氯丙烯对神经细胞NO、MDA、GSH含量和NOS、SOD活性的影响
作者：谢克勤 赵丽 张旻 孙克任 阮迪云
单位：阮迪云(中国科技大学生命科学学院神经毒理实验室)；谢克勤 赵丽 张旻 孙克任(山东医科大学毒理学省级重点实验室，济南 250012)
关键词：
卫生毒理学杂志000407 氯丙烯(allyl chloride)为不饱和氯代脂肪烃类化合物，有高度挥发性，是生产聚丙烯酰胺、环氧氯丙烷和某些农药等物质的重要化工原料。我国自70年代起发现长期低浓度接触可引起神经衰弱综合征和对称性轴突变性型周围神经病[1，2]。动物超微神经病理观察发现神经轴浆内微管(microtubules, MT)和神经丝(neurofilaments, NF)大量堆积，单位面积内数量明显减少[3]。这种病理改变与Ca2+增加导致MT和NF的受损有关[4]。自由基可引起细胞损伤[5]。然而，氯丙烯是否能引起细胞内抗氧化系统和一氧化氮(NO)的改变，这些改变与Ca2+增加是否有关，为此，我们选择NO、一氧化氮合酶(NO synthase, NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)为研究指标，探讨氯丙烯引起的钙稳态失调与NO和细胞过氧化之间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药品和仪器 氯丙烯由上海试剂一厂生产。Eagle 培养液(美国GIBCO公司)。UV-120-2型分光光度计(日本岛津)。NO、MDA、GSH、NOS、SOD测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 鸡胚脑神经细胞原代培养 根据赵林普等[6]报告的方法，用海兰鸡种蛋37 ℃恒温箱中孵育7 d，无菌条件下，取下头部，用镊子取出脑组织，剥离脑膜，用200目铜网机械分离成5 ×106 cells/ml的细胞悬液，接种1 ml到涂有鼠尾胶的培养瓶内，加4 ml全Eagle培养液，橡皮塞塞紧，37 ℃培养5 d后加入氯丙烯，其浓度为0.306、0.613和1.225 mmol/L，每一剂量组至少10瓶细胞。24 h后，将细胞用橡胶片轻轻刮下，移入离心管1 000 g离心10 min，去培养液后迅速将带细胞的离心管放入-20 ℃冷冻。
, 百拇医药
1.3 NO、MDA、GSH含量和NOS、SOD活性测定 将细胞反复冻融3次使细胞破碎，根据试剂盒要求进行操作，用UV-120-2型分光光度计分别测定吸光度，根据公式计算NO、MDA、GSH含量和NOS、SOD活性。细胞外直接用细胞培养液测定。蛋白含量测定用Bradford法。
2 结果
2.1 鸡胚脑神经细胞NO含量和NOS活性改变 鸡胚脑神经细胞内NO含量随氯丙烯浓度增高而增加，低、中、高3个剂量组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.01)；细胞培养液中NO含量无明显改变，低、中、高3个剂量组与对照相比，差异无显著性(P>0.05)。随氯丙烯浓度增高细胞内外NOS活性增加不明显，仅有高剂量组与对照组相比，差异有显著性(P<0.01)。结果见表1。
表1 氯丙烯引起鸡胚脑神经细胞内外NO含量和NOS活性改变(
±s) 浓度
, 百拇医药
(mmol/L)
细胞外NO
(μmol/L)
细胞内NO
(μmol/L)
细胞外NOS
(U/ml)
细胞内NOS
(U/mg.protein)
0
118.52±3.37
3.17±0.89
, http://www.100md.com
16.22±1.81
3.93±0.86
0.306
116.98±4.60
4.63±0.37* *
18.74±2.83
4.66±1.03
0.613
118.04±8.06
4.65±0.19* *
17.72±2.32
, 百拇医药
4.85±1.51*
1.225
115.84±3.94
5.95±0.22* *
19.96±3.32* *
4.88±1.05* *
