期比100 μg/kg 组变化更明显，二者差异有显著性。
3 讨论
3.1 砷对肝匀浆上清补体抑制率的影响及机制 研究表明，砷的潜在致癌机制是多方面的，砷的致突变作用、促癌效
表2 砷染毒和补硒对肝脏细胞增殖周期的影响 组别
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剂量
G0/G1期
S期
G2-M期
对照组
1 ml/kg
93.57±4.22
2.34±1.81
4.62±4.52
砷组
4.6 mg/kg
55.26±3.96a
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10.28±4.37a
34.46±5.93a
砷+硒①组
4.6 mg/kg+100 μg/kg
69.45±8.21a、b
10.16±3.85a
16.25±2.80a、b
砷+硒②组
4.6 mg/kg+200 μg/kg
81.28±8.91a、b、c
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4.34±2.18b、c
10.92±4.66b
a:与对照组差异有显著性，P<0.05；b：与砷组差异有显著性，P<0.05；C：与砷+硒①组差异有显著性，P<0.05
应及砷对免疫功能的影响，都与砷的致癌机制有关[1～4]。补体是机体中一类重要的免疫反应因子，具有酶的活性，一旦激活即可产生一系列的连锁反应，最终形成大分子攻膜复合物(MAC)，从而引起相应靶细胞的溶解。它们与免疫系统中体液和细胞成分相互作用，以排除外来异物和自身的突变细胞。在肿瘤免疫中，补体可介导细胞毒抗体直接杀伤肿瘤细胞。MAC在补体的细胞溶解作用中起着决定性作用，体内存在着许多调节因子，对补体反应的前端和终末阶段严密调控，以维持补体的自稳状态。调节因子数量和活性的改变均可造成自稳状态的破坏，从而影响补体的作用，甚至起到严重结果。补体抑制因子主要由肝脏细胞产生[6]，当肝细胞受到砷毒性作用时，其功能势必产生改变。
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本研究表明，砷使肝匀浆上清的补体抑制水平显著升高，其意义可能有助于砷导致的肝细胞增生时，突变细胞的免疫逃避。我们用流式细胞技术对染砷大鼠肝细胞增殖周期进行了测定，发现，G0/G1期细胞比对照组显著减少，S期G2-M期细胞显著增多，显示肝脏处于增生状态。也有人研究表明，长期低剂量砷可促进T淋巴细胞和皮肤组织的增生作用[4，7]。增殖反应可能是癌前病变发生和发展的基础。机体的免疫系统会针对突变细胞产生免疫反应以达到生理自稳，其主要方式是产生针对突变细胞的抗体，并在补体和巨噬细胞的协助下达到清除的目的。但由于砷可诱导补体抑制水平的升高，会使免疫反应脱偶联，最终使机体消灭突变细胞的能力大大下降。
砷导致肝脏匀浆上清补体抑制率升高的机制尚不清楚。有研究表明，砷对DNA和蛋白质的合成呈双向作用，大剂量砷可抑制DNA和蛋白质的合成，而小剂量砷则有促进作用[2]。在同一剂量下，也可表现出对某些蛋白质的合成有促进作用，而对另一些则有抑制作用。砷可能促进某些因子在肝脏的合成，从而表现出肝匀浆上清补体抑制率的升高。另外，某些突变细胞或早期肿瘤细胞也可表达补体抑制因子。Kumar等[8]在研究肿瘤对补体的杀伤作用时发现，肿瘤细胞对补体杀伤有着天然抵抗力，原因之一是某些肿瘤细胞可以产生一系列灭活补体物质(CD59)，同时可过度表达补体抑制因子DAF和SP40/40。还有研究表明[9]，肿瘤细胞还可表达膜C3b裂解蛋白酶P65，造成C5转化酶不能形成，从而抑制补体攻膜复合物(MAC)的组装，这可能是肿瘤细胞逃避补体防御机制的主要原因。补体抑制率的升高可能部分来源于肝突变细胞的表达，而砷又可诱导细胞增生，促进某些补体抑制因子的合成，而后者又可使突变细胞免于免疫损伤，二者在砷的致癌过程中起着重要作用。
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3.2 硒对砷的拮抗效应 染砷大鼠同时给予100-200 μg Se3+/kg，可使肝脏G0/G1期细胞比染砷组显著增多，S期和G2-M期显著减少，肝细胞增生被抑制。同时，肝细胞匀浆上清补体抑制率也显著下降，二者趋势是一致的。表明硒可有效拮抗砷对肝细胞增生和补体抑制率的影响，这种拮抗效应为砷中毒的防治提供了依据。
参考文献
[1] 张波，孟紫强.砷的致癌、致畸及致突变作用研究进展.癌变*畸变*突变.1997，9：封二、封三.
[2] 孟紫强.砷的分子毒理学研究进展.癌变*畸变*突变，1997，9：324-326.
[3] 夏雅娟，丁士辉.地方性砷中毒的远期致癌效应.内蒙古地方病防治研究，1995，20：183-185.
, 百拇医药
[4] 刘佳，吴克枫，俞江.三氧化二砷对小鼠免疫功能的影响.中国地方病学杂志，1998，17：281-283.
[5] 刘慧荣，郑振群，马爱英.人精浆补体抑制作用及其意义研究.中华流行病学杂志，1998，10：414-418.
[6] 赵修竹，主编.补体学.武汉：湖北科学技术出版社，1998.170-172.
[7] 乌日娜，朱学骏，郑风兰.地方性砷中毒皮肤损害的表皮细胞DNA含量的流式细胞光度分析.内蒙古地方病防治研究，1994，19(增刊)：27-29.
[8] Sanjay Kumar,James M Vinci,Barbara A Pytel,et al.Expression of messenger RNAS for complement inhibitory in human tissues and tumors.Cancer Res,1993,53:348-353.
[9] Markus W Ollert,Joseph V kadlec,Eugene C Petrella,et al.Molecular basis of complement resistance of human melanoma cell expressing the C3-cleaning membrance protease P65.Cancer Res,1993,53:592-599.
(修回日期：2000-01-25), 百拇医药