一氧化氮在实验性骨关节炎软骨细胞凋亡中的作用
作者：彭丹 孙材江 周江南
单位：彭丹(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院骨科)；孙材江(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院骨科)；周江南(湖南医科大学附属湘雅医院骨科)
关键词：一氧化氮；骨关节炎；软骨；细胞凋亡
中华风湿病学杂志000412 【摘 要】 目的 观察一氧化氮(NO)在实验性骨关节炎(OA)关节滑液中的动态变化，并探讨NO在实验性OA软骨细胞凋亡中的作用。方法 用原位末端标记法以及镀铜镉还原法对实验性OA软骨细胞凋亡及关节滑液中的NO含量进行检测。结果 实验性OA中NO水平显著高于正常对照组，且随制动时间延长，NO水平逐渐升高，6周达高峰。此时也出现较多软骨细胞凋亡现象，应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME后，关节液中NO含量降低，软骨细胞凋亡现象减轻。结论 NO是引起实验性OA中软骨细胞凋亡的重要介质之一。
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The regulation effect of NO in the apoptosis of chondrocytes in experimental OA
PENG Dan*,SUN Caijiang,ZHOU Jiangnan.
Department of Orthopaedics,Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410011,China
【Abstract】 Objective To observe the effects of dynamic change of nitric oxide (NO) in synovial fluid (SF) in experimental OA and investigate NO and nitric oxide synthetase (NOS) inhibitor L-NAME participates in apoptosis of chondrocytes in experimental OA.Methods Apoptosis of chondrocytes was determined by TUNEL and the levels of NO in SF by reduction.Results The level of NO in experimental OA was higher than that of normal control group.As time of immobilization was prolonged,the levels of NO were gradually increasing,and got the hightest piont at week 6.After L-NAME was applied introvenously,the NO centents and the TUNEL-positive chondrocytes were decreased.Conclusion The NO produced by chondrytes is involved in the process of cartilage lesions.It is a major trigger for apoptosis of chondrocytes in experimental OA.
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【Key words】 Nitric oxide; Osteroarthritis; Cartilage; Apoptosis
一氧化氮(NO)是一种广泛存在于生物体内的小分子生理介质，也是一种自由基，由L-精氨酸经一氧化氮合酶(NOS)催化生成。近年来，不仅从生物学及病理学等方面对NO进行较为广泛的研究，而且随着对一氧化氮认识的逐步加深，NO在骨关节炎(OA)发病中的作用日益受到重视，Farrell等[1]发现类风湿关节炎及骨关节炎患者血清及关节液中NO含量增高，用NOS的抑制剂L-NAME可抑制免疫佐剂性关节炎动物模型的骨关节炎发作程度[2]。George等[3]利用软骨组织细胞培养技术发现IL-1、TNF、LPS等均可刺激软骨细胞产生大量NO。高含量的NO能使软骨产生降解作用，Francisco等[4]首次发现NO可引起体外培养的软骨细胞发生凋亡，但作者未作整体水平研究。近来研究表明，骨性关节炎中软骨细胞存在凋亡现象，其机制是否与NO有关，为此我们采用兔膝关节制动引起的实验性OA模型[5]，检测关节滑液中NO含量的动态变化，并观察NOS抑制剂L-NAME对软骨细胞凋亡的影响，以探讨NO在实验性OA中对软骨细胞凋亡引起的作用，为阐明骨性关节炎发生的机制及其防治提供新的实验依据。
