乐果对培养乳鼠心肌细胞的毒作用
作者：胡云平 周志俊 孙运光 黄雷鸣 薛寿征
单位：复旦大学医学院卫生毒理学教研室，上海 200032
关键词：乐果；原代培养心肌细胞；细胞骨架
卫生毒理学杂志000406 摘要 【目的】 探讨乐果对培养乳鼠心肌细胞细胞收缩功能、乳酶脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和细胞骨架的影响。【方法】 体外乳鼠心肌细胞细胞培养。【结果】 乐果可使心肌细胞收缩力减弱；13.2 μmol/L染毒3 h 后心肌搏动频率明显降低，而52.8 μmol/L和211.2 μmol/L染毒1 h后即降低；211.2 μmol/L染毒心肌细胞，LDH和AST漏出达最大值的时间分别为1 h和3 h，而13.2或52.8 μmol/L染毒分别为3 h和8 h。另外，乐果还可使心肌细胞骨架着色变浅，排列不规则。上述改变具有明显的剂量-效应和时程依赖性关系。【结论】 乐果对乳鼠心肌细胞有明显的毒作用，其机制可能涉及心肌细胞膜和线粒体膜通透性增加，刺激肌质网的钙泵系统摄取Ca2+，引起细胞骨架构型改变，从而影响心肌的收缩功能。
, http://www.100md.com
The toxicity of dimethoate in oultured myocardial cells of neonatal rate
HU Yun-ping,ZHOU Zhi-jun,SUN Yun-guang
(Department of Toxicology,Medical Center of Fudan University,Shanghai 200032,China.)
Abstract:【Objective】 To explore the effects of dimethoate on lactate dehydrogenase(LDH),aspartate aminotransferase transaminase(AST),the contraction function of cells and cytoskeleton.【Methods】 The culture of myocardial cell of meonatal rats,in vitro.【Results】 Dimethoate decreased the force of myocardial contraction.Beating rates decreased after 3 and 1 h treatment with dimethoate at the dose of 13.2 μmol/L and 52.8 or 211.2 μmol/L,respectively.The maximum value of LDH and AST level occurred at 1 and 3 h at the dose of 211.2 μmol/L,but at 3 and 8 h at the dose of 13.2 or 52.8 μmol/L,respectively.Dimethoate also induced hypochromatic cytoskeleton,which disorderly arranged.The dose-effect and time-dependent relationships between the treatment and the observed index were observed.【Conclusion】 Those results implide that dimethoate could result in significant toxicity in cultured myocardial cells of neonatal rats.Its mechanism may involve in the increase of the membrane and mitochondria penetration,which stimulates calcium pump in endoplasmic reticulum to uptake calcium ion,influences the structure of the cytoskeleton and the function of myocardial contraction.
, 百拇医药
Key words：Dimethoate; Primary cultured myocardial cells; Cytoskeleton
