甲基汞对大鼠脑谷氨酸能神经元的免疫组化影响
作者：陈学敏 祝卫国 陈军
单位：同济医科大学环境卫生学教研室，武汉 430030
关键词：甲基汞；谷氨酸能神经元；免疫组织化学
卫生毒理学杂志000401 摘要 【目的】 研究甲基汞亚急性染毒诱导大鼠脑内谷氨酸能神经元免疫组化改变，探讨其毒性机制。【方法】 免疫组织化学方法。【结果】 在低剂量组(2 mg.kg-1.d-1×7 d)大鼠脑内谷氨酸免疫反应阳性细胞(Glu-IRPC)数目、积分光密度、阳性面积比在给药14 d时下降有显著性意义(P<0.05)。在高剂量组(10 mg.kg-1.d-1×7 d)，各时点大鼠各脑区Glu-IRPC的数目下降，积分光密度降低，阳性面积比下降均有显著性意义(P<0.05)，且Glu-IRPC的分支突起明显减少，有些细胞仅见胞体，未见突起。【结论】 甲基汞亚急性染毒可使大鼠脑内谷氨酸能神经元中谷氨酸水平降低。
, 百拇医药
The immunohistochemical effects of methylmercury on the glutamatergic neurons in rat brain
CHEN Xue-min,ZHU Wei-guo,CHEN Jun
(Department of Environmental Health,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
Abstract:【Objective】 This study was conducted to explore the effects of methylmercury subacute exposure on glutamatergic neurons in the rat brain as well as its toxic mechanism.【Methods】 Immunohistochemical technique was used.【Results】 The number of positive cell,the integrate optical density and the positive area ratio of glutamate immunoreactive positive cell (Glu-IRPC)decreased significantly in the rat brains in low dose group(2 mg.kg-1.d-1×7d)at the 14th day(P<0.05).Furthermore in the high dose group(10 mg.kg-1.d-1×7d),the number of positive cell,the integrate optical density and the positive area ratio of Glu-IRPC decreased significantly in the different parts of rat brains at all time points of observation (P<0.05).Meanwhile,the branch or process in some Glu-IRPC reduced obviously,and only the soma but no process could be seen in some cells.【Conclusion】 It is suggested that the methlymercury subacute intoxication resulted in the decrease of glutamate level in the glutamatergic neurons of rat brain.
, 百拇医药
Key words：Methylmercury; Glutamatergic neurons; Immunohistochemistry
甲基汞是一种具有极强神经毒作用的环境污染物，多年来各国学者一直致力于其神经毒作用机制研究。有研究表明[1，2]，中枢谷氨酸能神经元功能活动的异常可能与甲基汞的神经毒作用机制有关，但这些研究采用的方法都是体外生化测定法。因此，本研究拟从另一个侧面，即运用体内染毒免疫组织化学方法，去探讨甲基汞对中枢谷氨酸能神经元的影响，为进一步阐明其神经毒作用机制提供新的证据。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 氯化甲基汞(Methylmercury chloride,MMC;含量≥质量分数为98%，Merck)，多聚甲醛(Paraformaldehyde,Merck)，戊二醛(体积分数为25%，Merck)，Glutamate(Glu)鼠抗为Sigma公司产品；鼠PAP试剂盒，卫生部武汉生物制品研究所；其他试剂均为国产分析纯。Vibratome1 000振动切片机(Lancer,T.P.I公司，U.S.A),Nikon UFX-Ⅱ型显微照相系统(Nikon 日本)。
, 百拇医药