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1 材料与方法
1.1 分组及模型制作：新西兰健康白兔28只，雌雄不限，平均体重2.5 kg，右后下肢膝关节伸直位石膏管型固定。实验动物分两组：Ⅰ石膏固定组；Ⅱ L-NAME+石膏固定组。石膏固定后，由兔耳缘静脉中注射L-NAME 15 mg/kg(溶于1 ml生理盐水)，每周注射2次。按观察时间分为2、4、6周三个时期，并分别按期进行观察，每期4只。4只用于正常对照组。
1.2 膝关节滑液的抽取：施行膝关节穿刺证实刺入关节腔后，注入0.9%生理盐水1 ml，反复回抽并注入3次后，再尽量将液体抽出并注入试管内，封存于-70 ℃低温环境内备测。
1.3 NO-2测定：鉴于NO的性质极不稳定，在体内、体外均能很快生成亚硝酸盐和硝酸盐，因此测定标本中的亚硝酸盐和硝酸盐的浓度可作为衡量NO合成的指标。本实验对亚硝酸盐的测定参照文献[6]报告，采用镀铜镉还原法，抽取标本0.3 ml，加重蒸水0.6 ml，5%硫酸锌0.3 ml，0.3 mol NaOH 0.3 ml，混匀置4 ℃冰箱内20 min，10 000 r/min，离心5 min，取上清液1 ml加入镀铜镉反应80 min，收集上液1 ml与不同亚硝酸钠标准品分别加1%磺胺(5%磷酸配制)，0.1% N-1萘乙二胺盐酸盐水溶液各0.5 ml混合，置室温10 min，用分光光度计测A546值。根据不同浓度标准品A值绘制标准曲线。按照样品A值在标准曲线上查出样品含量。
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1.4 TUNEL末端荧光标记法：以Boehringer Mann公司细胞凋亡检测试剂盒，对软骨细胞DNA断端进行标记。按说明进行操作：软骨组织行冰冻切片后，用4%多聚甲醛溶液在室温下固定20 min，然后加入细胞通透液(0.1% TritonX-100+0.1%枸橼酸钠)，0.01 mol/L PBS洗2次，擦片后加入50 μl TUNEL反应混合液，在37 ℃温箱内加盖孵育60 min，PBS洗3次后，置于荧光显微镜下观察，对有荧光显色者可确认为具有细胞凋亡特征。
2 结 果
2.1 实验性OA中膝关节滑液亚硝酸盐的动态变化：实验组中亚硝酸盐水平(
±s)在2、4、6周时分别为(20.3±2.6)、(41.4±1.9)、(86.6±4.6) μmol/L，各试验组中NO水平明显高于正常对照组(6.7±1.7) μmol/L(P<0.01)，制动后2周开始明显升高，6周达高峰。
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2.2 L-NAME对膝关节滑液中亚硝酸盐水平的影响：实验动物耳缘静脉注射L-NAME后，可降低其关节液中亚硝酸盐的水平，在2～6周时，分别为(11.5±1.8)、(27.3±4.1)、(60.3±3.7) μmol/L，与单纯固定组比较差异有显著性(P<0.01)，但仍高于正常对照组。
2.3 TUNEL荧光末端标记：显微荧光镜下观察制动6周后的全层软骨细胞核时，可见有荧光标记的凋亡细胞(图1)；而用L-NAME制动6周时，发现有荧光标记的凋亡细胞较单纯制动6周时明显减少，而且主要分布于表中层，并呈散在性分布(图2)。在正常对照组中则未见荧光标记的软骨细胞(图3)。
3 讨 论
目前对于细胞凋亡发生的机制尚不清楚。近期的研究结果表明，自由基不仅存在于细胞凋亡早期，而且由其造成的损害也可出现于生命后期的退行性疾病中。细胞凋亡细胞中的反应性氧属(ROS)增加，同时其清除反应性氧属的能力相应地下降。大多数细胞凋亡障碍的细胞表现为反应性氧属分子大量减少。若调节细胞内ROS的含量改变，则其死亡率亦随之改变。此种变化提示ROS参与并可调节细胞凋亡的形成过程[7]。NOS作为内源性ROS产生系统之一，在软骨细胞损害的过程中有高表达，且可产生高含量活性很强的自由基NO[3]。有人发现NO释放复合物作为一个NO的供体可以通过一定时间和浓度依赖的方式诱导软骨细胞发生凋亡。在Francisco等的体外试验中发现NO在软骨细胞凋亡中起重要作用，其他一系列细胞调控因子如IL-1、TNF、LPS、氧自由基等均不能诱导软骨细胞发生凋亡现象。由此可以推论NO是引起软骨细胞凋亡的主要介质。NO可能通过以下四个方面的机制使细胞发生凋亡：①抑制三羧酸循环中乌头酸酶的活性，使细胞氧化代谢和呼吸受到干扰，糖原分解，导致糖原衰竭；②直接与某些含亚铁原卟啉的铁离子结合，形成亚硝酰络合物，造成线粒体损害；③引起核酸亚硝酰化，破坏DNA双螺旋结构；④影响细胞内的其他靶分子，调节第二信使，诱导非依赖于基因组DNA损伤的细胞凋亡。