用PCR-SSP分型法研究HLA-DRB1与1型糖尿病易感性的关系
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中国糖尿病杂志 2000年第4期第8卷 短篇报道
陈浩量(广州市荔湾区第一人民医院内科 邮政编码 510170)；徐春生(广州市第一军医大学珠江医院内分泌科)；钟光恕(广州市中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科) ；程桦(广州市中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科) ；黎锋(广州市中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科) ；傅祖植(广州市中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科) 陈浩量 徐春生 钟光恕
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000417 目前倾向认为，HLA-DQB1和DRB1基因作为1型糖尿病(DM)的易感 基因，各自具有独立的作用，前者可促进1型DM的发生，后者则影响其临床进程。因此，DR 位点研究仍待深入。自1992年Zetterquist等[1]首次试用序列特异引物PCR(PCR-S SP)技术检测某些HLA-DRB1基因以来，PCR-SSP技术得到很大的发展，目前它已成为最先进 的HLA-DRB1分型方法之一，但其用于1型DM易感性与HLA-DRB1关系的研究尚少见报道。
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对象和方法
一、研究对象
均为无血缘关系的华南籍汉族人，1型DM 64例，男33例，女31例，平均起病年龄23.40±10 .60(3～49)岁，诊断依据WHO 1985年的标准[2]。健康对照者72例，男、女各36 例，年龄15～56(26.7±12.3)岁，无糖尿病家族史。
二、HLA-DRB1分型方法
1.DNA提取：用酚-氯仿抽提法提取外周血白细胞DNA。
2.PCR扩增：①标准品：HLA-DRB1*0405(纯)，DRB1*07(纯)，DRB1*0802(纯)，DRB1*0901/1 701，DRB1*11(纯)，DRB1*1202(纯)及DRB1*1301/09 DNA，由上海市免疫学研究所提供；HLA -DRB1*0101(HOM-2，纯)，DRB1*1602(RML，纯)，DRB1*0301(PF04015，纯)，DRB1*1401( AMALA，纯)标准株，由新加坡国立大学Chan Soh-Ha教授赠送，经常规培养、传代，抽 提DNA 备用。②引物：HLA-DRB1特异引物按照Tiercy等设计的序列[3]，其余各序列特异 引物参照已发表的HLA Class Ⅱ序列[4]设计，由上海细胞生物学研究所合成。引 物序列见表1，各引物组合见表2。③PCR扩增：采用套式PCR方案，第一步以DRBP1/DRBP2引 物扩增HLA-DRB-exon2，其产物稀释105～106倍后分别以7对组特异引物进行第二步扩 增。25μl反应体系含50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、1 20 μmol/L dNTP及0.5μ Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)、0.3μmol/L引物、100μg 基因组DNA。循环参数：94℃变性30秒，56℃复性40秒，72℃延伸40秒，循环30次。
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3.电泳：取PCR产物10μl，20%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外光下观察荧光带、拍 照、记录。
4.质量控制：每对序列特异性引物均对11株DNA标准品同时扩增，观察其扩增模式；每次扩 增均重复操作一次；每次扩增均设阳性对照及空白对照。
三、统计学处理
病人组与对照组基因频率比较用χ2检验，Yate's连续校正，Woolf和Haldane方法计算相 对危险度(RR，relative risk)。
表1 引物序列、长度、位置及温度值 引物名称
序列(5’-3’)
位置(aa)
温度(℃)
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DRBP1
CCG GAT CCT TCG TGT CCC CAG AGC AC
-6
62
DRBP2
TCG CCG CTG CAC TGT GAA G
88～94
64
DR1P
TG TGG CAG CTT AAG TTT GAA
8～14
, http://www.100md.com
56
DR2P
TC CTG TGG CAG CCT AAG AGG
7～13
64
DR3P
CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC
6～12
56
DR4P
T TTC TTG GAG GTT AAA C
6～13
, 百拇医药
56
DR7P
GTG CAG TTC CTG GAA AGA CT
24～30
60
DR9P1
GG ACG GAG CGG GTG CGG TAT
20～26
68
DR9P2
C GTA GTT GTG TCT GCA CAC
, http://www.100md.com 78～84
58