有机磷农药是我国目前生产和使用最多的农药，也是引起急性中毒和致死的主要农药，在农药所致的职业病中占据重要位置。其毒作用机制主要是抑制乙酰胆碱酯酶，引起体内乙酰胆碱的积聚，产生一系列被称为胆碱能危象的效应[1]。近年国内外愈来愈多的研究表明，有机磷中毒病例有不少出现心脏损害，心电图和心肌病理可有多方面改变，这种改变与乙酰胆碱酯酶抑制无关；一些重症病人在现行常规治疗后病情还会出现反复，并在恢复期有猝死现象，引起反复和猝死的有机磷农药以乐果最多[2，3]。虽然不少学者认为，心脏毒性是有机磷严重中毒后期猝死的重要原因，但其确切机制尚未阐明[4]，因此有必要对其作深入探讨，以便为其中毒防治提供理论依据。本研究观察了乐果对培养乳鼠心肌细胞的毒作用，旨在了解其对心肌细胞的影响及可能机制。
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1 材料与方法
1.1 材料 乐果，纯度为98.3%，由上海农药厂提供。胰蛋白酶和小牛血清购于上海华美生物工程公司；DMEM 培养液由美国life tech.Inc提供；门冬氨酸和乳酸钠由上海伯奥生物科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞培养 参照Simpson法[5]。取生后3 d SD乳鼠的心脏放入DMEM培养液中，剪至1 mm3左右。用体积分数为0.1%的胰蛋白酶消化，加体积分数为20%的小牛血清，离心，制备细胞悬液。培养3 h，纯化心肌细胞，用苔酚蓝计数达3.5×105～5×105，继续接种培养。
1.2.2 自发节律性收缩的测定 在倒置显微镜下观察，刚接种的单个细胞呈圆形，悬浮于培养液中；24 h后，细胞多已贴壁生长，并伸出伪足，开始搏动；72 h形成细胞簇，搏动渐规则，基本形成同步化，故研究时选用培养72 h的心肌细胞，观察加入乐果溶液后(终浓度分别为13.2、52.8、211.2 μmol/L，并设空白对照)，在染毒时、染毒后1、3、8 h心肌自发节律性收缩功能的改变，并计算染毒前后收缩频率的变化。
, 百拇医药
1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸转氨酶(AST)的测定[6] 心肌细胞培养72 h后，按自发节律性收缩的测定方法处理细胞，测定心肌细胞上清液中的LDH和AST的水平。
1.2.4 细胞骨架的观察[7] 培养72 h的心肌细胞加入乐果(受试物浓度同前)，培养5 h，用考马斯蓝R25显示细胞骨架。
1.2.5 统计学处理 所有数据用SAS软件处理，进行方差分析。
2 结果
2.1 乐果对心肌细胞自发节律性收缩的影响 随着染毒剂量的增加，心肌细胞的收缩力明显减弱。节律随染毒时间的延长逐渐不规则，各染毒剂量组心肌细胞的搏动频率随时间延长而下降，其明显下降时点在13.2 μmol/L剂量组为染毒后3 h，52.8和211.2 μmol/L 剂量组为染毒后1 h，结果见图1。
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2.2 乐果对心肌细胞上清液中LDH活力的影响 乐果可使心肌细胞LDH漏出显著增加(P<0.05)，其中13.2、52.8 μmol/L剂量染毒后3 h LDH活力增加达最大值；而211.2 μmol/L剂量染毒后1 h， LDH活力增加即达最大值，结果见表1。
2.3 乐果对心肌细胞上清液中AST活力的影响 乐果可使心肌细胞AST水平明显升高(P<0.05)，但13.2 μmol/L及52.8 μmol/L染毒后8 h仍见升高，而211.2 μmol/L染毒后3 h升高达最大值，表明随染毒剂量增加，AST升高达最大值的时间提前出现，结果见表2。
图1 乐果对心肌细胞收缩频率的影响
表1 乐果对心肌细胞上清液LDH活力的影响(U,
±s) 剂量(μmol/L)
, http://www.100md.com
n
染毒时间(h)
0
1
3
8
0
4
49.9±8.9
45.5± 9.9
33.6±4.0
35.8± 2.0
13.2
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4
56.4±1.5
134.2± 4.7
141.0±3.2
124.2± 6.0＃
52.8
4
57.8±6.9
134.3± 5.7
136.6±2.2
131.6± 5.7
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211.2
4
53.2±9.1
142.5±11.7
135.6±2.7
134.9±12.6
与染毒前及对照相同时点比较，P<0.05；与染毒3h比较，＃P<0.05表2 乐果对心肌细胞上清液天冬氨酸转氨酶(AST)活力的影响(U,±s) 剂量(μmol/L)
n
, 百拇医药
染毒时间(h)
0
1
3
8
0
4
9.53±2.80
9.50±2.77
14.3± 5.54
8.68± 6.52
13.2
4
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9.53±5.49
65.10±7.59
68.83± 7.32
