葡多酚对雄性小鼠生殖细胞辐射损伤的影响
作者：栗世如 钟进义
单位：青岛大学医学院预防医学教研室，青岛 266021
关键词：葡多酚；染色体畸变；精子畸形；辐射防护
卫生毒理学杂志000404 摘要 【目的】 探讨葡多酚(GPC)对雄性生殖细胞辐射损伤的影响。【方法】 给予小鼠口服不同剂量GPC后，采用60Co-γ射线进行全身照射，剂量为0.1 Gy/d，连续4周，检测睾丸细胞染色体畸变率、精子畸形率及睾丸组织脂质过氧化水平等指标。【结果】 GPC高、中、低3个剂量组的睾丸细胞染色体畸变抑制率分别为84.78%、71.04%和39.40%；精子畸形防护度分别为89.89%、83.24%和38.56%；各实验组的睾丸组织氧化损伤均低于阳性对照组。以上差异均有显著性(P<0.01)。【结论】 葡多酚对雄性生殖细胞辐射损伤有良好的防护作用，其作用机制与GPC的抗氧化活性密切相关。
, http://www.100md.com
Protective effect of grape procyanidins on male reproductive cells damage induced by radiation
LI Shi-ru,ZHONG Jin-yi
(Medical College of Qingdao University,Qingdao 266021,China.)
Abstract:【Objective】 To study the protective effect of grape procyandins(GPC) on the radioactive damage of male reproductive cells.【Methods】 After male mice were treated orally in the different doses of GPC,which were exposed to whole-body 60Coγ-rays at the dose of 0.1 Gy/day for 4 weeks.Then chromosome aberration of testicular cells,spermatozoa deformity,SOD activity and MDA content of testicle were measured.【Results】 Inhibition rates of testicular cells chromosome aberration in three treated groups were 84.78%,71.04% and 39.40% respectively,protective degrees of spermatozoa deformity were 89.89%,83.24% and 38.56% respectively,oxidative damage of testicle tissues were lower than the positive controls.These differences were all statically significant(P<0.01).【Conclusion】 GPC has a protective effect on male reproductive cells damage induced by radiation,the mechanism is closed related to antioxidational effect of GPC.
, 百拇医药
Key words：Grape Procyanidins; Chromosome aberration; Spermatozoa deformity; Radiation protection
葡多酚(Grape Procyanidins,GPC)是从葡萄核中提取的一种天然植物多酚物质，据国外报道，GPC具有抗氧化、抗病毒、酶抑制活性、心血管活性等多种生物活性[1，2]，对辐射损伤有一定防护作用[3]，我们已进行了GPC对放射性DNA损伤防护作用的体内外研究(另外报道)。本次实验我们研究了GPC对60Co-γ射线照射引发的雄性生殖细胞辐射损伤的影响，并对其作用机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 山东省实验动物中心提供昆明种雄性小鼠，体重22～25 g。
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1.1.2 葡多酚(GPC) 本实验室制备，将新鲜龙眼葡萄弃汁取核，干燥粉碎后用溶剂浸提法所得[4]。高效液相色谱法测定[5]，含量>99%，标准品由日本岛田株式会社提供。