业已证实，实验动物关节制动后的病理变化类似于临床上所见的骨性关节炎，因此，可利用这种动物模型对骨性关节炎进行研究[5]。研究表明制动后关节软骨细胞存在凋亡现象[8]。为了查明其是否与NO有关，我们检测了关节液中NO的浓度。结果发现，在实验性OA中NO水平显著高于正常对照组(P<0.01)，且随制动时间延长NO水平逐渐升高，6周达高峰。TUNEL法检测的结果显示此时出现较多的细胞凋亡现象。当采用NOS抑制剂L-NAME进行实验时，发现其可降低制动后关节滑液中的NO的含量，而且使软骨细胞凋亡现象显著减轻，TUNEL法证实软骨细胞发生凋亡的数量大为减少。这些检测结果说明，制动后软骨细胞凋亡可能与NO水平升高密切相关，NO是引起软骨凋亡的重要介质。本研究从整体水平上证实了Francisco的实验结果。
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随着骨骼生长的结束，软骨细胞不再分裂，而且始终在不断地退变，最终以凋亡方式而死亡[9]。正常情况下，关节软骨细胞的退变和死亡与其增生处在一动态平衡中，从而维持关节软骨的正常功能。随着年龄的增长以及在其他各种病理因素的作用下，如关节软骨缺血，滑液中低氧分压和pH值降低，软骨细胞一旦发生细胞损伤，即释放一些介质，如产生高水平的NO后，能很快扩散，一方面诱导受损的软骨细胞发生凋亡；另一方面还可通过抑制软骨细胞的增生，减缓组织修复的过程，从而导致平衡的破坏，其结果是关节软骨组织细胞大量减少，引起关节软骨萎缩变薄。这可能是骨性关节炎发生的重要机制。随着对NO与软骨细胞凋亡方面的不断深入研究，将可能为OA这一危害众多人健康的疾病提供更新的更有价值的治疗方案。
图1 正常对照组免疫荧光显示未见被标记的细胞 TUNEL×200
图2 制动6周时，见有全层TUNEL标记阳性细胞，表现为细胞核被荧光标记 TUNEL×200
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图3 L-NAME+固定6周后，可见TUNEL阳性细胞，散在性份布，主要位于表中层 TUNEL×200
参 考 文 献
1.Farrell AJ,Blade DR,Ralmer RM,et al.Increased concentration of nitrite synovial fluid and serum samples suggest increased nitric oxide synthesis in rheumatic disease.Ann Rheum Dis,1992,51:1219-1222.
2.Mccarthey-Francis N,Allen JB,Mizel DE,et al.Suppression of arth-ritis by an inhibitor of nitric oxide synthase.J Exp Med,1993,178:749-754.
, 百拇医药
3.George AC,Murrell MB,Martin M,et al.Nitric oxide:an important articular free radical.J Bone Joint Surg,1996,78:265-273.
4.Francisco JB,Robert LO,Herbert S,et al.Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide.Am J Pathol,1995,146:75-85.
5.邹先兴，王桂生.兔膝关节制动引起关节软骨退变的实验研究.中华外科杂志，1989，3：175-177.
6.Guarner C,Soriano G,Tomas A,et al.Increased serum nitrite and nitrate levels in patients with cirrhosis:relationship to endotoxemia.Hepatology,1993,18:1138-1141.
, 百拇医药
7.Wood KA.Apoptosis and free radicals.Ann NY Acad Sci,1994,17:400-407.
8.彭丹，孙材江，周江南.实验性骨关节病中软骨细胞的凋亡.湖南医科大学学报，1999，24：415-417.
9.Helmtrud IR,Jekaterina E,Thomas A.Osteogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes involves asymmetric cell divisions and apoptosis.J Cell Biol,1995,131:483-494.