1.2 动物分组及处理 取健康成年雄性SD大鼠35只，体重180～220 g，实验室检疫1周后，随机分成7组，即对照组、低剂量组(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和高剂量组(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)，每组5只大鼠。MMC用双蒸水配制，按下述方式染毒动物。每日上午8∶30开始灌胃，灌胃量0.5 ml/100 g 体重，以首次灌胃日作为第1天。对照组：双蒸水，连续灌胃7 d,第14天处理动物。低剂量组：MMC 2 mg.kg-1.d-1,连续灌胃7 d。高剂量组：MMC 10 mg.kg-1.d-1，连续灌胃7 d。(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)组分别在第8、10、14天处理动物。
1.3 脑组织的固定和振动切片 大鼠经过40 mg/kg戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，固定在手术板上，暴露胸腔，经左心室升主动脉插管，剪开右心耳同时快速推注150 ml生理盐水，然后滴注4 ℃的固定液(0.1 mol/LPB pH7.4，质量浓度为2%的多聚甲醛，体积分数为1%的戊二醛)500 ml。调节滴速，先快后慢，持续约1.5 h。滴注结束后，开颅取出完整的大脑和小脑，将修整好的、已剔除脑膜的脑块放入4%多聚甲醛固定液中4 ℃后固定4 h，然后用0.01 mol/LPBS冲洗干净。用Vibratome1 000振动切片机作连续额状切片，含背侧海马最大截面的大脑切片厚40 μm，小脑切片厚30 μm。用PBS接片。
, 百拇医药
1.4 Glu免疫组织化学法(双PAP法)[3] (1)切片用PBS(0.01 mol/L，pH7.4)漂洗5 min×3；(2)体积分数为0.2%的Triton X-100/PBS液浸泡切片，室温30 min；(3)PBS漂洗5 min×3；(4)用体积分数为0.3%H2O2和体积分数为0.1%甲醇的PBS，室温下灭活内源性过氧化物酶30 min；(5)PBS漂洗5 min×3；(6)正常羊血清(1∶50)，37 ℃封闭1 h；(7)Glu鼠抗(1∶1 000),4 ℃反应72 h，每天取出，37 ℃摇床中摇动20 min；(8)PBS漂洗5 min×3；(9)抗鼠桥抗(1∶5)37 ℃×1 h；(10)PBS漂洗5 min×3；(11)单克隆鼠PAP(1∶5)，37 ℃×1h;(12)PBS漂洗5 min×3;(13)抗鼠桥抗(1∶5)37 ℃×30 min;(14)PBS漂洗5 min×3；(15)单克隆鼠PAP(1∶5)，37 ℃×30 min;(16)PBS漂洗5 min×3；(17)质量浓度为0.05%的联苯二胺(DAB)/体积分数为0.01%的H2O2显色3.5 min；(18)PBS终止显色后，贴片，常规脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.5 显微照相、图像分析及统计分析 (1)使用Nikon UFX-Ⅱ型自动曝光显微照相系统。选择适当部位，适当倍数照相，底片为富士彩色胶卷(100°)；(2)图像分析及统计分析：用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，对免疫组化反应的切片进行图像分析。所有切片放大倍数均为100。每只动物取2张切片，分别对顶叶大脑皮层，海马CA3区和齿状回DG、小脑进行分析。每个部位取2个视野。测量窗面积为1 752 222.281 2 μm\+2，分别测定阳性面积比[Aa(%)]，积分光密度(IOD)，平均阳性细胞数(n)并进行统计分析，分析方法为F检验和Student's检验。阳性面积比[Aa(%)]可综合反映阳性细胞的面积和数量，IOD反映着色深浅。
2 结果
2.1 正常情况下谷氨酸能神经元在中枢各脑区的分布 在光镜下观察可见，正常对照组中，胞浆为棕褐色的Glu免疫反应阳性神经细胞(Glu-IRPC)在大脑皮层散在分布，在海马主要分布于海马回(CA1,CA3)的锥体细胞层和齿状回(DG)的颗粒细胞层，海马CA\-3区细胞与大脑皮层细胞形态基本一致，仅细胞突起较短或稀少。Glu-IRPC在小脑主要分布于颗粒细胞，与文献报道基本一致[4]。Glu-IRPC的胞浆呈棕褐色颗粒状，细胞周围着色深，胞体呈锥体形，圆形、椭圆形，有一个或多个突起，有些突起有分支。
, 百拇医药
2.2 甲基汞亚急性染毒后谷氨酸能神经元在中枢各脑区的分布 甲基汞亚急性染毒后，高剂量组(10 mg.kg-1.d-1×7 d)同正常对照组相比，各时点第8、10、14天、各脑区Glu-IRPC的数目减少，着色减弱，阳性面积比下降(表1，P<0.05)，且随时间延长，这种减少和下降愈来愈明显，即第14天最明显。从细胞形态上看，Glu-IRPC胞体皱缩，呈多边形、三角形，突起分支减少且着色减弱。而低剂量组(2 mg.kg-1.d-1×7 d)在第10天开始略有减少，但无显著性，第14天各脑区Glu-IRPC的数目减少，着色减弱，阳性面积比下降均有显著性(P<0.05)，但减幅不大，见表1。
3 讨论
3.1 Glu是哺乳动物脑内最重要的兴奋性神经递质，它负责脑内大多数兴奋性突触活动，广泛地参与学习和记忆、感觉、心血管和神经内分泌控制及运动和其他生命功能活动[5，6]。当Glu能神经元功能异常时可引起兴奋性神经毒性，而后者与癫闲发病以及化学毒物的神经毒性作用有关[7]。有研究表明[1，2]，中枢谷氨酸能神经元功能活动的异常可能与甲基汞的神经毒作用机制有关，但目前对甲基汞中毒过程中脑内Glu能神经元功能改变的免疫组织化学研究报道极少。本实验利用免疫组织化学技术观察到大鼠甲基汞亚急性染毒后，低剂量组大鼠脑内Glu-IRPC的阳性细胞数、积分光密度(反映着色强度)、阳性面积比在第10天开始略有下降，第14天下降有显著性(P<0.05)，但降幅不大。而在高剂量组大鼠大脑皮层、海马锥体细胞层和颗粒细胞层、小脑颗粒细胞层的Glu-IRPC的数目下降，着色强度减弱，阳性面积比下降(P<0.05)，而且随时间延长愈来愈明显，第14天降幅最大。同时还发现高剂量组Glu-IRPC的分支突起明显减少，有些细胞仅见胞体，未见突起。提示甲基汞亚急性中毒与脑内Glu能神经元中Glu减少有关。