1.2 实验方法 设3个GPC剂量组及维生素C对照组、阳性对照组与阴性对照组，每组10只动物，按完全随机原则将受试动物分配到各组。高、中、低3个剂量组给予GPC的剂量分别为500、250、50 mg/kg，维生素C对照组给予维生素C500 mg/kg，阳性对照组和阴性对照组只给蒸馏水而不给GPC，各组动物灌胃液体量均为0.5 ml/只。于早晨辐射前30 min空腹经口灌胃给药，隔天1次，连续4周。实验期间将动物采用60Co-γ射线进行全身照射，照射条件为60Co-γ射线源，照射距离为90 cm，剂量率为89.4 cGy/min。阴性对照组不照射，其他各组动物照射剂量均为0.1 Gy/次，每天1次，每周5 d，总剂量为2.0 Gy(约为1/2半数致死剂量)。在末次照射的第2天将全部动物处死。
, 百拇医药
1.3 观察指标及检测方法
1.3.1 睾丸精原细胞染色体畸变率 取一侧睾丸，分离曲细精管，剪碎后进行低渗处理，按常规染色体畸变实验方法制片和显微镜观察分析[6]。
1.3.2 精子畸形率 取双侧附睾，于磷酸盐缓冲生理盐水中剪碎，静置后吸取精子悬液，按常规方法进行制片和显微镜观察计数[7]。
1.3.3 睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量测定 取另一侧睾丸加生理盐水制成质量浓度为10%的组织匀浆，应用南京建成生物工程研究所提供的测试盒测定睾丸组织中SOD水平和MDA含量。
2 结果
2.1 睾丸精原细胞染色体畸变率 阳性对照组和阴性对照组的睾丸染色体畸变率分别为33.5%和2.4%，经χ2检验，差异有非常显著性(P<0.01)。GPC高、中、低3个剂量组的睾丸染色体畸变率分别为5.1%、9.7%和20.3%，与阳性对照组比较均降低，经χ2检验，差异有显著性(P<0.01)，各组睾丸染色体畸变率测定结果见表1。各实验组睾丸染色体畸变抑制率按公式(阳性对照组-实验组)/阳性对照组×100 %计算。
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2.2 精子畸形率 阳性对照组和阴性对照组的精子畸形率分别为41.7%和4.1%，经χ2检验，差异有非常显著性(P<0.01)。GPC高、中、低3个剂量组的精子畸形率分别为7.9%、10.4%和27.2%，与阳性对照组比较均降低，经χ2检验，差异均有显著性(P<0.01)，各组精子畸形率测定结果见表1。各实验组精子畸形防护度按公式(阳性对照组-实验组)/(阳性对照组-阴性对照组)×100%计算。
2.3 睾丸SOD活力和MDA含量 阳性对照组和阴性对照组的睾丸SOD活力分别为(1.75±0.12)NU/mg和(4.63±0.25)NU/mg，MDA含量分别为(1.18±0.07)nmol/mg和(0.72±0.06)nmol/mg，经t检验，差异均有显著性(P<0.01)。同阳性对照组比较，GPC高、中、低3个剂量组的SOD水平有不同程度升高，升高度分别为87.43%、47.43%和24.00%，而MDA含量则呈现不同程度降低，降低度分别为32.20%、26.27%和20.34%，经χ2检验，差异均有显著性(P<0.01)，睾丸SOD和MDA含量的测定结果见表2。各实验组SOD升高度与MDA降低度按公式(|阳性对照组-实验组|)/阳性对照组×100%计算。
, http://www.100md.com
表1 小鼠睾丸染色体畸变率和精子畸形率(%) 组 别
辐射剂量
(Gy)
动物数
(只)
GPC剂量
(mg/kg)
睾丸染色体畸变率
精子畸形率
观察细胞数
(个)
畸变细胞数
, 百拇医药
(个)
畸变
率
抑制率
(%)
观察精子数
(个)
精子畸形数
(个)
畸变
率
防护度
(%)
, 百拇医药
GPC高剂量组
2.0
10
500
1 000
51
5.1
84.78
1 000
79
7.9
89.89
, 百拇医药 GPC中剂量组
2.0
10
250
1 000
97
9.7
71.04
1 000
104
10.4
83.24
GPC低剂量组
, 百拇医药
2.0
10
50
1 000
203
20.3
39.40
1 000
272
27.2
38.56
维生素C对照组
, http://www.100md.com 2.0
10
0
1 000
101
10.1
69.85
1 000
117
11.7
79.79
阳性对照组
2.0
, 百拇医药
10
0
1 000
335
33.5
0.00