76.18±11.87
52.8
4
7.70±3.28
69.60±6.32
71.60±13.35
73.85±12.30
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211.2
4
9.55±6.50
66.90±3.58
76.83± 3.10＃
67.83± 6.05
与染毒前及对照相同时点比较，P<0.05；与染毒1 h比较，＃P<0.052.4 乐果对心肌细胞骨架的影响 光镜下对照组心肌细胞骨架纤维束清晰可见，着色均匀，排列规则。随染毒剂量增加，骨架纤维束染色渐浅，排列渐不规则。
3 讨论
, 百拇医药
细胞正常的生命活动与其膜系统的结构及功能密切相关。生理状态下，细胞膜参与营养物质的转运，维持细胞内pH值、水电解质平衡，并参与能量的生成及转化等。如果细胞膜通透性发生改变，细胞的功能将受到不同程度的影响。LDH漏出增加表明细胞膜通透性上升，AST漏出增加则表明细胞膜及线粒体膜的通透性发生了改变。本研究表明，乐果可使心肌细胞LDH、AST漏出增加，随染毒剂量的增加上述两种酶水平升高达最大值的时间提前出现，但LDH升高达最大值的时间较AST早。该结果提示，随染毒剂量增加，心肌细胞受损越严重；细胞膜的通透性改变较线粒体膜改变早，LDH的改变较AST敏感。
乳鼠心肌细胞在培养3～4 d后，可出现有规则的自发性收缩。这是心肌细胞的一个生理特征，因此评价心肌细胞的自发性收缩功能变化有助于了解毒物对心肌细胞的影响。本研究发现，乐果可使心肌细胞收缩不规则，收缩力减弱，并降低心肌细胞的自发搏动频率，上述改变呈明显的剂量和时间关系，表明乐果对心肌细胞有负性肌力作用。
, 百拇医药 细胞骨架是细胞内蛋白成分组成的网架结构，由微管、微丝、中等纤维和微梁网格组成。以微丝组成的张力纤维为主的细胞骨架纤维束，对维持细胞内的正常结构及细胞的运动起重要作用。微丝由肌动蛋白、肌球蛋白及肌动蛋白结合蛋白构成。根据肌肉收缩的滑行理论，心肌细胞的收缩是由于Ca2+激活，引起肌钙蛋白、原肌球蛋白的构型改变，促使横桥与肌动蛋白结构，随粗肌丝与细肌丝之间滑动，肌肉收缩[8]。离体心脏灌流研究发现，有机磷农药对心肌细胞离子通透有影响，并可能通过肌质肉的钙泵系统刺激Ca2+的摄取，使用Ca2+通道阻滞剂后能缓解有机磷农药的心脏毒性[9]。本实验研究进一步观察到，乐果可破坏心肌细胞骨架，使其着色变浅，排列不规则。结合乐果染毒后心肌细胞LDH和AST活力及其时间的变化和收缩力功能的改变，推测乐果对心肌细胞的毒作用可能涉及以下过程：前期心肌细胞膜和后期线粒体膜通透性增加，刺激肌质网的钙泵系统摄取Ca2+，引起细胞骨架蛋白构型改变，导致收缩力减弱以及收缩不规则。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助(39570624)
参考文献
[1] 王莹，顾祖维，张胜年，等主编.现代职业医学.北京：人民卫生出版社，1996.476-487.
[2] Ludomirsky A,Klein HO,Sarelli P,et al.Q-T prolongation and polymorphous(Torsade de pointes)ventricular arrhythmias associated with organophosphorus insecticide poisoning.Am J Cardiol,1982，49，1654-1658.
[3] 张清勇，高嗣惠，李良文，等.急性有机磷农药中毒恢复期病情反复56例临床分析.中华内科杂志，1992，31：562-563.
, 百拇医药
[4] Ballantyne B，Marrs TC,ed.Clinical and experimental toxicology of organophosphates and carbates.Butterworth/Heinemann,Oxford,1993.84-89.
[5] Simpson P,Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferation nonmyocardial cells.Cir Res,1982，50:101-116.
[6] 上海市医学化验所，主编.临床生化检验.上海：上海科学技术出版社，1979.315-337.
[7] 张均田，主编.现代药理实验方法(上).北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1998.328-329.
[8] Puceat M,Terzic A,Clement O,et al.Cardiac α1-adrenoceptors mediate positive inotropy via myofibrillar sensitization.Trends Pharmacol Sci,1992,13:263-265.