, 百拇医药
表1 甲基汞亚急性染毒大鼠脑内Glu免疫反应阳性神经细胞的图像分析结果(
±s) 组别
d
大脑皮层
海马DG
海马CA3
小脑
Aa(%)
IOD
n
Aa(%)
IOD
, 百拇医药
n
Aa(%)
IOD
n
Aa(%)
IOD
n
甲基汞
(低剂量)
8
8.92±2.42
28.08±2.31
97±15
, 百拇医药
22.71±3.22
33.93±1.53
232±19
26.49±7.65
49.43±4.31
170±21
7.57±0.34
8.30±0.66
74±8
10
10.62±0.61
26.38±5.10
, 百拇医药
99±19
19.30±0.55
30.87±6.22
212±17
23.74±1.39
36.18±5.37
164±13
6.96±0.71
7.22±0.84
72±6
14
7.02±0.19
, http://www.100md.com
23.96±5.03
83±9*
21.09±3.99
22.89±2.05*
226±23
19.95±0.87
31.56±2.86**
142±8*
4.61±0.89
6.28±1.77
66±8
甲基汞
, http://www.100md.com
(高剂量)
8
6.12±1.87
24.61±3.20
78±10*
20.92±0.93
24.40±4.28**
218±28
28.13±0.93
18.94±2.49**
166±15
3.61±0.38
, 百拇医药
6.86±2.97
67±11
10
3.86±0.84**
19.88±2.50**
67±8
18.65±1.18
10.37±3.27**
203±15
22.92±1.09**
14.44±3.40**
152±8*
, http://www.100md.com
3.51±0.52
6.66±1.50**
59±6*
14
3.96±1.27
18.38±4.27**
50±11
14.47±2.93**
8.59±0.40**
196±12*
17.38±1.27**
9.38±0.38**
, 百拇医药
138±8*
2.83±0.11
4.77±0.25**
42±4**
对照组
14
9.11±0.87
28.92±3.61
109±14
19.30±1.29
36.42±4.78
220±22
, 百拇医药
29.92±1.98
44.04±3.16
171±12
7.59±0.28
11.07±1.77
79±10
与对照组比较，P<0.05，P<0.013.2 神经细胞内Glu含量相当丰富，但绝大多数与递质传递无关，是备用的Glu贮库[8]。作为递质的Glu贮存在突触囊胞中，并分布于神经元细胞分支突起的末端。本研究观察到甲基汞中毒时各脑区Glu-IRPC分支减少及着色强度减弱，这种变化较胞体减少减弱意义更大，这说明甲基汞中毒时，神经系统内作为递质的Glu含量是降低的。
, http://www.100md.com
3.3 正常情况下，神经递质含量=净合成量-释放量+重摄取量，其中后两者与递质的突触传递有关，对神经递质含量的瞬间变化影响较大。因此甲基汞中毒时Glu-IRPC细胞数目减少，着色强度减弱等存在多种可能性，即净合成量减少，释放量增加，重摄取量减少三者各自单独或相互作用都可导致上述结果。但结合其他学者[1，2]和我们[9，10]的研究结果看，我们认为上述结果主要与释放量增加和重摄取量减少有关，而与净合成量减少关系不大。
综上所述，免疫组织化学研究发现，甲基汞亚急性中毒过程中大鼠脑内Glu能神经元数目下降，着色强度减弱，阳性面积比下降，且这种改变与其释放量增加，重摄取量减少有关。
本研究为国家自然科学基金资助项目的部分内容(39470603)
参考文献
[1] Brooks N.In vitro evidence for the role of glutamate in the CNS toxicity of mercury.Toxicology,1992,76:245-256.
, 百拇医药
[2] Aschner M,Mullaney KJ,Wagoner DE,et al.Intracellular glutathione(GSH)levels modulte mercuric chloride(MC)-and methylmecuric chloride (MeHgCl)-induced amino acid release from neonatal rat primary astrocytes cultures.Brain Res,1994,664:133-140.
[3] Bullock GR,Petrusz P.Techniques in immunocytochemistry.London:Academic Press Inc.1982，1:155-157.
[4] Otterson OP,J Storm-Mathisen.Glutamate and GABA-containing neurons in the mouse and rat brain,as demonstrated with a new immunocytochemical technique.J Comp Neurol,1984,229:374-392.