与对照组比较，P<0.05，**P<0.01;n=10(细胞内NOSn=20)
2.2 鸡胚脑神经细胞MDA、GSH含量的改变 细胞MDA含量随氯丙烯浓度增高而含量明显降低，低、中、高3个剂量组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.01)，并表现明显的剂量-效应关系。培养液和细胞GSH含量随氯丙烯浓度增高呈降低趋势，培养液仅有高剂量组与对照组相比，差异有显著性(P<0.01)。细胞GSH中、高剂量组与对照组相比，差异有显著性(P<0.05，P<0.01)。结果见表2。
, 百拇医药
表2 氯丙烯引起鸡胚脑神经细胞内外MDA、GSH含量的改变(±s) 浓度
(mmol/L)
MDA
(nmol/ml)
细胞外GSH
(mg/L)
细胞GSH
(μg/5×106细胞)
0
12.57±1.46
, 百拇医药
4.27±0.40
8.98±0.77
0.306
9.46±1.93**
4.32±0.73
9.21±0.48
0.613
8.75±1.84**
4.27±0.45
8.16±0.72**
1.225
, 百拇医药
5.99±0.96**
3.37±0.16**
5.59±0.33**
与对照组比较，P<0.01；n=102.3 鸡胚脑神经细胞SOD活性改变 细胞SOD活性随氯丙烯浓度增高而明显降低，低、中、高3个剂量组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.05,P<0.01)，并有明显的剂量-效应关系。CuZn-SOD活性降低比T-SOD活性降低有明显的剂量-效应关系。CuZn-SOD活性降低比T-SOD活性降低明显，同时CuZn-SOD活性降低3个剂量组与对照组相比，差异均非常显著(P<0.01)，结果见表3。
表3 氯丙烯引起鸡胚脑神经细胞SOD活性改变(±s) 浓度
, 百拇医药
(mmol/L)
T-SOD
(NU/ml)
百分率
(%)
CuZn-SOD
(NU/ml)
百分率
(%)
0
65.83±12.86
100.0
57.91±12.79
, 百拇医药
100.0
0.306
54.25±8.68*
82.4
34.95±16.25**
60.4
0.613
50.88±15.84*
77.3
27.58±4.05**
47.6
, http://www.100md.com
1.225
43.80±7.33**
66.5
15.99±3.45**
27.6
与对照组比较，P<0.05,**P<0.01;n=10;T-SOD=总SOD活性；CuZn-SOD=铜锌SOD活性；NU/ml=亚硝酸盐单位/ml3 讨论
我国自70年代起发现长期低浓度接触氯丙烯可引起神经衰弱综合征和对称性轴突变性型周围神经病[1，2]。动物超微神经病理观察有神经轴浆内MT和NF大量变性堆积[3]。这种病理改变与Ca2+增加导致MT和NF的受损有关[4]。然而，氯丙烯是否能引起细胞内抗氧化系统和NO的改变，这些改变与Ca2+增加是否有关，诸如此类的问题，文献报道较少。探讨氯丙烯对细胞内过氧化和NO的影响将增加我们对氯丙烯引起的中毒性周围神经病发病机制的认识。
, http://www.100md.com
NO是一种自由基性质的气体，具有独特的理化特性和多种生物学功能，如松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集等。然而，NO也可产生毒性作用。过高浓度长时间作用，NO可作用于肽链巯基使甘油醛-3-磷酸脱氢酶发生ADP-核糖基化、使谷胱甘肽过氧化物酶失活；可抑制非血红素铁-硫酶，如线粒体和细胞浆中的顺乌头酸酶、线粒体呼吸链中的NADH-氢醌氧化还原酶、琥珀酸-氢醌氧化还原酶，从而抑制线粒体呼吸和能量代谢；可使SOD分子内的酪氨酸硝基化，使SOD失活。催化NO生物合成的酶为NOS。NOS的亚型有3种，分别为神经元型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS)。