1 000
417
41.7
0.00
阴性对照组
0
10
, 百拇医药
0
1 000
24
2.4
——
1 000
41
4.1
——
与阳性对照组比较，χ2>6.63,P<0.01表2 小鼠睾丸SOD活力和MDA含量(
±s) 组 别
, 百拇医药
照射剂量
(Gy)
SOD(NU/mg)
MDA(nmol/mg)
活力
升高度(%)
P值
含量
降低度(%)
P值
GPC高剂量组
2.0
3.28±0.23
, 百拇医药
87.43
<0.01
0.80±0.05
32.20
<0.01
GPC中剂量组
2.0
2.58±0.29
47.43
<0.01
0.87±0.06
26.27
, 百拇医药
<0.01
GPC低剂量组
2.0
2.17±0.30
24.00
<0.01
0.94±0.03
20.34
<0.01
维生素C对照组
2.0
2.46±0.22
, 百拇医药
40.57
<0.01
0.91±0.05
22.88
<0.01
阳性对照组
2.0
1.75±0.12
0.00
——
1.18±0.07
0.00
, 百拇医药
——
阴性对照组
0.0
4.63±0.25
164.57
<0.01
0.72±0.06
38.98
<0.01
与阳性对照组比较，t>2.878,P<0.01
3 讨论
3.1 GPC可抑制睾丸染色体畸变和精子畸形 从潜在的遗传危险考虑，探讨辐射引发的生殖细胞染色体畸变和精子畸形对评价辐射损伤具有重要意义。本次实验结果表明，小鼠经60Co-γ射线辐射后，各组动物睾丸染色体畸变率和精子畸形率均出现不同程度升高，说明经60Co-γ射线照射后，睾丸染色体和精子发生明显损伤，这同文献报道电离辐射可诱发生殖细胞内作为遗传基因载体的染色体畸变和精子畸形是一致的[8]。高、中、低剂量组的睾丸染色体畸变率均低于未给GPC的阳性对照组，且表现出随GPC剂量增大染色体畸变率、精子畸形逐渐降低的明显剂量反应关系。可以认为，在本次实验条件下，GPC对60Co-γ射线诱发的睾丸染色体畸变和精子畸形有良好的抑制作用，这同国外报道GPC具有抗辐射作用的实验结果是一致的[3]。
, 百拇医药
3.2 GPC可减轻睾丸组织脂质过氧化损伤 自由基学说是放射线造成机体损伤的重要理论之一，辐射射线是外源性产生自由基的一个重要原因。经辐射后，机体可因自由基生成加强而使脂质过氧化反应增强[9]。本次研究阳性对照组睾丸SOD水平降低、MDA含量升高，表明照射后睾丸组织内产生氧化损伤，脂质过氧化产物的体内蓄积量增大。3个GPC实验组的睾丸组织脂质过氧化损伤的程度虽均高于阴性对照组，但比阳性对照组明显降低，且有剂量-反应关系，说明GPC对辐射引发的睾丸组织脂质过氧化损伤有良好抑制作用，这同文献报道GPC具有抗氧化、抗自由基损伤作用是一致的[1]，这可能是GPC对雄性生殖细胞辐射损伤防护作用的机制之一。
3.3 GPC防护作用高于同剂量的维生素C 根据报道维生素C 200～800 mg/kg对小鼠γ射线辐射诱发的染色体损伤有良好防护效果[10]，这与本次实验结果吻合。本次实验结果还表明剂量为500 mg/kg的维生素C对睾丸染色体畸变和精子畸形的抑制作用明显低于相同剂量的GPC，而与250 mg/kg的GPC相接近，表明GPC对辐射引发的睾丸染色体畸变和精子畸形的防护作用要高于相同剂量的维生素C。
, 百拇医药
总之，本次实验结果表明，葡多酚可抑制60Co-γ射线诱发的睾丸染色体畸变和精子畸形，减轻睾丸组织脂质过氧化损伤，其作用强度约较相同剂量的维生素C高1倍，提示GPC对雄性生殖细胞辐射损伤有良好的防护作用，其机制与GPC的抗氧化活性密切相关。其最佳防护剂量尚有待与进一步探讨。
本课题受国家自然科学基金资助(39870678)
参考文献
[1] 国植，徐莉.原花青素：具有广阔发展前景的植物药.国外医学植物药分册，1996，11：196-204.
[2] Beladi L,Mucsi R,Pusztai M,et al.In vitro and in vivo antiviral effects of flavonids.CA,1983,98:200.
, http://www.100md.com
[3] Bombardelli E.Antioxidational effect of grape leucoanthocyanins.Fitoreerapia,1995,56:297.
[4] Kanner J,Frankel E,Granit R,et al.Natural Antioxidants in Grape and wines.J Agric Food Chen,1994,42:64-69.
