发酵法生产L-亮氨酸工业性试验研究
作者：陈辉芳 易建华 易长贤
单位：陈辉芳(广东环球大冢制药有限公司 顺德 528303)；易建华(中山医科大学2000级研究生 广州 510080)；易长贤(中山医科大学眼科中心 广州 510080)
关键词：L-亮氨酸；发酵；菌种
广东药学000413 摘要 基于中科院微生物研究所的L-亮氨酸发酵法生产研究小试基础上的中试工作，通过2m2罐规模的中试鉴定的基础上采用5m3罐发酵装置及与之匹配的提取设备进行了扩大试验，历时10个月，试验结果：连续3批产酸率达1.5%以上，最高达1.81%。
发酵法生产L-亮氨酸，是工业化生产L-亮氨酸的发展趋势，属于我国医药行业技术发展重点之一[1]。在中科院小试的基础上，进行工业性生产中试放大，通过2m3罐规模的中试鉴定后，采用5m3罐发酵装置及与之匹配的提取设备进行扩大试验，历时10个月。试验结果：连续3批产酸率达1.5%以上，最高达1.81%。
, http://www.100md.com
1 试验部分
1.1 试验设备
5m3罐发酵装置及与之匹配的提取设备，各种检测仪器等。
1.2 菌种
由中科院微生物研究所提供。该菌种系由钝齿棒状杆菌(Coryneba Charm Crenate)AS1，542经亚硝基胍和快中子处理得到的L-421菌株。
1.3 发酵液
在搅拌下将葡萄糖、硫酸铵、玉米浆、豆油等混匀即得。
1.4 试验方法与条件
1.4.1 发酵配方选择
, 百拇医药
实验确定采用的配方，见表1。
表1 发酵配方组成(%) 序号
原料名称
一级种子罐配比
二级种子罐配比
发酵配比
1
葡萄糖
3
3
15
2
硫酸铵
, 百拇医药
0.45
0.45
1.06
3
玉米浆
2
2
1.5
4
豆饼水解液
0.3
0.3
1
, 百拇医药 5
消沫剂
—
0.01
0.01
配料体积(L)
30
300
2000
1.4.2 工艺条件选择
经试验选择工艺条件见表2。[3～5]表2 工艺条件选择 工艺条件
斜面
, http://www.100md.com
50L种子罐
500L二级种子罐
5m3发酵罐
消毒温度(℃)
121
115
115
115
消毒时间(min)
20
5
5
5
, http://www.100md.com
接种量(%)
4支斜面
10
10
培养温度(℃)
30
27
27
27
培养时间(h)
24
20～30
5～8
, 百拇医药
40±
搅拌转速(r/min)
—
180
185
185
罐压(mPa)
—
0.1
0.1
0.09
通气量(m3/m3/min)
, http://www.100md.com
—
1∶0.6
1∶0.6
1∶0.7
1.5 分析方法
1.5.1 还原糖测定：改良裴林氏法
1.5.2 pH测定：酸度计测定
1.5.3 菌体生长测定(OD)值 取发酵液1ml用蒸馏水稀释10倍或25倍，以蒸馏水作空白，以波长620nm，杯厚0.5cm测得的光密度值。
1.5.4 L-亮氨酸含量测定 取发酵离心液，在新华1号滤纸上点样2μl，置正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)系统层析剂中上行层析，晾干后，用0.05%茚三酮显色，用氰化钾-茚三酮-乙二醇-甲醚处理后，置721型分光光度计于570nm波长、5mm光程下进行测定。
, http://www.100md.com
L-亮氨酸%=样品光密度值/标准品光密度值×100%
2 结果与讨论
2.1 发酵条件试验
2.1.1 通气量对L-亮氨酸产量的影响 结果见表3。
表3 通气量对L-亮氨酸产量的影响 通气量(V/V/min)
1∶0.5
1∶0.6
1∶0.7
1∶1
产酸率(%)
1.51
, 百拇医药
1.53
1.79
1.56
由表3可见，通气量增大到1∶0.7时，产酸率达到最大，这是因为增加通气量，一方面使KLa上升，改善溶氧传递；另一方面通气量适当增加，可将废气带走，改善了发酵环境。继续增大时，产酸率又下降，可见当通气量处于1∶0.7，发酵液中的溶氧浓度CL已略大于其临界溶氧浓度C临界[6]。这时则不能再增大通气量，如果再继续增大通气量，氧分压会随着上升，氧分压过大，会使菌种产生暂时的中毒现象而失活。因此，在实际生产中，务必控制其通气量为1∶0.7。尽可能有效地控制菌种对氧的呼吸。[7]
2.1.2 发酵过程中pH对L-亮氨酸产量的影响 结果见表4。表4 pH对L-亮氨酸产量的影响 pH值
, 百拇医药
6.2～6.3
6.4～6.5
6.8～6.9
产酸率(%)
1.74
1.75
1.35
从表4可知，pH对产酸量有很大的影响，当pH处于6.4～6.5时，产酸量最大，而继续增大pH，则反而使产酸量降低，其原因是该菌种在这个系统中同时进行着多条途径的代谢，因而产生不同的产物。其主要途径的选择受pH的影响很大。pH6.4～6.5最有利于菌种进行分泌L-亮氨酸的代谢，而当pH处于6.8～6.9或其它的值时，有利于选择其它的代谢途径，从而抑制了产L-亮氨酸的代谢[8，9]。因此，在实际生产中，一定要注意将系统的pH值控制在6.4～6.5范围内，使产酸量达到最大。