由于nNOS和eNOS在细胞处于生理状态下即有表达，又合称为结构型NOS(cNOS)。cNOS活性受Ca2+浓度调节。当Ca2+进入细胞与钙调蛋白(CaM)结合形成Ca2+-CaM复合物，与cNOS结合导致cNOS激活，使其活性增加，NO合成增加[7，8]。本次研究结果显示，氯丙烯染毒的细胞内NO含量与对照相比明显增加，并表现明显的剂量-效应关系。细胞内NOS活性的改变，尽管没有NO那样显著，但也有随氯丙烯浓度的增高而有增高的趋势。NO含量和NOS活性的增加与我们以前报道的氯丙烯可引起细胞内Ca2+增高的结果相吻合[4]，表明氯丙烯引起的细胞内Ca2+增高与NO含量和NOS活性的增加有关。这可能由于细胞内Ca2+增高，激活cNOS，使其活性增强，导致NO生成增加。
, 百拇医药
SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。高等动物体内有两种SOD，一种是CuZn-SOD，另一种是Mn-SOD，两者之和等于T-SOD[9]。本次对细胞内T-SOD和CuZn-SOD进行了研究，结果显示T-SOD和CuZn-SOD活性明显下降，CuZn-SOD活性下降比T-SOD活性下降幅度要大。表明氯丙烯对CuZn-SOD活性的影响比对Mn-SOD活性的影响大而且明显。这可能是氯丙烯本身的直接作用，使SOD活性下降；也可能是由于NO过多，导致SOD的酪氨酸硝基化，使SOD失活。GSH也能清除自由基，稳定巯基酶，防止受氧化损伤，并能结合毒物，加速代谢。GSH含量可衡量机体的抗氧化能力[8，9]。本次结果显示细胞内外GSH含量在高剂量组才明显降低，表明氯丙烯对GSH的影响不如CuZn-SOD明显。MDA是脂质过氧化的产物，它的含量的多少可反映机体内脂质过氧化的程度。本次结果显示MDA随氯丙烯浓度增加而含量显著降低，并有明显的剂量-效应关系，这一结果是否表示氯丙烯可抑制细胞内脂质过氧化，或是由于氯丙烯影响了MDA的生成，还需要进一步探讨。
, 百拇医药
我们探讨了氯丙烯对鸡胚脑神经细胞NO、NOS、SOD、MDA、GSH的影响，表明氯丙烯不仅影响NO和NOS，而且还影响了细胞内抗氧化系统，使细胞清除自由基的能力下降。细胞内Ca2+增高可使NO生成增加，NO生成增加可使抗氧化能力减弱、线粒体呼吸和能量合成抑制，抗氧化能力减弱和线粒体功能抑制又可使细胞内Ca2+进一步滞留在细胞内，导致细胞内Ca2+稳态失调。这可能是氯丙烯引起细胞内Ca2+稳态失调的原因之一。
本课题受山东省自然科学基金资助(Y97C13049)
参考文献
[1] 山东医学院卫生学教研组，山东省人民医院职业病科，济南市中心医院职业病科，等.氯丙烯、环氧氯丙烷、二氯丙醇和二氯丙烷的毒性研究.卫生研究，1976，5：317-320.
, 百拇医药
[2] 中国医学科学院卫生研究所临床研究室，中国人民解放军总医院脑系科肌电图室.慢性氯丙烯中毒引起多发性神经病的临床研究.中华医学杂志，1980，60：746-748.
[3] 孙克任，姜惠敏，崔唏，等.大鼠氯丙烯中毒对神经纤维微管、神经微丝和胞浆内Ca2+、Mg2+含量影响.中国药理学与毒理学杂志，1989，3：293-297.
[4] 谢克勤，孙克任，杨东昌，等.氯丙烯引起神经细胞钙稳态失衡及细胞骨架损伤.中国药理学与毒理学杂志，1995，9：292-295.
[5] Kehrer JP, Mossman BT, Sevanian A, et al. Free radical mechanisms in chemical pathogenesis. Toxicol Appl Pharmacol, 1988,95:349-362.
, 百拇医药
[6] 赵林普，肖定华，陈士英，等.人、大鼠、鸡等胚胎脑细胞的分离培养及生长分化.解剖学杂志，1985，8：269-271.
[7] 钟慈声，孙安阳.一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社，1997.15-24.