[5] Blanco VZ,Auw JM,Sims CA,et al.Effects of processing on phenolics,wines.Adv Exp Med Biol，1998,434:327-340.
[6] 李寿祺.卫生毒理学基本原理与方法.成都：四川科学技术出版社，1987.450.
[7] 刘毓谷.卫生毒理学基础.第2版.北京：人民卫生出版社，1996.215.
[8] 王冰.电离辐射诱发哺乳动物生殖细胞染色体畸变.国外医学放射医学核医学分册，1998，17：8-12.
[9] 郑金龙，金一尊，沈瑜.肿瘤治疗增敏药.上海：上海科学技术出版社，1996.7-13.
[10] 何庆加，孙世镇.维生素C和E对γ射线诱发小鼠染色体损伤的防护效果.国外医学放射医学核医学分册，1994，18：71.
(收稿日期：2000-02-17), 百拇医药
单位：青岛大学医学院预防医学教研室，青岛 266021
关键词：葡多酚；染色体畸变；精子畸形；辐射防护
卫生毒理学杂志000404 摘要 【目的】 探讨葡多酚(GPC)对雄性生殖细胞辐射损伤的影响。【方法】 给予小鼠口服不同剂量GPC后，采用60Co-γ射线进行全身照射，剂量为0.1 Gy/d，连续4周，检测睾丸细胞染色体畸变率、精子畸形率及睾丸组织脂质过氧化水平等指标。【结果】 GPC高、中、低3个剂量组的睾丸细胞染色体畸变抑制率分别为84.78%、71.04%和39.40%；精子畸形防护度分别为89.89%、83.24%和38.56%；各实验组的睾丸组织氧化损伤均低于阳性对照组。以上差异均有显著性(P<0.01)。【结论】 葡多酚对雄性生殖细胞辐射损伤有良好的防护作用，其作用机制与GPC的抗氧化活性密切相关。
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Protective effect of grape procyanidins on male reproductive cells damage induced by radiation
LI Shi-ru,ZHONG Jin-yi
(Medical College of Qingdao University,Qingdao 266021,China.)
Abstract:【Objective】 To study the protective effect of grape procyandins(GPC) on the radioactive damage of male reproductive cells.【Methods】 After male mice were treated orally in the different doses of GPC,which were exposed to whole-body 60Coγ-rays at the dose of 0.1 Gy/day for 4 weeks.Then chromosome aberration of testicular cells,spermatozoa deformity,SOD activity and MDA content of testicle were measured.【Results】 Inhibition rates of testicular cells chromosome aberration in three treated groups were 84.78%,71.04% and 39.40% respectively,protective degrees of spermatozoa deformity were 89.89%,83.24% and 38.56% respectively,oxidative damage of testicle tissues were lower than the positive controls.These differences were all statically significant(P<0.01).【Conclusion】 GPC has a protective effect on male reproductive cells damage induced by radiation,the mechanism is closed related to antioxidational effect of GPC.
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Key words：Grape Procyanidins; Chromosome aberration; Spermatozoa deformity; Radiation protection