DR10P
C AGA CCA CGT TTC TTG GAG G
3～10
62
表2 引物组合 上游引物
下游引物
扩增等位基因
产物大小(bp)
DRBP1
DR1P
, http://www.100md.com
DR2P
DR3P
DR4P
DR7P
DR9P1
DR10P
DRBP2
DRBP2
DRBP2
DRBP2
DRBP2
DRBP2
DR9P2
, 百拇医药
DRBP2
DRB-exon2
D R1
DR2
DR3组△
DR4
DR7
DR9
DR10
292
260
263
267
, 百拇医药
265
213
200
274
注：△指包括DR3、DR8、DR11～14等一组基因
结 果
一、方法学鉴定
7对组特异性引物对11个DNA标准品的扩增结果显示，各特异引物只扩增出相应的等位基因， 对其它基因不产生交叉扩增，且扩增模式稳定。重复操作结果的重现率及阳性对照管的重现率100%。空白对照管未出现假阳性。 二、病人组与对照组基因频率比较(表3)
DR1、DR2、DR4、DR7、DR9、DR10频率两组无显著性差异；DR3组频率对照组显著高于IDDM组 (P<0.05,RR=0.38)。
, 百拇医药
表3 1型DM组和对照组HLA-DRB 1各
等位基因频率比较(例，%) 等位基因
1型DM组(n=64)
对照组(n=78)
RR
P值
DR1
0 0
0 0
—
>0.05
DR2
, http://www.100md.com
20 31.3
26 36.6
—
>0.05
DR3组
19 29.7
38 53.5
0.38
<0.01
DR4
10 15.6
9 12.7
—
, http://www.100md.com
>0.05
DR7
8 12.5
7 9.7
—
>0.05
DR9
30 46.9
24 33.3
—
>0.05
DR10
0 0
, 百拇医药
5 6.9
—
讨 论
本研究显示PCR-SSP用于HLA-DRB1分型具有良好的特异性和敏感性，且结果稳定。
本组资料DR1、DR2、DR4、DR7、DR9、DR10与1型DM易感性无关，与国内多数报道一致，而与 范氏[5]报道的中国南方人群DR9与1型DM易感性正相关情形有所不同。DR9对中国人 1型DM易感性的作用值得进一步探讨。
既往研究显示，与其他种族不同，中国人群1型DM易感性与HLA-DR2、DR4无相关。本组资料 再次证实了中国人群的这一特殊性。由此看来，很难以HLA-DRB1分型方法学的不同来解释 中国人与其他人种的这种差异。已发表的HLA核苷酸序列[4]显示HLA-DR4有11个等 位基因(亚型)，DR2有4个等位基因。近年有研究[6～8]证实只有某些DR4等位基因 与1型DM易感性有关，另一些则无关。DR2可能亦存在类似现象。因此，DR4、DR2在1型DM易 感性中的确切作用仍待深入研究。
, 百拇医药
值得注意的是，本文DR3组频率对照组显著高于1型DM病人组。由于DR3组包括DR3、DR8、DR1 1～14等多个等位基因，故上述差异的确切意义仍有待阐明。目前为止多数报道中国人群1型 DM与DR3正相关，与DR8、DR11～14无相关。例外的是在一组糖尿病合并Grave's病患者HLA类 型分布研究[9]中，DR5(DR11，12)频率对照组显著高于病人组。本组DR3与1型DM的 关系如何，是否存在一个与1型DM有着较强负相关的基因，以至掩盖了DR3与1型DM的正相关? 有待进一步分型研究。
严棠广东省科委重点科技攻关项目基金资助课题
参 考 文 献
1，Zetterquist H,Olerup O.Identification of the HLA-DRB1*04-DRB1*07 and DRB1*09 alleles by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours.Human Immunol,1992,34:64.
, http://www.100md.com
2，Report of a WHO Study Group.Health Organization Technical Report Series:727.
3，Tiercy JM,Claudine G,Bernard M,et al.Application of HLA-DR oligotyping to 110 kidney transplant patients with doubtful serological typing.Transplantations,19 91,51:1110.
4，Steven GEM,Julin GB.HLA Class Ⅱ nucleotide sequence.Immunogenetics,1991,33:32 1.
5.范丽安，徐静娟，丁惠娟，等.HLA和胰岛素依赖型糖尿病.上海免疫学杂志，1983，3：16 3.
, 百拇医药
6，ablo M,Jorge ML,Jose M,et al.High frequency of HLA-DRB1* 0405(Dw5)-DQw8 hap lotype in spaniards and its relationship to diabetes susceptibility.Human Immuno logy,1990,32:170.
7，Sanjeevi CB,Hook P,Landin-Ollson M,et al.DR4 subtypes and their molecular pro perties in a population-based study of Swedish children diabetes.Tissue Antigen s,1996,47:275.