[8] 刘景生.细胞信息与调控.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.212-226.
[9] 张铣，刘毓谷.毒理学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.136-153.
(收稿日期：1999-06-22), 百拇医药
单位：阮迪云(中国科技大学生命科学学院神经毒理实验室)；谢克勤 赵丽 张旻 孙克任(山东医科大学毒理学省级重点实验室，济南 250012)
关键词：
卫生毒理学杂志000407 氯丙烯(allyl chloride)为不饱和氯代脂肪烃类化合物，有高度挥发性，是生产聚丙烯酰胺、环氧氯丙烷和某些农药等物质的重要化工原料。我国自70年代起发现长期低浓度接触可引起神经衰弱综合征和对称性轴突变性型周围神经病[1，2]。动物超微神经病理观察发现神经轴浆内微管(microtubules, MT)和神经丝(neurofilaments, NF)大量堆积，单位面积内数量明显减少[3]。这种病理改变与Ca2+增加导致MT和NF的受损有关[4]。自由基可引起细胞损伤[5]。然而，氯丙烯是否能引起细胞内抗氧化系统和一氧化氮(NO)的改变，这些改变与Ca2+增加是否有关，为此，我们选择NO、一氧化氮合酶(NO synthase, NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)为研究指标，探讨氯丙烯引起的钙稳态失调与NO和细胞过氧化之间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药品和仪器 氯丙烯由上海试剂一厂生产。Eagle 培养液(美国GIBCO公司)。UV-120-2型分光光度计(日本岛津)。NO、MDA、GSH、NOS、SOD测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 鸡胚脑神经细胞原代培养 根据赵林普等[6]报告的方法，用海兰鸡种蛋37 ℃恒温箱中孵育7 d，无菌条件下，取下头部，用镊子取出脑组织，剥离脑膜，用200目铜网机械分离成5 ×106 cells/ml的细胞悬液，接种1 ml到涂有鼠尾胶的培养瓶内，加4 ml全Eagle培养液，橡皮塞塞紧，37 ℃培养5 d后加入氯丙烯，其浓度为0.306、0.613和1.225 mmol/L，每一剂量组至少10瓶细胞。24 h后，将细胞用橡胶片轻轻刮下，移入离心管1 000 g离心10 min，去培养液后迅速将带细胞的离心管放入-20 ℃冷冻。
, 百拇医药
1.3 NO、MDA、GSH含量和NOS、SOD活性测定 将细胞反复冻融3次使细胞破碎，根据试剂盒要求进行操作，用UV-120-2型分光光度计分别测定吸光度，根据公式计算NO、MDA、GSH含量和NOS、SOD活性。细胞外直接用细胞培养液测定。蛋白含量测定用Bradford法。
2 结果
2.1 鸡胚脑神经细胞NO含量和NOS活性改变 鸡胚脑神经细胞内NO含量随氯丙烯浓度增高而增加，低、中、高3个剂量组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.01)；细胞培养液中NO含量无明显改变，低、中、高3个剂量组与对照相比，差异无显著性(P>0.05)。随氯丙烯浓度增高细胞内外NOS活性增加不明显，仅有高剂量组与对照组相比，差异有显著性(P<0.01)。结果见表1。
表1 氯丙烯引起鸡胚脑神经细胞内外NO含量和NOS活性改变(
±s) 浓度, 百拇医药
(mmol/L)
细胞外NO
(μmol/L)
细胞内NO
(μmol/L)
细胞外NOS
(U/ml)
细胞内NOS
(U/mg.protein)
0
118.52±3.37
3.17±0.89
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16.22±1.81
3.93±0.86
0.306
116.98±4.60
4.63±0.37* *
18.74±2.83
4.66±1.03
0.613
118.04±8.06
4.65±0.19* *
17.72±2.32
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4.85±1.51*
1.225
115.84±3.94
5.95±0.22* *
19.96±3.32* *
4.88±1.05* *