, http://www.100md.com
[5] Daw NW,Stein PSG,Fox K.The role of NMDA receptors in information processing.Ann Rev Neurosci,1993,16:207-222.
[6] Van den Pol AN,Trombley PQ.Glutamate neurons in hypothalamus regulate excitatory transmission.J Neurosci,1993,13:2829-2836.
[7] Dawson RJr,Beal MF,Bondy SC,et al.Excitotoxins,aging,and environmental neurotoxins:implications for understanding human neurodegenerative diseases.Toxicol Appl Pharmacol,1995,134:1-17.
[8] 韩济生.神经科学纲要.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993.339-340.
[9] 祝卫国，陈学敏.甲基汞对大鼠脑片谷氨酸释放的影响.卫生研究，1999，28：196-197.
[10] 祝卫国，陈学敏.甲基汞对大鼠脑突触体谷氨酸摄取的抑制作用.中国公共卫生学报，1999，18：98-100.
(收稿日期：1999-09-10), 百拇医药
单位：同济医科大学环境卫生学教研室，武汉 430030
关键词：甲基汞；谷氨酸能神经元；免疫组织化学
卫生毒理学杂志000401 摘要 【目的】 研究甲基汞亚急性染毒诱导大鼠脑内谷氨酸能神经元免疫组化改变，探讨其毒性机制。【方法】 免疫组织化学方法。【结果】 在低剂量组(2 mg.kg-1.d-1×7 d)大鼠脑内谷氨酸免疫反应阳性细胞(Glu-IRPC)数目、积分光密度、阳性面积比在给药14 d时下降有显著性意义(P<0.05)。在高剂量组(10 mg.kg-1.d-1×7 d)，各时点大鼠各脑区Glu-IRPC的数目下降，积分光密度降低，阳性面积比下降均有显著性意义(P<0.05)，且Glu-IRPC的分支突起明显减少，有些细胞仅见胞体，未见突起。【结论】 甲基汞亚急性染毒可使大鼠脑内谷氨酸能神经元中谷氨酸水平降低。
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The immunohistochemical effects of methylmercury on the glutamatergic neurons in rat brain
CHEN Xue-min,ZHU Wei-guo,CHEN Jun
(Department of Environmental Health,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
Abstract:【Objective】 This study was conducted to explore the effects of methylmercury subacute exposure on glutamatergic neurons in the rat brain as well as its toxic mechanism.【Methods】 Immunohistochemical technique was used.【Results】 The number of positive cell,the integrate optical density and the positive area ratio of glutamate immunoreactive positive cell (Glu-IRPC)decreased significantly in the rat brains in low dose group(2 mg.kg-1.d-1×7d)at the 14th day(P<0.05).Furthermore in the high dose group(10 mg.kg-1.d-1×7d),the number of positive cell,the integrate optical density and the positive area ratio of Glu-IRPC decreased significantly in the different parts of rat brains at all time points of observation (P<0.05).Meanwhile,the branch or process in some Glu-IRPC reduced obviously,and only the soma but no process could be seen in some cells.【Conclusion】 It is suggested that the methlymercury subacute intoxication resulted in the decrease of glutamate level in the glutamatergic neurons of rat brain.