[9] Roth A,Zellinger I,Arad M,et al.Organophosphates and heart.Chest,1993,103:576-582.
(收稿日期：1999-05-02), 百拇医药
单位：复旦大学医学院卫生毒理学教研室，上海 200032
关键词：乐果；原代培养心肌细胞；细胞骨架
卫生毒理学杂志000406 摘要 【目的】 探讨乐果对培养乳鼠心肌细胞细胞收缩功能、乳酶脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和细胞骨架的影响。【方法】 体外乳鼠心肌细胞细胞培养。【结果】 乐果可使心肌细胞收缩力减弱；13.2 μmol/L染毒3 h 后心肌搏动频率明显降低，而52.8 μmol/L和211.2 μmol/L染毒1 h后即降低；211.2 μmol/L染毒心肌细胞，LDH和AST漏出达最大值的时间分别为1 h和3 h，而13.2或52.8 μmol/L染毒分别为3 h和8 h。另外，乐果还可使心肌细胞骨架着色变浅，排列不规则。上述改变具有明显的剂量-效应和时程依赖性关系。【结论】 乐果对乳鼠心肌细胞有明显的毒作用，其机制可能涉及心肌细胞膜和线粒体膜通透性增加，刺激肌质网的钙泵系统摄取Ca2+，引起细胞骨架构型改变，从而影响心肌的收缩功能。
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The toxicity of dimethoate in oultured myocardial cells of neonatal rate
HU Yun-ping,ZHOU Zhi-jun,SUN Yun-guang
(Department of Toxicology,Medical Center of Fudan University,Shanghai 200032,China.)
Abstract:【Objective】 To explore the effects of dimethoate on lactate dehydrogenase(LDH),aspartate aminotransferase transaminase(AST),the contraction function of cells and cytoskeleton.【Methods】 The culture of myocardial cell of meonatal rats,in vitro.【Results】 Dimethoate decreased the force of myocardial contraction.Beating rates decreased after 3 and 1 h treatment with dimethoate at the dose of 13.2 μmol/L and 52.8 or 211.2 μmol/L,respectively.The maximum value of LDH and AST level occurred at 1 and 3 h at the dose of 211.2 μmol/L,but at 3 and 8 h at the dose of 13.2 or 52.8 μmol/L,respectively.Dimethoate also induced hypochromatic cytoskeleton,which disorderly arranged.The dose-effect and time-dependent relationships between the treatment and the observed index were observed.【Conclusion】 Those results implide that dimethoate could result in significant toxicity in cultured myocardial cells of neonatal rats.Its mechanism may involve in the increase of the membrane and mitochondria penetration,which stimulates calcium pump in endoplasmic reticulum to uptake calcium ion,influences the structure of the cytoskeleton and the function of myocardial contraction.
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Key words：Dimethoate; Primary cultured myocardial cells; Cytoskeleton
有机磷农药是我国目前生产和使用最多的农药，也是引起急性中毒和致死的主要农药，在农药所致的职业病中占据重要位置。其毒作用机制主要是抑制乙酰胆碱酯酶，引起体内乙酰胆碱的积聚，产生一系列被称为胆碱能危象的效应[1]。近年国内外愈来愈多的研究表明，有机磷中毒病例有不少出现心脏损害，心电图和心肌病理可有多方面改变，这种改变与乙酰胆碱酯酶抑制无关；一些重症病人在现行常规治疗后病情还会出现反复，并在恢复期有猝死现象，引起反复和猝死的有机磷农药以乐果最多[2，3]。虽然不少学者认为，心脏毒性是有机磷严重中毒后期猝死的重要原因，但其确切机制尚未阐明[4]，因此有必要对其作深入探讨，以便为其中毒防治提供理论依据。本研究观察了乐果对培养乳鼠心肌细胞的毒作用，旨在了解其对心肌细胞的影响及可能机制。