与对照组比较，P<0.05，**P<0.01;n=10(细胞内NOSn=20)
2.2 鸡胚脑神经细胞MDA、GSH含量的改变 细胞MDA含量随氯丙烯浓度增高而含量明显降低，低、中、高3个剂量组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.01)，并表现明显的剂量-效应关系。培养液和细胞GSH含量随氯丙烯浓度增高呈降低趋势，培养液仅有高剂量组与对照组相比，差异有显著性(P<0.01)。细胞GSH中、高剂量组与对照组相比，差异有显著性(P<0.05，P<0.01)。结果见表2。
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表2 氯丙烯引起鸡胚脑神经细胞内外MDA、GSH含量的改变(
±s) 浓度(mmol/L)
MDA
(nmol/ml)
细胞外GSH
(mg/L)
细胞GSH
(μg/5×106细胞)
0
12.57±1.46
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4.27±0.40
8.98±0.77
0.306
9.46±1.93**
4.32±0.73
9.21±0.48
0.613
8.75±1.84**
4.27±0.45
8.16±0.72**
1.225
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5.99±0.96**
3.37±0.16**
5.59±0.33**
与对照组比较，P<0.01；n=102.3 鸡胚脑神经细胞SOD活性改变 细胞SOD活性随氯丙烯浓度增高而明显降低，低、中、高3个剂量组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.05,P<0.01)，并有明显的剂量-效应关系。CuZn-SOD活性降低比T-SOD活性降低有明显的剂量-效应关系。CuZn-SOD活性降低比T-SOD活性降低明显，同时CuZn-SOD活性降低3个剂量组与对照组相比，差异均非常显著(P<0.01)，结果见表3。
表3 氯丙烯引起鸡胚脑神经细胞SOD活性改变(
±s) 浓度, 百拇医药
(mmol/L)
T-SOD
(NU/ml)
百分率
(%)
CuZn-SOD
(NU/ml)
百分率
(%)
0
65.83±12.86
100.0
57.91±12.79
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100.0
0.306
54.25±8.68*
82.4
34.95±16.25**
60.4
0.613
50.88±15.84*
77.3
27.58±4.05**
47.6
, http://www.100md.com
1.225
43.80±7.33**
66.5
15.99±3.45**
27.6
与对照组比较，P<0.05,**P<0.01;n=10;T-SOD=总SOD活性；CuZn-SOD=铜锌SOD活性；NU/ml=亚硝酸盐单位/ml3 讨论
我国自70年代起发现长期低浓度接触氯丙烯可引起神经衰弱综合征和对称性轴突变性型周围神经病[1，2]。动物超微神经病理观察有神经轴浆内MT和NF大量变性堆积[3]。这种病理改变与Ca2+增加导致MT和NF的受损有关[4]。然而，氯丙烯是否能引起细胞内抗氧化系统和NO的改变，这些改变与Ca2+增加是否有关，诸如此类的问题，文献报道较少。探讨氯丙烯对细胞内过氧化和NO的影响将增加我们对氯丙烯引起的中毒性周围神经病发病机制的认识。
, http://www.100md.com
NO是一种自由基性质的气体，具有独特的理化特性和多种生物学功能，如松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集等。然而，NO也可产生毒性作用。过高浓度长时间作用，NO可作用于肽链巯基使甘油醛-3-磷酸脱氢酶发生ADP-核糖基化、使谷胱甘肽过氧化物酶失活；可抑制非血红素铁-硫酶，如线粒体和细胞浆中的顺乌头酸酶、线粒体呼吸链中的NADH-氢醌氧化还原酶、琥珀酸-氢醌氧化还原酶，从而抑制线粒体呼吸和能量代谢；可使SOD分子内的酪氨酸硝基化，使SOD失活。催化NO生物合成的酶为NOS。NOS的亚型有3种，分别为神经元型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS)。由于nNOS和eNOS在细胞处于生理状态下即有表达，又合称为结构型NOS(cNOS)。