8，Undlien DE,Friede T,Rammensee HG,et al.HLA-encoded genetic predisposition in IDDM—DR4 subtypes may be associated with different degrees of protection.Diabet es,1997,46:143.
9，齐今吾，赵晓娟，王本初，等.我国糖尿病合并Grave's病患者HLA类型分布研究.中国医科 大学学报，1987，16：50.
收稿：1999-08-24
修回：2000-04-12, 百拇医药
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000417 目前倾向认为，HLA-DQB1和DRB1基因作为1型糖尿病(DM)的易感 基因，各自具有独立的作用，前者可促进1型DM的发生，后者则影响其临床进程。因此，DR 位点研究仍待深入。自1992年Zetterquist等[1]首次试用序列特异引物PCR(PCR-S SP)技术检测某些HLA-DRB1基因以来，PCR-SSP技术得到很大的发展，目前它已成为最先进 的HLA-DRB1分型方法之一，但其用于1型DM易感性与HLA-DRB1关系的研究尚少见报道。
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对象和方法
一、研究对象
均为无血缘关系的华南籍汉族人，1型DM 64例，男33例，女31例，平均起病年龄23.40±10 .60(3～49)岁，诊断依据WHO 1985年的标准[2]。健康对照者72例，男、女各36 例，年龄15～56(26.7±12.3)岁，无糖尿病家族史。
二、HLA-DRB1分型方法
1.DNA提取：用酚-氯仿抽提法提取外周血白细胞DNA。
2.PCR扩增：①标准品：HLA-DRB1*0405(纯)，DRB1*07(纯)，DRB1*0802(纯)，DRB1*0901/1 701，DRB1*11(纯)，DRB1*1202(纯)及DRB1*1301/09 DNA，由上海市免疫学研究所提供；HLA -DRB1*0101(HOM-2，纯)，DRB1*1602(RML，纯)，DRB1*0301(PF04015，纯)，DRB1*1401( AMALA，纯)标准株，由新加坡国立大学Chan Soh-Ha教授赠送，经常规培养、传代，抽 提DNA 备用。②引物：HLA-DRB1特异引物按照Tiercy等设计的序列[3]，其余各序列特异 引物参照已发表的HLA Class Ⅱ序列[4]设计，由上海细胞生物学研究所合成。引 物序列见表1，各引物组合见表2。③PCR扩增：采用套式PCR方案，第一步以DRBP1/DRBP2引 物扩增HLA-DRB-exon2，其产物稀释105～106倍后分别以7对组特异引物进行第二步扩 增。25μl反应体系含50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、1 20 μmol/L dNTP及0.5μ Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)、0.3μmol/L引物、100μg 基因组DNA。循环参数：94℃变性30秒，56℃复性40秒，72℃延伸40秒，循环30次。
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3.电泳：取PCR产物10μl，20%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外光下观察荧光带、拍 照、记录。
4.质量控制：每对序列特异性引物均对11株DNA标准品同时扩增，观察其扩增模式；每次扩 增均重复操作一次；每次扩增均设阳性对照及空白对照。
三、统计学处理
病人组与对照组基因频率比较用χ2检验，Yate's连续校正，Woolf和Haldane方法计算相 对危险度(RR，relative risk)。
表1 引物序列、长度、位置及温度值 引物名称
序列(5’-3’)
位置(aa)
温度(℃)
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DRBP1
CCG GAT CCT TCG TGT CCC CAG AGC AC
-6
62
DRBP2
TCG CCG CTG CAC TGT GAA G
88～94
64
DR1P
TG TGG CAG CTT AAG TTT GAA
8～14
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56
DR2P
TC CTG TGG CAG CCT AAG AGG
7～13
64
DR3P
CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC
6～12
56
DR4P
T TTC TTG GAG GTT AAA C
6～13
, 百拇医药
56
DR7P
GTG CAG TTC CTG GAA AGA CT
24～30
60
DR9P1
GG ACG GAG CGG GTG CGG TAT
20～26
68
DR9P2
C GTA GTT GTG TCT GCA CAC
, http://www.100md.com 78～84
58
DR10P
C AGA CCA CGT TTC TTG GAG G
3～10
62
表2 引物组合 上游引物
下游引物
扩增等位基因
产物大小(bp)
DRBP1
DR1P
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DR2P
DR3P
DR4P
DR7P
DR9P1
DR10P
DRBP2
DRBP2
DRBP2
DRBP2
DRBP2
DRBP2
DR9P2
, 百拇医药
DRBP2
DRB-exon2
D R1
DR2
DR3组△
DR4
DR7
DR9
DR10
292
260
263
267
, 百拇医药
265
213
200
274
注：△指包括DR3、DR8、DR11～14等一组基因
结 果
一、方法学鉴定