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1 材料与方法
1.1 材料 乐果，纯度为98.3%，由上海农药厂提供。胰蛋白酶和小牛血清购于上海华美生物工程公司；DMEM 培养液由美国life tech.Inc提供；门冬氨酸和乳酸钠由上海伯奥生物科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞培养 参照Simpson法[5]。取生后3 d SD乳鼠的心脏放入DMEM培养液中，剪至1 mm3左右。用体积分数为0.1%的胰蛋白酶消化，加体积分数为20%的小牛血清，离心，制备细胞悬液。培养3 h，纯化心肌细胞，用苔酚蓝计数达3.5×105～5×105，继续接种培养。
1.2.2 自发节律性收缩的测定 在倒置显微镜下观察，刚接种的单个细胞呈圆形，悬浮于培养液中；24 h后，细胞多已贴壁生长，并伸出伪足，开始搏动；72 h形成细胞簇，搏动渐规则，基本形成同步化，故研究时选用培养72 h的心肌细胞，观察加入乐果溶液后(终浓度分别为13.2、52.8、211.2 μmol/L，并设空白对照)，在染毒时、染毒后1、3、8 h心肌自发节律性收缩功能的改变，并计算染毒前后收缩频率的变化。
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1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸转氨酶(AST)的测定[6] 心肌细胞培养72 h后，按自发节律性收缩的测定方法处理细胞，测定心肌细胞上清液中的LDH和AST的水平。
1.2.4 细胞骨架的观察[7] 培养72 h的心肌细胞加入乐果(受试物浓度同前)，培养5 h，用考马斯蓝R25显示细胞骨架。
1.2.5 统计学处理 所有数据用SAS软件处理，进行方差分析。
2 结果
2.1 乐果对心肌细胞自发节律性收缩的影响 随着染毒剂量的增加，心肌细胞的收缩力明显减弱。节律随染毒时间的延长逐渐不规则，各染毒剂量组心肌细胞的搏动频率随时间延长而下降，其明显下降时点在13.2 μmol/L剂量组为染毒后3 h，52.8和211.2 μmol/L 剂量组为染毒后1 h，结果见图1。
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2.2 乐果对心肌细胞上清液中LDH活力的影响 乐果可使心肌细胞LDH漏出显著增加(P<0.05)，其中13.2、52.8 μmol/L剂量染毒后3 h LDH活力增加达最大值；而211.2 μmol/L剂量染毒后1 h， LDH活力增加即达最大值，结果见表1。
2.3 乐果对心肌细胞上清液中AST活力的影响 乐果可使心肌细胞AST水平明显升高(P<0.05)，但13.2 μmol/L及52.8 μmol/L染毒后8 h仍见升高，而211.2 μmol/L染毒后3 h升高达最大值，表明随染毒剂量增加，AST升高达最大值的时间提前出现，结果见表2。
图1 乐果对心肌细胞收缩频率的影响
表1 乐果对心肌细胞上清液LDH活力的影响(U,
±s) 剂量(μmol/L), http://www.100md.com
n
染毒时间(h)
0
1
3
8
0
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49.9±8.9
45.5± 9.9
33.6±4.0
35.8± 2.0
13.2
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56.4±1.5
134.2± 4.7
141.0±3.2
124.2± 6.0＃
52.8
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57.8±6.9
134.3± 5.7
136.6±2.2
131.6± 5.7
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4
53.2±9.1
142.5±11.7
135.6±2.7
134.9±12.6
与染毒前及对照相同时点比较，P<0.05；与染毒3h比较，＃P<0.05表2 乐果对心肌细胞上清液天冬氨酸转氨酶(AST)活力的影响(U,
±s) 剂量(μmol/L)n
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染毒时间(h)
0
1
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9.53±2.80
9.50±2.77
14.3± 5.54
8.68± 6.52
13.2
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9.53±5.49
65.10±7.59
68.83± 7.32
76.18±11.87
52.8