(收稿日期：1999-06-25), 百拇医药
单位：彭丹(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院骨科)；孙材江(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院骨科)；周江南(湖南医科大学附属湘雅医院骨科)
关键词：一氧化氮；骨关节炎；软骨；细胞凋亡
中华风湿病学杂志000412 【摘 要】 目的 观察一氧化氮(NO)在实验性骨关节炎(OA)关节滑液中的动态变化，并探讨NO在实验性OA软骨细胞凋亡中的作用。方法 用原位末端标记法以及镀铜镉还原法对实验性OA软骨细胞凋亡及关节滑液中的NO含量进行检测。结果 实验性OA中NO水平显著高于正常对照组，且随制动时间延长，NO水平逐渐升高，6周达高峰。此时也出现较多软骨细胞凋亡现象，应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME后，关节液中NO含量降低，软骨细胞凋亡现象减轻。结论 NO是引起实验性OA中软骨细胞凋亡的重要介质之一。
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The regulation effect of NO in the apoptosis of chondrocytes in experimental OA
PENG Dan*,SUN Caijiang,ZHOU Jiangnan.
Department of Orthopaedics,Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410011,China
【Abstract】 Objective To observe the effects of dynamic change of nitric oxide (NO) in synovial fluid (SF) in experimental OA and investigate NO and nitric oxide synthetase (NOS) inhibitor L-NAME participates in apoptosis of chondrocytes in experimental OA.Methods Apoptosis of chondrocytes was determined by TUNEL and the levels of NO in SF by reduction.Results The level of NO in experimental OA was higher than that of normal control group.As time of immobilization was prolonged,the levels of NO were gradually increasing,and got the hightest piont at week 6.After L-NAME was applied introvenously,the NO centents and the TUNEL-positive chondrocytes were decreased.Conclusion The NO produced by chondrytes is involved in the process of cartilage lesions.It is a major trigger for apoptosis of chondrocytes in experimental OA.
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【Key words】 Nitric oxide; Osteroarthritis; Cartilage; Apoptosis
一氧化氮(NO)是一种广泛存在于生物体内的小分子生理介质，也是一种自由基，由L-精氨酸经一氧化氮合酶(NOS)催化生成。近年来，不仅从生物学及病理学等方面对NO进行较为广泛的研究，而且随着对一氧化氮认识的逐步加深，NO在骨关节炎(OA)发病中的作用日益受到重视，Farrell等[1]发现类风湿关节炎及骨关节炎患者血清及关节液中NO含量增高，用NOS的抑制剂L-NAME可抑制免疫佐剂性关节炎动物模型的骨关节炎发作程度[2]。George等[3]利用软骨组织细胞培养技术发现IL-1、TNF、LPS等均可刺激软骨细胞产生大量NO。高含量的NO能使软骨产生降解作用，Francisco等[4]首次发现NO可引起体外培养的软骨细胞发生凋亡，但作者未作整体水平研究。近来研究表明，骨性关节炎中软骨细胞存在凋亡现象，其机制是否与NO有关，为此我们采用兔膝关节制动引起的实验性OA模型[5]，检测关节滑液中NO含量的动态变化，并观察NOS抑制剂L-NAME对软骨细胞凋亡的影响，以探讨NO在实验性OA中对软骨细胞凋亡引起的作用，为阐明骨性关节炎发生的机制及其防治提供新的实验依据。