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Key words：Methylmercury; Glutamatergic neurons; Immunohistochemistry
甲基汞是一种具有极强神经毒作用的环境污染物，多年来各国学者一直致力于其神经毒作用机制研究。有研究表明[1，2]，中枢谷氨酸能神经元功能活动的异常可能与甲基汞的神经毒作用机制有关，但这些研究采用的方法都是体外生化测定法。因此，本研究拟从另一个侧面，即运用体内染毒免疫组织化学方法，去探讨甲基汞对中枢谷氨酸能神经元的影响，为进一步阐明其神经毒作用机制提供新的证据。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 氯化甲基汞(Methylmercury chloride,MMC;含量≥质量分数为98%，Merck)，多聚甲醛(Paraformaldehyde,Merck)，戊二醛(体积分数为25%，Merck)，Glutamate(Glu)鼠抗为Sigma公司产品；鼠PAP试剂盒，卫生部武汉生物制品研究所；其他试剂均为国产分析纯。Vibratome1 000振动切片机(Lancer,T.P.I公司，U.S.A),Nikon UFX-Ⅱ型显微照相系统(Nikon 日本)。
, 百拇医药
1.2 动物分组及处理 取健康成年雄性SD大鼠35只，体重180～220 g，实验室检疫1周后，随机分成7组，即对照组、低剂量组(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和高剂量组(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)，每组5只大鼠。MMC用双蒸水配制，按下述方式染毒动物。每日上午8∶30开始灌胃，灌胃量0.5 ml/100 g 体重，以首次灌胃日作为第1天。对照组：双蒸水，连续灌胃7 d,第14天处理动物。低剂量组：MMC 2 mg.kg-1.d-1,连续灌胃7 d。高剂量组：MMC 10 mg.kg-1.d-1，连续灌胃7 d。(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)组分别在第8、10、14天处理动物。
1.3 脑组织的固定和振动切片 大鼠经过40 mg/kg戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，固定在手术板上，暴露胸腔，经左心室升主动脉插管，剪开右心耳同时快速推注150 ml生理盐水，然后滴注4 ℃的固定液(0.1 mol/LPB pH7.4，质量浓度为2%的多聚甲醛，体积分数为1%的戊二醛)500 ml。调节滴速，先快后慢，持续约1.5 h。滴注结束后，开颅取出完整的大脑和小脑，将修整好的、已剔除脑膜的脑块放入4%多聚甲醛固定液中4 ℃后固定4 h，然后用0.01 mol/LPBS冲洗干净。用Vibratome1 000振动切片机作连续额状切片，含背侧海马最大截面的大脑切片厚40 μm，小脑切片厚30 μm。用PBS接片。
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1.4 Glu免疫组织化学法(双PAP法)[3] (1)切片用PBS(0.01 mol/L，pH7.4)漂洗5 min×3；(2)体积分数为0.2%的Triton X-100/PBS液浸泡切片，室温30 min；(3)PBS漂洗5 min×3；(4)用体积分数为0.3%H2O2和体积分数为0.1%甲醇的PBS，室温下灭活内源性过氧化物酶30 min；(5)PBS漂洗5 min×3；(6)正常羊血清(1∶50)，37 ℃封闭1 h；(7)Glu鼠抗(1∶1 000),4 ℃反应72 h，每天取出，37 ℃摇床中摇动20 min；(8)PBS漂洗5 min×3；(9)抗鼠桥抗(1∶5)37 ℃×1 h；(10)PBS漂洗5 min×3；(11)单克隆鼠PAP(1∶5)，37 ℃×1h;(12)PBS漂洗5 min×3;(13)抗鼠桥抗(1∶5)37 ℃×30 min;(14)PBS漂洗5 min×3；(15)单克隆鼠PAP(1∶5)，37 ℃×30 min;(16)PBS漂洗5 min×3；(17)质量浓度为0.05%的联苯二胺(DAB)/体积分数为0.01%的H2O2显色3.5 min；(18)PBS终止显色后，贴片，常规脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.5 显微照相、图像分析及统计分析 (1)使用Nikon UFX-Ⅱ型自动曝光显微照相系统。选择适当部位，适当倍数照相，底片为富士彩色胶卷(100°)；(2)图像分析及统计分析：用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，对免疫组化反应的切片进行图像分析。所有切片放大倍数均为100。每只动物取2张切片，分别对顶叶大脑皮层，海马CA3区和齿状回DG、小脑进行分析。每个部位取2个视野。测量窗面积为1 752 222.281 2 μm\+2，分别测定阳性面积比[Aa(%)]，积分光密度(IOD)，平均阳性细胞数(n)并进行统计分析，分析方法为F检验和Student's检验。阳性面积比[Aa(%)]可综合反映阳性细胞的面积和数量，IOD反映着色深浅。
2 结果
2.1 正常情况下谷氨酸能神经元在中枢各脑区的分布 在光镜下观察可见，正常对照组中，胞浆为棕褐色的Glu免疫反应阳性神经细胞(Glu-IRPC)在大脑皮层散在分布，在海马主要分布于海马回(CA1,CA3)的锥体细胞层和齿状回(DG)的颗粒细胞层，海马CA\-3区细胞与大脑皮层细胞形态基本一致，仅细胞突起较短或稀少。Glu-IRPC在小脑主要分布于颗粒细胞，与文献报道基本一致[4]。Glu-IRPC的胞浆呈棕褐色颗粒状，细胞周围着色深，胞体呈锥体形，圆形、椭圆形，有一个或多个突起，有些突起有分支。
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2.2 甲基汞亚急性染毒后谷氨酸能神经元在中枢各脑区的分布 甲基汞亚急性染毒后，高剂量组(10 mg.kg-1.d-1×7 d)同正常对照组相比，各时点第8、10、14天、各脑区Glu-IRPC的数目减少，着色减弱，阳性面积比下降(表1，P<0.05)，且随时间延长，这种减少和下降愈来愈明显，即第14天最明显。从细胞形态上看，Glu-IRPC胞体皱缩，呈多边形、三角形，突起分支减少且着色减弱。而低剂量组(2 mg.kg-1.d-1×7 d)在第10天开始略有减少，但无显著性，第14天各脑区Glu-IRPC的数目减少，着色减弱，阳性面积比下降均有显著性(P<0.05)，但减幅不大，见表1。
3 讨论
3.1 Glu是哺乳动物脑内最重要的兴奋性神经递质，它负责脑内大多数兴奋性突触活动，广泛地参与学习和记忆、感觉、心血管和神经内分泌控制及运动和其他生命功能活动[5，6]。当Glu能神经元功能异常时可引起兴奋性神经毒性，而后者与癫闲发病以及化学毒物的神经毒性作用有关[7]。有研究表明[1，2]，中枢谷氨酸能神经元功能活动的异常可能与甲基汞的神经毒作用机制有关，但目前对甲基汞中毒过程中脑内Glu能神经元功能改变的免疫组织化学研究报道极少。本实验利用免疫组织化学技术观察到大鼠甲基汞亚急性染毒后，低剂量组大鼠脑内Glu-IRPC的阳性细胞数、积分光密度(反映着色强度)、阳性面积比在第10天开始略有下降，第14天下降有显著性(P<0.05)，但降幅不大。而在高剂量组大鼠大脑皮层、海马锥体细胞层和颗粒细胞层、小脑颗粒细胞层的Glu-IRPC的数目下降，着色强度减弱，阳性面积比下降(P<0.05)，而且随时间延长愈来愈明显，第14天降幅最大。同时还发现高剂量组Glu-IRPC的分支突起明显减少，有些细胞仅见胞体，未见突起。提示甲基汞亚急性中毒与脑内Glu能神经元中Glu减少有关。
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表1 甲基汞亚急性染毒大鼠脑内Glu免疫反应阳性神经细胞的图像分析结果(