葡多酚(Grape Procyanidins,GPC)是从葡萄核中提取的一种天然植物多酚物质，据国外报道，GPC具有抗氧化、抗病毒、酶抑制活性、心血管活性等多种生物活性[1，2]，对辐射损伤有一定防护作用[3]，我们已进行了GPC对放射性DNA损伤防护作用的体内外研究(另外报道)。本次实验我们研究了GPC对60Co-γ射线照射引发的雄性生殖细胞辐射损伤的影响，并对其作用机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 山东省实验动物中心提供昆明种雄性小鼠，体重22～25 g。
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1.1.2 葡多酚(GPC) 本实验室制备，将新鲜龙眼葡萄弃汁取核，干燥粉碎后用溶剂浸提法所得[4]。高效液相色谱法测定[5]，含量>99%，标准品由日本岛田株式会社提供。
1.2 实验方法 设3个GPC剂量组及维生素C对照组、阳性对照组与阴性对照组，每组10只动物，按完全随机原则将受试动物分配到各组。高、中、低3个剂量组给予GPC的剂量分别为500、250、50 mg/kg，维生素C对照组给予维生素C500 mg/kg，阳性对照组和阴性对照组只给蒸馏水而不给GPC，各组动物灌胃液体量均为0.5 ml/只。于早晨辐射前30 min空腹经口灌胃给药，隔天1次，连续4周。实验期间将动物采用60Co-γ射线进行全身照射，照射条件为60Co-γ射线源，照射距离为90 cm，剂量率为89.4 cGy/min。阴性对照组不照射，其他各组动物照射剂量均为0.1 Gy/次，每天1次，每周5 d，总剂量为2.0 Gy(约为1/2半数致死剂量)。在末次照射的第2天将全部动物处死。
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1.3 观察指标及检测方法
1.3.1 睾丸精原细胞染色体畸变率 取一侧睾丸，分离曲细精管，剪碎后进行低渗处理，按常规染色体畸变实验方法制片和显微镜观察分析[6]。
1.3.2 精子畸形率 取双侧附睾，于磷酸盐缓冲生理盐水中剪碎，静置后吸取精子悬液，按常规方法进行制片和显微镜观察计数[7]。
1.3.3 睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量测定 取另一侧睾丸加生理盐水制成质量浓度为10%的组织匀浆，应用南京建成生物工程研究所提供的测试盒测定睾丸组织中SOD水平和MDA含量。
2 结果
2.1 睾丸精原细胞染色体畸变率 阳性对照组和阴性对照组的睾丸染色体畸变率分别为33.5%和2.4%，经χ2检验，差异有非常显著性(P<0.01)。GPC高、中、低3个剂量组的睾丸染色体畸变率分别为5.1%、9.7%和20.3%，与阳性对照组比较均降低，经χ2检验，差异有显著性(P<0.01)，各组睾丸染色体畸变率测定结果见表1。各实验组睾丸染色体畸变抑制率按公式(阳性对照组-实验组)/阳性对照组×100 %计算。
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2.2 精子畸形率 阳性对照组和阴性对照组的精子畸形率分别为41.7%和4.1%，经χ2检验，差异有非常显著性(P<0.01)。GPC高、中、低3个剂量组的精子畸形率分别为7.9%、10.4%和27.2%，与阳性对照组比较均降低，经χ2检验，差异均有显著性(P<0.01)，各组精子畸形率测定结果见表1。各实验组精子畸形防护度按公式(阳性对照组-实验组)/(阳性对照组-阴性对照组)×100%计算。
2.3 睾丸SOD活力和MDA含量 阳性对照组和阴性对照组的睾丸SOD活力分别为(1.75±0.12)NU/mg和(4.63±0.25)NU/mg，MDA含量分别为(1.18±0.07)nmol/mg和(0.72±0.06)nmol/mg，经t检验，差异均有显著性(P<0.01)。同阳性对照组比较，GPC高、中、低3个剂量组的SOD水平有不同程度升高，升高度分别为87.43%、47.43%和24.00%，而MDA含量则呈现不同程度降低，降低度分别为32.20%、26.27%和20.34%，经χ2检验，差异均有显著性(P<0.01)，睾丸SOD和MDA含量的测定结果见表2。各实验组SOD升高度与MDA降低度按公式(|阳性对照组-实验组|)/阳性对照组×100%计算。
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表1 小鼠睾丸染色体畸变率和精子畸形率(%) 组 别
辐射剂量
(Gy)
动物数
(只)
GPC剂量
(mg/kg)
睾丸染色体畸变率
精子畸形率
观察细胞数
(个)
畸变细胞数
, 百拇医药
(个)
畸变
率
抑制率
(%)
观察精子数
(个)
精子畸形数
(个)
畸变
率
防护度
(%)
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GPC高剂量组
2.0
10
500
1 000
51
5.1
84.78
1 000
79
7.9
89.89
, 百拇医药 GPC中剂量组
2.0
10
250
1 000
97
9.7
71.04
1 000