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7.70±3.28
69.60±6.32
71.60±13.35
73.85±12.30
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9.55±6.50
66.90±3.58
76.83± 3.10＃
67.83± 6.05
与染毒前及对照相同时点比较，P<0.05；与染毒1 h比较，＃P<0.052.4 乐果对心肌细胞骨架的影响 光镜下对照组心肌细胞骨架纤维束清晰可见，着色均匀，排列规则。随染毒剂量增加，骨架纤维束染色渐浅，排列渐不规则。
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细胞正常的生命活动与其膜系统的结构及功能密切相关。生理状态下，细胞膜参与营养物质的转运，维持细胞内pH值、水电解质平衡，并参与能量的生成及转化等。如果细胞膜通透性发生改变，细胞的功能将受到不同程度的影响。LDH漏出增加表明细胞膜通透性上升，AST漏出增加则表明细胞膜及线粒体膜的通透性发生了改变。本研究表明，乐果可使心肌细胞LDH、AST漏出增加，随染毒剂量的增加上述两种酶水平升高达最大值的时间提前出现，但LDH升高达最大值的时间较AST早。该结果提示，随染毒剂量增加，心肌细胞受损越严重；细胞膜的通透性改变较线粒体膜改变早，LDH的改变较AST敏感。
乳鼠心肌细胞在培养3～4 d后，可出现有规则的自发性收缩。这是心肌细胞的一个生理特征，因此评价心肌细胞的自发性收缩功能变化有助于了解毒物对心肌细胞的影响。本研究发现，乐果可使心肌细胞收缩不规则，收缩力减弱，并降低心肌细胞的自发搏动频率，上述改变呈明显的剂量和时间关系，表明乐果对心肌细胞有负性肌力作用。
, 百拇医药 细胞骨架是细胞内蛋白成分组成的网架结构，由微管、微丝、中等纤维和微梁网格组成。以微丝组成的张力纤维为主的细胞骨架纤维束，对维持细胞内的正常结构及细胞的运动起重要作用。微丝由肌动蛋白、肌球蛋白及肌动蛋白结合蛋白构成。根据肌肉收缩的滑行理论，心肌细胞的收缩是由于Ca2+激活，引起肌钙蛋白、原肌球蛋白的构型改变，促使横桥与肌动蛋白结构，随粗肌丝与细肌丝之间滑动，肌肉收缩[8]。离体心脏灌流研究发现，有机磷农药对心肌细胞离子通透有影响，并可能通过肌质肉的钙泵系统刺激Ca2+的摄取，使用Ca2+通道阻滞剂后能缓解有机磷农药的心脏毒性[9]。本实验研究进一步观察到，乐果可破坏心肌细胞骨架，使其着色变浅，排列不规则。结合乐果染毒后心肌细胞LDH和AST活力及其时间的变化和收缩力功能的改变，推测乐果对心肌细胞的毒作用可能涉及以下过程：前期心肌细胞膜和后期线粒体膜通透性增加，刺激肌质网的钙泵系统摄取Ca2+，引起细胞骨架蛋白构型改变，导致收缩力减弱以及收缩不规则。
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本课题受国家自然科学基金资助(39570624)
参考文献
[1] 王莹，顾祖维，张胜年，等主编.现代职业医学.北京：人民卫生出版社，1996.476-487.
[2] Ludomirsky A,Klein HO,Sarelli P,et al.Q-T prolongation and polymorphous(Torsade de pointes)ventricular arrhythmias associated with organophosphorus insecticide poisoning.Am J Cardiol,1982，49，1654-1658.
[3] 张清勇，高嗣惠，李良文，等.急性有机磷农药中毒恢复期病情反复56例临床分析.中华内科杂志，1992，31：562-563.
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[4] Ballantyne B，Marrs TC,ed.Clinical and experimental toxicology of organophosphates and carbates.Butterworth/Heinemann,Oxford,1993.84-89.
[5] Simpson P,Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferation nonmyocardial cells.Cir Res,1982，50:101-116.
[6] 上海市医学化验所，主编.临床生化检验.上海：上海科学技术出版社，1979.315-337.
[7] 张均田，主编.现代药理实验方法(上).北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1998.328-329.
[8] Puceat M,Terzic A,Clement O,et al.Cardiac α1-adrenoceptors mediate positive inotropy via myofibrillar sensitization.Trends Pharmacol Sci,1992,13:263-265.
[9] Roth A,Zellinger I,Arad M,et al.Organophosphates and heart.Chest,1993,103:576-582.
(收稿日期：1999-05-02), 百拇医药