7对组特异性引物对11个DNA标准品的扩增结果显示，各特异引物只扩增出相应的等位基因， 对其它基因不产生交叉扩增，且扩增模式稳定。重复操作结果的重现率及阳性对照管的重现率100%。空白对照管未出现假阳性。 二、病人组与对照组基因频率比较(表3)
DR1、DR2、DR4、DR7、DR9、DR10频率两组无显著性差异；DR3组频率对照组显著高于IDDM组 (P<0.05,RR=0.38)。
, 百拇医药
表3 1型DM组和对照组HLA-DRB 1各
等位基因频率比较(例，%) 等位基因
1型DM组(n=64)
对照组(n=78)
RR
P值
DR1
0 0
0 0
—
>0.05
DR2
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20 31.3
26 36.6
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>0.05
DR3组
19 29.7
38 53.5
0.38
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DR4
10 15.6
9 12.7
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DR7
8 12.5
7 9.7
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DR9
30 46.9
24 33.3
—
>0.05
DR10
0 0
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讨 论
本研究显示PCR-SSP用于HLA-DRB1分型具有良好的特异性和敏感性，且结果稳定。
本组资料DR1、DR2、DR4、DR7、DR9、DR10与1型DM易感性无关，与国内多数报道一致，而与 范氏[5]报道的中国南方人群DR9与1型DM易感性正相关情形有所不同。DR9对中国人 1型DM易感性的作用值得进一步探讨。
既往研究显示，与其他种族不同，中国人群1型DM易感性与HLA-DR2、DR4无相关。本组资料 再次证实了中国人群的这一特殊性。由此看来，很难以HLA-DRB1分型方法学的不同来解释 中国人与其他人种的这种差异。已发表的HLA核苷酸序列[4]显示HLA-DR4有11个等 位基因(亚型)，DR2有4个等位基因。近年有研究[6～8]证实只有某些DR4等位基因 与1型DM易感性有关，另一些则无关。DR2可能亦存在类似现象。因此，DR4、DR2在1型DM易 感性中的确切作用仍待深入研究。
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值得注意的是，本文DR3组频率对照组显著高于1型DM病人组。由于DR3组包括DR3、DR8、DR1 1～14等多个等位基因，故上述差异的确切意义仍有待阐明。目前为止多数报道中国人群1型 DM与DR3正相关，与DR8、DR11～14无相关。例外的是在一组糖尿病合并Grave's病患者HLA类 型分布研究[9]中，DR5(DR11，12)频率对照组显著高于病人组。本组DR3与1型DM的 关系如何，是否存在一个与1型DM有着较强负相关的基因，以至掩盖了DR3与1型DM的正相关? 有待进一步分型研究。
严棠广东省科委重点科技攻关项目基金资助课题
参 考 文 献
1，Zetterquist H,Olerup O.Identification of the HLA-DRB1*04-DRB1*07 and DRB1*09 alleles by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours.Human Immunol,1992,34:64.
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2，Report of a WHO Study Group.Health Organization Technical Report Series:727.
3，Tiercy JM,Claudine G,Bernard M,et al.Application of HLA-DR oligotyping to 110 kidney transplant patients with doubtful serological typing.Transplantations,19 91,51:1110.
4，Steven GEM,Julin GB.HLA Class Ⅱ nucleotide sequence.Immunogenetics,1991,33:32 1.
5.范丽安，徐静娟，丁惠娟，等.HLA和胰岛素依赖型糖尿病.上海免疫学杂志，1983，3：16 3.
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6，ablo M,Jorge ML,Jose M,et al.High frequency of HLA-DRB1* 0405(Dw5)-DQw8 hap lotype in spaniards and its relationship to diabetes susceptibility.Human Immuno logy,1990,32:170.
7，Sanjeevi CB,Hook P,Landin-Ollson M,et al.DR4 subtypes and their molecular pro perties in a population-based study of Swedish children diabetes.Tissue Antigen s,1996,47:275.
8，Undlien DE,Friede T,Rammensee HG,et al.HLA-encoded genetic predisposition in IDDM—DR4 subtypes may be associated with different degrees of protection.Diabet es,1997,46:143.
9，齐今吾，赵晓娟，王本初，等.我国糖尿病合并Grave's病患者HLA类型分布研究.中国医科 大学学报，1987，16：50.
收稿：1999-08-24
修回：2000-04-12, 百拇医药