, 百拇医药
2.2 工业试验流程(略)
2.3 工业试验结果
测定了连续3批发酵液的产酸率，同时对980702批作了代谢图分析，结果见表5和图1。表5 工业性试验抽查连续3批结果 罐批
周期(h)
产酸率(%)
转化率(%)
放罐体积(m3)
离交收率(%)
总收率(%)
980701
45
, 百拇医药
1.53
12.8
2.2
63.7
31.8
980702
43
1.81
13.8
2.2
90.7
32.3
980703
, http://www.100md.com
40
1.75
15.4
2.3
87.2
52.8
平均值
42.3
1.70
14.0
2.23
79.2
38.48
, http://www.100md.com
图1 980702批代谢图
3 结论
3.1 通过工业性试验证实，中科院微生物研究所提供的L-421菌种产酸水平稳定。
3.2 为了降低成本，有必要对菌种进行进一步筛选、活化(包括采用基因工程手段[10])和深入进行发酵条件的研究，以期提高菌种的产酸率。
3.3 各种试验得出的工艺控制点对今后进一步推广发酵法生产L-亮氨酸提供了参考价值。有的参数有待更进一步的摸索。
3.4 产品销往天津氨基酸公司，应用效果好。
参考文献
1.国家药典委员会，北京快讯医药信息中心主编.医药快讯.1999，(116)：2～3
, 百拇医药
2.武汉大学，复旦大学生物系微生物学教研室编.微生物学.高等教育出版社，1989：17～23
3.邬行彦，熊宗贵，胡章助，编著.抗生素生产工艺学.化学工业出版社，1982：105～136
4.Ghose TK. et al. Advances in biochemical engineering. 1977.Vol.6,Springer-verlag
5.Aiba S,et al. Biochemical engineering,2nd edition,University of Tokyo Press,1973.
6.同3：85 101
7.Brown DE. Methods in microbiology Vol. Ⅱ，New York,Academic Press,1970
8.同2：213～217
9.沈同，王镜岩，赵邦悌，等编著.生物化学(下册).高等教育出版社，1994：265～275
10.暨南大学生物工程技术专业.基因工程.1991：74～77
(收稿：1999-12-18；修回：2000-02-28), 百拇医药
单位：陈辉芳(广东环球大冢制药有限公司 顺德 528303)；易建华(中山医科大学2000级研究生 广州 510080)；易长贤(中山医科大学眼科中心 广州 510080)
关键词：L-亮氨酸；发酵；菌种
广东药学000413 摘要 基于中科院微生物研究所的L-亮氨酸发酵法生产研究小试基础上的中试工作，通过2m2罐规模的中试鉴定的基础上采用5m3罐发酵装置及与之匹配的提取设备进行了扩大试验，历时10个月，试验结果：连续3批产酸率达1.5%以上，最高达1.81%。
发酵法生产L-亮氨酸，是工业化生产L-亮氨酸的发展趋势，属于我国医药行业技术发展重点之一[1]。在中科院小试的基础上，进行工业性生产中试放大，通过2m3罐规模的中试鉴定后，采用5m3罐发酵装置及与之匹配的提取设备进行扩大试验，历时10个月。试验结果：连续3批产酸率达1.5%以上，最高达1.81%。
, http://www.100md.com
1 试验部分
1.1 试验设备
5m3罐发酵装置及与之匹配的提取设备，各种检测仪器等。
1.2 菌种
由中科院微生物研究所提供。该菌种系由钝齿棒状杆菌(Coryneba Charm Crenate)AS1，542经亚硝基胍和快中子处理得到的L-421菌株。
1.3 发酵液
在搅拌下将葡萄糖、硫酸铵、玉米浆、豆油等混匀即得。
1.4 试验方法与条件
1.4.1 发酵配方选择
, 百拇医药
实验确定采用的配方，见表1。
表1 发酵配方组成(%) 序号
原料名称
一级种子罐配比
二级种子罐配比
发酵配比
1
葡萄糖
3
3
15
2
硫酸铵
, 百拇医药
0.45
0.45
1.06
3
玉米浆
2
2
1.5
4
豆饼水解液
0.3
0.3
1
, 百拇医药 5
消沫剂
—
0.01
0.01
配料体积(L)
30
300
2000
1.4.2 工艺条件选择
经试验选择工艺条件见表2。[3～5]表2 工艺条件选择 工艺条件
斜面
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50L种子罐
500L二级种子罐
5m3发酵罐
消毒温度(℃)
121
115
115
115
消毒时间(min)
20
5
5
5
, http://www.100md.com
接种量(%)
4支斜面
10
10
培养温度(℃)
30
27
27
27
培养时间(h)
24
20～30
5～8
, 百拇医药
40±
搅拌转速(r/min)
—
180
185
185
罐压(mPa)
—
0.1
0.1
0.09
通气量(m3/m3/min)
, http://www.100md.com