±s) 组别d
大脑皮层
海马DG
海马CA3
小脑
Aa(%)
IOD
n
Aa(%)
IOD
, 百拇医药
n
Aa(%)
IOD
n
Aa(%)
IOD
n
甲基汞
(低剂量)
8
8.92±2.42
28.08±2.31
97±15
, 百拇医药
22.71±3.22
33.93±1.53
232±19
26.49±7.65
49.43±4.31
170±21
7.57±0.34
8.30±0.66
74±8
10
10.62±0.61
26.38±5.10
, 百拇医药
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19.30±0.55
30.87±6.22
212±17
23.74±1.39
36.18±5.37
164±13
6.96±0.71
7.22±0.84
72±6
14
7.02±0.19
, http://www.100md.com
23.96±5.03
83±9*
21.09±3.99
22.89±2.05*
226±23
19.95±0.87
31.56±2.86**
142±8*
4.61±0.89
6.28±1.77
66±8
甲基汞
, http://www.100md.com
(高剂量)
8
6.12±1.87
24.61±3.20
78±10*
20.92±0.93
24.40±4.28**
218±28
28.13±0.93
18.94±2.49**
166±15
3.61±0.38
, 百拇医药
6.86±2.97
67±11
10
3.86±0.84**
19.88±2.50**
67±8
18.65±1.18
10.37±3.27**
203±15
22.92±1.09**
14.44±3.40**
152±8*
, http://www.100md.com
3.51±0.52
6.66±1.50**
59±6*
14
3.96±1.27
18.38±4.27**
50±11
14.47±2.93**
8.59±0.40**
196±12*
17.38±1.27**
9.38±0.38**
, 百拇医药
138±8*
2.83±0.11
4.77±0.25**
42±4**
对照组
14
9.11±0.87
28.92±3.61
109±14
19.30±1.29
36.42±4.78
220±22
, 百拇医药
29.92±1.98
44.04±3.16
171±12
7.59±0.28
11.07±1.77
79±10
与对照组比较，P<0.05，P<0.013.2 神经细胞内Glu含量相当丰富，但绝大多数与递质传递无关，是备用的Glu贮库[8]。作为递质的Glu贮存在突触囊胞中，并分布于神经元细胞分支突起的末端。本研究观察到甲基汞中毒时各脑区Glu-IRPC分支减少及着色强度减弱，这种变化较胞体减少减弱意义更大，这说明甲基汞中毒时，神经系统内作为递质的Glu含量是降低的。
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3.3 正常情况下，神经递质含量=净合成量-释放量+重摄取量，其中后两者与递质的突触传递有关，对神经递质含量的瞬间变化影响较大。因此甲基汞中毒时Glu-IRPC细胞数目减少，着色强度减弱等存在多种可能性，即净合成量减少，释放量增加，重摄取量减少三者各自单独或相互作用都可导致上述结果。但结合其他学者[1，2]和我们[9，10]的研究结果看，我们认为上述结果主要与释放量增加和重摄取量减少有关，而与净合成量减少关系不大。
综上所述，免疫组织化学研究发现，甲基汞亚急性中毒过程中大鼠脑内Glu能神经元数目下降，着色强度减弱，阳性面积比下降，且这种改变与其释放量增加，重摄取量减少有关。
本研究为国家自然科学基金资助项目的部分内容(39470603)
参考文献
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(收稿日期：1999-09-10), 百拇医药