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1 材料与方法
1.1 分组及模型制作：新西兰健康白兔28只，雌雄不限，平均体重2.5 kg，右后下肢膝关节伸直位石膏管型固定。实验动物分两组：Ⅰ石膏固定组；Ⅱ L-NAME+石膏固定组。石膏固定后，由兔耳缘静脉中注射L-NAME 15 mg/kg(溶于1 ml生理盐水)，每周注射2次。按观察时间分为2、4、6周三个时期，并分别按期进行观察，每期4只。4只用于正常对照组。
1.2 膝关节滑液的抽取：施行膝关节穿刺证实刺入关节腔后，注入0.9%生理盐水1 ml，反复回抽并注入3次后，再尽量将液体抽出并注入试管内，封存于-70 ℃低温环境内备测。
1.3 NO-2测定：鉴于NO的性质极不稳定，在体内、体外均能很快生成亚硝酸盐和硝酸盐，因此测定标本中的亚硝酸盐和硝酸盐的浓度可作为衡量NO合成的指标。本实验对亚硝酸盐的测定参照文献[6]报告，采用镀铜镉还原法，抽取标本0.3 ml，加重蒸水0.6 ml，5%硫酸锌0.3 ml，0.3 mol NaOH 0.3 ml，混匀置4 ℃冰箱内20 min，10 000 r/min，离心5 min，取上清液1 ml加入镀铜镉反应80 min，收集上液1 ml与不同亚硝酸钠标准品分别加1%磺胺(5%磷酸配制)，0.1% N-1萘乙二胺盐酸盐水溶液各0.5 ml混合，置室温10 min，用分光光度计测A546值。根据不同浓度标准品A值绘制标准曲线。按照样品A值在标准曲线上查出样品含量。
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1.4 TUNEL末端荧光标记法：以Boehringer Mann公司细胞凋亡检测试剂盒，对软骨细胞DNA断端进行标记。按说明进行操作：软骨组织行冰冻切片后，用4%多聚甲醛溶液在室温下固定20 min，然后加入细胞通透液(0.1% TritonX-100+0.1%枸橼酸钠)，0.01 mol/L PBS洗2次，擦片后加入50 μl TUNEL反应混合液，在37 ℃温箱内加盖孵育60 min，PBS洗3次后，置于荧光显微镜下观察，对有荧光显色者可确认为具有细胞凋亡特征。
2 结 果
2.1 实验性OA中膝关节滑液亚硝酸盐的动态变化：实验组中亚硝酸盐水平(
±s)在2、4、6周时分别为(20.3±2.6)、(41.4±1.9)、(86.6±4.6) μmol/L，各试验组中NO水平明显高于正常对照组(6.7±1.7) μmol/L(P<0.01)，制动后2周开始明显升高，6周达高峰。, 百拇医药
2.2 L-NAME对膝关节滑液中亚硝酸盐水平的影响：实验动物耳缘静脉注射L-NAME后，可降低其关节液中亚硝酸盐的水平，在2～6周时，分别为(11.5±1.8)、(27.3±4.1)、(60.3±3.7) μmol/L，与单纯固定组比较差异有显著性(P<0.01)，但仍高于正常对照组。
2.3 TUNEL荧光末端标记：显微荧光镜下观察制动6周后的全层软骨细胞核时，可见有荧光标记的凋亡细胞(图1)；而用L-NAME制动6周时，发现有荧光标记的凋亡细胞较单纯制动6周时明显减少，而且主要分布于表中层，并呈散在性分布(图2)。在正常对照组中则未见荧光标记的软骨细胞(图3)。
3 讨 论
目前对于细胞凋亡发生的机制尚不清楚。近期的研究结果表明，自由基不仅存在于细胞凋亡早期，而且由其造成的损害也可出现于生命后期的退行性疾病中。细胞凋亡细胞中的反应性氧属(ROS)增加，同时其清除反应性氧属的能力相应地下降。大多数细胞凋亡障碍的细胞表现为反应性氧属分子大量减少。若调节细胞内ROS的含量改变，则其死亡率亦随之改变。此种变化提示ROS参与并可调节细胞凋亡的形成过程[7]。NOS作为内源性ROS产生系统之一，在软骨细胞损害的过程中有高表达，且可产生高含量活性很强的自由基NO[3]。有人发现NO释放复合物作为一个NO的供体可以通过一定时间和浓度依赖的方式诱导软骨细胞发生凋亡。在Francisco等的体外试验中发现NO在软骨细胞凋亡中起重要作用，其他一系列细胞调控因子如IL-1、TNF、LPS、氧自由基等均不能诱导软骨细胞发生凋亡现象。由此可以推论NO是引起软骨细胞凋亡的主要介质。NO可能通过以下四个方面的机制使细胞发生凋亡：①抑制三羧酸循环中乌头酸酶的活性，使细胞氧化代谢和呼吸受到干扰，糖原分解，导致糖原衰竭；②直接与某些含亚铁原卟啉的铁离子结合，形成亚硝酰络合物，造成线粒体损害；③引起核酸亚硝酰化，破坏DNA双螺旋结构；④影响细胞内的其他靶分子，调节第二信使，诱导非依赖于基因组DNA损伤的细胞凋亡。业已证实，实验动物关节制动后的病理变化类似于临床上所见的骨性关节炎，因此，可利用这种动物模型对骨性关节炎进行研究[5]。研究表明制动后关节软骨细胞存在凋亡现象[8]。为了查明其是否与NO有关，我们检测了关节液中NO的浓度。结果发现，在实验性OA中NO水平显著高于正常对照组(P<0.01)，且随制动时间延长NO水平逐渐升高，6周达高峰。TUNEL法检测的结果显示此时出现较多的细胞凋亡现象。当采用NOS抑制剂L-NAME进行实验时，发现其可降低制动后关节滑液中的NO的含量，而且使软骨细胞凋亡现象显著减轻，TUNEL法证实软骨细胞发生凋亡的数量大为减少。这些检测结果说明，制动后软骨细胞凋亡可能与NO水平升高密切相关，NO是引起软骨凋亡的重要介质。本研究从整体水平上证实了Francisco的实验结果。