cNOS活性受Ca2+浓度调节。当Ca2+进入细胞与钙调蛋白(CaM)结合形成Ca2+-CaM复合物，与cNOS结合导致cNOS激活，使其活性增加，NO合成增加[7，8]。本次研究结果显示，氯丙烯染毒的细胞内NO含量与对照相比明显增加，并表现明显的剂量-效应关系。细胞内NOS活性的改变，尽管没有NO那样显著，但也有随氯丙烯浓度的增高而有增高的趋势。NO含量和NOS活性的增加与我们以前报道的氯丙烯可引起细胞内Ca2+增高的结果相吻合[4]，表明氯丙烯引起的细胞内Ca2+增高与NO含量和NOS活性的增加有关。这可能由于细胞内Ca2+增高，激活cNOS，使其活性增强，导致NO生成增加。
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SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。高等动物体内有两种SOD，一种是CuZn-SOD，另一种是Mn-SOD，两者之和等于T-SOD[9]。本次对细胞内T-SOD和CuZn-SOD进行了研究，结果显示T-SOD和CuZn-SOD活性明显下降，CuZn-SOD活性下降比T-SOD活性下降幅度要大。表明氯丙烯对CuZn-SOD活性的影响比对Mn-SOD活性的影响大而且明显。这可能是氯丙烯本身的直接作用，使SOD活性下降；也可能是由于NO过多，导致SOD的酪氨酸硝基化，使SOD失活。GSH也能清除自由基，稳定巯基酶，防止受氧化损伤，并能结合毒物，加速代谢。GSH含量可衡量机体的抗氧化能力[8，9]。本次结果显示细胞内外GSH含量在高剂量组才明显降低，表明氯丙烯对GSH的影响不如CuZn-SOD明显。MDA是脂质过氧化的产物，它的含量的多少可反映机体内脂质过氧化的程度。本次结果显示MDA随氯丙烯浓度增加而含量显著降低，并有明显的剂量-效应关系，这一结果是否表示氯丙烯可抑制细胞内脂质过氧化，或是由于氯丙烯影响了MDA的生成，还需要进一步探讨。
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我们探讨了氯丙烯对鸡胚脑神经细胞NO、NOS、SOD、MDA、GSH的影响，表明氯丙烯不仅影响NO和NOS，而且还影响了细胞内抗氧化系统，使细胞清除自由基的能力下降。细胞内Ca2+增高可使NO生成增加，NO生成增加可使抗氧化能力减弱、线粒体呼吸和能量合成抑制，抗氧化能力减弱和线粒体功能抑制又可使细胞内Ca2+进一步滞留在细胞内，导致细胞内Ca2+稳态失调。这可能是氯丙烯引起细胞内Ca2+稳态失调的原因之一。
本课题受山东省自然科学基金资助(Y97C13049)
参考文献
[1] 山东医学院卫生学教研组，山东省人民医院职业病科，济南市中心医院职业病科，等.氯丙烯、环氧氯丙烷、二氯丙醇和二氯丙烷的毒性研究.卫生研究，1976，5：317-320.
, 百拇医药
[2] 中国医学科学院卫生研究所临床研究室，中国人民解放军总医院脑系科肌电图室.慢性氯丙烯中毒引起多发性神经病的临床研究.中华医学杂志，1980，60：746-748.
[3] 孙克任，姜惠敏，崔唏，等.大鼠氯丙烯中毒对神经纤维微管、神经微丝和胞浆内Ca2+、Mg2+含量影响.中国药理学与毒理学杂志，1989，3：293-297.
[4] 谢克勤，孙克任，杨东昌，等.氯丙烯引起神经细胞钙稳态失衡及细胞骨架损伤.中国药理学与毒理学杂志，1995，9：292-295.
[5] Kehrer JP, Mossman BT, Sevanian A, et al. Free radical mechanisms in chemical pathogenesis. Toxicol Appl Pharmacol, 1988,95:349-362.
, 百拇医药
[6] 赵林普，肖定华，陈士英，等.人、大鼠、鸡等胚胎脑细胞的分离培养及生长分化.解剖学杂志，1985，8：269-271.
[7] 钟慈声，孙安阳.一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社，1997.15-24.
[8] 刘景生.细胞信息与调控.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.212-226.
[9] 张铣，刘毓谷.毒理学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.136-153.
(收稿日期：1999-06-22), 百拇医药