104
10.4
83.24
GPC低剂量组
, 百拇医药
2.0
10
50
1 000
203
20.3
39.40
1 000
272
27.2
38.56
维生素C对照组
, http://www.100md.com 2.0
10
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1 000
101
10.1
69.85
1 000
117
11.7
79.79
阳性对照组
2.0
, 百拇医药
10
0
1 000
335
33.5
0.00
1 000
417
41.7
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阴性对照组
0
10
, 百拇医药
0
1 000
24
2.4
——
1 000
41
4.1
——
与阳性对照组比较，χ2>6.63,P<0.01表2 小鼠睾丸SOD活力和MDA含量(
±s) 组 别, 百拇医药
照射剂量
(Gy)
SOD(NU/mg)
MDA(nmol/mg)
活力
升高度(%)
P值
含量
降低度(%)
P值
GPC高剂量组
2.0
3.28±0.23
, 百拇医药
87.43
<0.01
0.80±0.05
32.20
<0.01
GPC中剂量组
2.0
2.58±0.29
47.43
<0.01
0.87±0.06
26.27
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<0.01
GPC低剂量组
2.0
2.17±0.30
24.00
<0.01
0.94±0.03
20.34
<0.01
维生素C对照组
2.0
2.46±0.22
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40.57
<0.01
0.91±0.05
22.88
<0.01
阳性对照组
2.0
1.75±0.12
0.00
——
1.18±0.07
0.00
, 百拇医药
——
阴性对照组
0.0
4.63±0.25
164.57
<0.01
0.72±0.06
38.98
<0.01
与阳性对照组比较，t>2.878,P<0.01
3 讨论
3.1 GPC可抑制睾丸染色体畸变和精子畸形 从潜在的遗传危险考虑，探讨辐射引发的生殖细胞染色体畸变和精子畸形对评价辐射损伤具有重要意义。本次实验结果表明，小鼠经60Co-γ射线辐射后，各组动物睾丸染色体畸变率和精子畸形率均出现不同程度升高，说明经60Co-γ射线照射后，睾丸染色体和精子发生明显损伤，这同文献报道电离辐射可诱发生殖细胞内作为遗传基因载体的染色体畸变和精子畸形是一致的[8]。高、中、低剂量组的睾丸染色体畸变率均低于未给GPC的阳性对照组，且表现出随GPC剂量增大染色体畸变率、精子畸形逐渐降低的明显剂量反应关系。可以认为，在本次实验条件下，GPC对60Co-γ射线诱发的睾丸染色体畸变和精子畸形有良好的抑制作用，这同国外报道GPC具有抗辐射作用的实验结果是一致的[3]。
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3.2 GPC可减轻睾丸组织脂质过氧化损伤 自由基学说是放射线造成机体损伤的重要理论之一，辐射射线是外源性产生自由基的一个重要原因。经辐射后，机体可因自由基生成加强而使脂质过氧化反应增强[9]。本次研究阳性对照组睾丸SOD水平降低、MDA含量升高，表明照射后睾丸组织内产生氧化损伤，脂质过氧化产物的体内蓄积量增大。3个GPC实验组的睾丸组织脂质过氧化损伤的程度虽均高于阴性对照组，但比阳性对照组明显降低，且有剂量-反应关系，说明GPC对辐射引发的睾丸组织脂质过氧化损伤有良好抑制作用，这同文献报道GPC具有抗氧化、抗自由基损伤作用是一致的[1]，这可能是GPC对雄性生殖细胞辐射损伤防护作用的机制之一。
3.3 GPC防护作用高于同剂量的维生素C 根据报道维生素C 200～800 mg/kg对小鼠γ射线辐射诱发的染色体损伤有良好防护效果[10]，这与本次实验结果吻合。本次实验结果还表明剂量为500 mg/kg的维生素C对睾丸染色体畸变和精子畸形的抑制作用明显低于相同剂量的GPC，而与250 mg/kg的GPC相接近，表明GPC对辐射引发的睾丸染色体畸变和精子畸形的防护作用要高于相同剂量的维生素C。
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总之，本次实验结果表明，葡多酚可抑制60Co-γ射线诱发的睾丸染色体畸变和精子畸形，减轻睾丸组织脂质过氧化损伤，其作用强度约较相同剂量的维生素C高1倍，提示GPC对雄性生殖细胞辐射损伤有良好的防护作用，其机制与GPC的抗氧化活性密切相关。其最佳防护剂量尚有待与进一步探讨。
本课题受国家自然科学基金资助(39870678)
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(收稿日期：2000-02-17), 百拇医药