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随着骨骼生长的结束，软骨细胞不再分裂，而且始终在不断地退变，最终以凋亡方式而死亡[9]。正常情况下，关节软骨细胞的退变和死亡与其增生处在一动态平衡中，从而维持关节软骨的正常功能。随着年龄的增长以及在其他各种病理因素的作用下，如关节软骨缺血，滑液中低氧分压和pH值降低，软骨细胞一旦发生细胞损伤，即释放一些介质，如产生高水平的NO后，能很快扩散，一方面诱导受损的软骨细胞发生凋亡；另一方面还可通过抑制软骨细胞的增生，减缓组织修复的过程，从而导致平衡的破坏，其结果是关节软骨组织细胞大量减少，引起关节软骨萎缩变薄。这可能是骨性关节炎发生的重要机制。随着对NO与软骨细胞凋亡方面的不断深入研究，将可能为OA这一危害众多人健康的疾病提供更新的更有价值的治疗方案。
图1 正常对照组免疫荧光显示未见被标记的细胞 TUNEL×200
图2 制动6周时，见有全层TUNEL标记阳性细胞，表现为细胞核被荧光标记 TUNEL×200
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图3 L-NAME+固定6周后，可见TUNEL阳性细胞，散在性份布，主要位于表中层 TUNEL×200
参 考 文 献
1.Farrell AJ,Blade DR,Ralmer RM,et al.Increased concentration of nitrite synovial fluid and serum samples suggest increased nitric oxide synthesis in rheumatic disease.Ann Rheum Dis,1992,51:1219-1222.
2.Mccarthey-Francis N,Allen JB,Mizel DE,et al.Suppression of arth-ritis by an inhibitor of nitric oxide synthase.J Exp Med,1993,178:749-754.
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3.George AC,Murrell MB,Martin M,et al.Nitric oxide:an important articular free radical.J Bone Joint Surg,1996,78:265-273.
4.Francisco JB,Robert LO,Herbert S,et al.Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide.Am J Pathol,1995,146:75-85.
5.邹先兴，王桂生.兔膝关节制动引起关节软骨退变的实验研究.中华外科杂志，1989，3：175-177.
6.Guarner C,Soriano G,Tomas A,et al.Increased serum nitrite and nitrate levels in patients with cirrhosis:relationship to endotoxemia.Hepatology,1993,18:1138-1141.
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7.Wood KA.Apoptosis and free radicals.Ann NY Acad Sci,1994,17:400-407.
8.彭丹，孙材江，周江南.实验性骨关节病中软骨细胞的凋亡.湖南医科大学学报，1999，24：415-417.
9.Helmtrud IR,Jekaterina E,Thomas A.Osteogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes involves asymmetric cell divisions and apoptosis.J Cell Biol,1995,131:483-494.
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