—
1∶0.6
1∶0.6
1∶0.7
1.5 分析方法
1.5.1 还原糖测定：改良裴林氏法
1.5.2 pH测定：酸度计测定
1.5.3 菌体生长测定(OD)值 取发酵液1ml用蒸馏水稀释10倍或25倍，以蒸馏水作空白，以波长620nm，杯厚0.5cm测得的光密度值。
1.5.4 L-亮氨酸含量测定 取发酵离心液，在新华1号滤纸上点样2μl，置正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)系统层析剂中上行层析，晾干后，用0.05%茚三酮显色，用氰化钾-茚三酮-乙二醇-甲醚处理后，置721型分光光度计于570nm波长、5mm光程下进行测定。
, http://www.100md.com
L-亮氨酸%=样品光密度值/标准品光密度值×100%
2 结果与讨论
2.1 发酵条件试验
2.1.1 通气量对L-亮氨酸产量的影响 结果见表3。
表3 通气量对L-亮氨酸产量的影响 通气量(V/V/min)
1∶0.5
1∶0.6
1∶0.7
1∶1
产酸率(%)
1.51
, 百拇医药
1.53
1.79
1.56
由表3可见，通气量增大到1∶0.7时，产酸率达到最大，这是因为增加通气量，一方面使KLa上升，改善溶氧传递；另一方面通气量适当增加，可将废气带走，改善了发酵环境。继续增大时，产酸率又下降，可见当通气量处于1∶0.7，发酵液中的溶氧浓度CL已略大于其临界溶氧浓度C临界[6]。这时则不能再增大通气量，如果再继续增大通气量，氧分压会随着上升，氧分压过大，会使菌种产生暂时的中毒现象而失活。因此，在实际生产中，务必控制其通气量为1∶0.7。尽可能有效地控制菌种对氧的呼吸。[7]
2.1.2 发酵过程中pH对L-亮氨酸产量的影响 结果见表4。表4 pH对L-亮氨酸产量的影响 pH值
, 百拇医药
6.2～6.3
6.4～6.5
6.8～6.9
产酸率(%)
1.74
1.75
1.35
从表4可知，pH对产酸量有很大的影响，当pH处于6.4～6.5时，产酸量最大，而继续增大pH，则反而使产酸量降低，其原因是该菌种在这个系统中同时进行着多条途径的代谢，因而产生不同的产物。其主要途径的选择受pH的影响很大。pH6.4～6.5最有利于菌种进行分泌L-亮氨酸的代谢，而当pH处于6.8～6.9或其它的值时，有利于选择其它的代谢途径，从而抑制了产L-亮氨酸的代谢[8，9]。因此，在实际生产中，一定要注意将系统的pH值控制在6.4～6.5范围内，使产酸量达到最大。
, 百拇医药
2.2 工业试验流程(略)
2.3 工业试验结果
测定了连续3批发酵液的产酸率，同时对980702批作了代谢图分析，结果见表5和图1。表5 工业性试验抽查连续3批结果 罐批
周期(h)
产酸率(%)
转化率(%)
放罐体积(m3)
离交收率(%)
总收率(%)
980701
45
, 百拇医药
1.53
12.8
2.2
63.7
31.8
980702
43
1.81
13.8
2.2
90.7
32.3
980703
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40
1.75
15.4
2.3
87.2
52.8
平均值
42.3
1.70
14.0
2.23
79.2
38.48
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图1 980702批代谢图
3 结论
3.1 通过工业性试验证实，中科院微生物研究所提供的L-421菌种产酸水平稳定。
3.2 为了降低成本，有必要对菌种进行进一步筛选、活化(包括采用基因工程手段[10])和深入进行发酵条件的研究，以期提高菌种的产酸率。
3.3 各种试验得出的工艺控制点对今后进一步推广发酵法生产L-亮氨酸提供了参考价值。有的参数有待更进一步的摸索。
3.4 产品销往天津氨基酸公司，应用效果好。
参考文献
1.国家药典委员会，北京快讯医药信息中心主编.医药快讯.1999，(116)：2～3
, 百拇医药
2.武汉大学，复旦大学生物系微生物学教研室编.微生物学.高等教育出版社，1989：17～23
3.邬行彦，熊宗贵，胡章助，编著.抗生素生产工艺学.化学工业出版社，1982：105～136
4.Ghose TK. et al. Advances in biochemical engineering. 1977.Vol.6,Springer-verlag
5.Aiba S,et al. Biochemical engineering,2nd edition,University of Tokyo Press,1973.
6.同3：85 101
7.Brown DE. Methods in microbiology Vol. Ⅱ，New York,Academic Press,1970
8.同2：213～217
9.沈同，王镜岩，赵邦悌，等编著.生物化学(下册).高等教育出版社，1994：265～275
10.暨南大学生物工程技术专业.基因工程.1991：74～77
(收稿：1999-12-18；修回：2000-02-28), 百拇医药